本发明涉及微生物应用
技术领域：
，具体涉及一株水生木霉及其生产纤维素酶的方法。
背景技术：
纤维素(cellulose)是自然界分布最广、含量最丰富的碳水化合物和可再生资源，它的降解是自然界碳素循环的中心环节。对其进行水解可同时得到含有葡萄糖和木糖等单糖的混合糖，是潜在的重要生物转化原料。地球上，植物体每年通过光合作用生成的有机资源高达1500亿吨，其中三分之一以上为纤维素资源。我国的纤维资源也十分丰富，每年产量为11.45亿吨，其中，仅农作物秸秆、皮壳一项，每年就可多达7亿吨，玉米秸秆占35％，小麦秸秆占21％，稻草占19％，大麦秸秆占10％，高粱秸秆占5％，燕麦秸秆占3％，黑麦秸秆占2％。纤维素的降解有两条途径，即化学法和生物酶法，但化学法特异性差、纯度低、污染环境，而用生物酶法可克服这些缺点。目前常用的生物酶是纤维素酶。纤维素酶一方面可将纤维素水解成葡萄糖等有效成分，另一方面它可以通过提高植物细胞壁的通透性而提高细胞内含物蛋白质、脂肪、淀粉的提取率，所以纤维素酶可应用于以植物为原料的一切工业中。利用微生物发酵生产的纤维素酶可将纤维素类物质转化为人类急需的食物、能源和化工原料，对于解决人类社会食物短缺、环境污染和能源危机具有重大的现实意义。纤维素酶(cellulase)是指能够降解纤维素生成葡萄糖的一组酶的总称，它不是单一酶成分，而是一种复杂酶系，由外切葡聚糖酶，内切葡聚糖酶也称羧甲基纤维素酶和β-葡萄糖苷酶组成。纤维素酶酶解纤维素生成葡萄糖的详细过程目前尚不清楚，但普遍认为纤维素的降解过程是三种酶组分的协同作用所致，三种酶协同作用可将木质纤维素类物质转化为可发酵性糖。纤维素酶的来源非常广泛，细菌、真菌、放线菌、植物及一些动物体内等都能产生纤维素酶，能水解天然纤维素的纤维素酶都是复杂的多酶体系。根据功能的不同，分为三大类：葡聚糖内切酶(endo-1,4-β-d,glucanase,e.c3.2.1.4，来自真菌简称eg，来自细菌简称len)、葡萄糖外切酶(exo-1,4-β-d,glucanase,e.c3.2.1.9.1，)和葡萄糖苷酶(β-1,4-glucanase,e.c3.2.1.21，简称bg)。纤维素酶被誉为是打开生物质资源宝库的钥匙。近年来，随着对纤维素酶研究的深入，越来越多的性质各异的纤维素酶被发现，使得纤维素酶的应用日益广泛。但在纤维素酶的生产中存在着纤维底物的高度复杂、纤维活力较低、生产周期长的缺点，且其生产费用占酶糖化纤维材料总成本的25％～50％，制约了纤维素酶的广泛应用。因此，进一步寻找和研究纤维素酶高产菌株，提高酶产量对人类生存环境的改善和可持续发展有着举足轻重的影响。技术实现要素：本发明的目的在于提供一株水生木霉及其生产纤维素酶的方法。本发明提供的水生木霉能产完整纤维素酶系，同等条件下其液体发酵培养产酶高于其它木霉菌株，能提高现今微生物产生纤维素酶的酶产率。本发明提供了一株水生木霉trichodermaaquatilis，保藏编号为cgmccno.14143。本发明还提供了上述技术方案所述水生木霉生产纤维素酶的方法，包括以下步骤：将水生木霉接种于液体发酵培养基中，在温度为26～31℃、溶氧为65～85％的条件下发酵培养96～144小时，得到纤维素酶。优选的是，所述水生木霉接种的体积分数为2～5％。优选的是，所述液体发酵培养基以不加琼脂的pda培养基为基准，还包括以下质量百分含量的组分：0.5％的纤维素钠、1.2％的麦芽糖、0.8％的硫酸镁、0.5％的磷酸氢二钾和0.1％的氯化锂。优选的是，所述培养在0～40h期间，培养温度为28～31℃，溶氧为75～85％；在40h后，培养温度为26～30℃，溶氧为65～75％。优选的是，所述发酵培养包括振荡培养。优选的是，所述振荡培养的转速为145～190rpm/min。优选的是，所述纤维素酶包括胞外酶，所述胞外酶包括葡聚糖内切酶、葡萄糖外切酶和葡萄糖苷酶。本发明提供了一株水生木霉，所述水生木霉来源于自然水体环境，其液体培养物能产生酶系较为完整的纤维素酶，包括葡聚糖内切酶、葡萄糖外切酶和葡萄糖苷酶，酶活分别高达2147iu/ml、1035iu/ml、710iu/ml，滤纸酶酶活为972iu/ml。本发明提供的能产完整纤维素酶系的水生木霉，在同等条件下其液体发酵培养，产酶高于其它木霉菌株，能提高现今微生物产生纤维素酶的酶产率。附图说明图1为本发明实施例1提供的yz木霉菌株在genbank上进行blast基因比对结果图；图2为本发明实施例1提供的为yz木霉菌株nj系统树。具体实施方式本发明提供了一株水生木霉trichodermaaquatilis，保藏编号为cgmccno.14143。本发明的水生木霉trichodermaaquatilis命名为yz，该菌株于2017年7月24日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。本发明所述水生木霉trichodermaaquatilis的形态特征为：cmd培养基上，分生孢子区呈大小不一的突起，气生菌丝不茂盛，pda培养基上气生菌丝茂盛，产孢区遍布整个平板，墨绿到灰绿，产生黄色色素，厚垣孢子顶生，球形。分生孢子梗粗壮，偶尔有一级分枝，极少二次分枝，顶端可育，瓶梗和侧枝单生或互生在主轴上，偶尔对生。瓶梗突椎状，顶端向上弯曲，瓶梗和侧枝与主轴呈直角，3.1-4.2×5.2-11.5μm。分生孢子椭圆到卵形，壁光滑，2.4-3.3×3.3-4.8μm。与其它的木霉相比：拟里氏木霉(t.parareesei)瓶梗(2.5-3.8×4.5-11μm)更宽，更长，孢子(2.5-3.5×3.3-6.2μm)更窄，更短。水毛茛木霉(trichodermabatrachium)瓶梗：(-2.5)3.1-4.2×5.2-11.5μm。本发明提供的水生木霉trichodermaaquatilis分离自自然水体环境，是首次发现的水生木霉新种，能产生纤维素酶，与其它的产生纤维素酶的菌株不同，属于分类学上的新种，在形态上有差异。其液体培养物能产生酶系较为完整的纤维素酶，包括葡聚糖内切酶、葡萄糖外切酶和葡萄糖苷酶，酶活分别为2147iu/ml、1035iu/ml、710iu/ml，滤纸酶酶活为972iu/ml。且同等条件下其液体发酵培养，产酶高于其它木霉菌株；培养条件易于实现，能提高现今微生物产生纤维素酶的酶产率。通过分子鉴定，yz菌株是新的水生木霉属菌株。本发明对所述分子鉴定的方法和过程没有特殊的限定，采用常规新菌种鉴定方法即可。在本发明中，所述分子鉴定过程优选如下：1.菌丝的培养、收集：将pda固体培养基上生长的yz菌株菌丝接入pdb培养基中，28℃培养3-5d(视菌丝生长情况)离心收集菌体，分别称重后于-20℃保存；2.ctab法提取菌株dna：1)取1克菌丝放入研钵，加入液氮迅速研磨成粉末，转入7ml的离心管，加65℃预热的抽提液2％(m/v)ctab，100mmol/ltris-hclph8.0，20mmol/edtaph8.0，1.4mo1/lnacl]2.5ml中，加疏基乙醇50μl，上下震荡，使蛋白质变性沉淀；2)65℃水浴1h，每隔10min振荡1次，加入2.5ml的氯仿/异戊醇(24/1)混匀，除去蛋白质；3)8000rpm，4℃离心10min，取上清到7ml管；4)加1/5体积65℃预热的ctab/nacl混匀，加入2.5ml的氯仿:异戊醇(24:1)混匀；5)10000rpm,4℃离心10min，取上清，加入2.5ml的ctab沉淀液，颠倒混匀。65℃水浴1.5h至沉淀可见；6)12000rpm，4℃离心10min后，小心去除上清液；用0.5ml无菌水溶解沉淀10min；7)加入0.25ml饱和酚和0.25ml氯仿:异戊醇(24:1)，混匀；8)12000r/min，4℃离心10min，取上清，加入2倍体积预冷的无水乙醇，混匀，-20℃冰箱放置30min:9)12000r/min，4℃离心10min；弃上清，70％乙醇洗涤沉淀2次，自然风干，再用100μl无菌水溶解，加入0.5μlrnase，-20℃保存备用。3.itspcr扩增its1-5.8srdna-its2片段用通用引物its4和its5(whiteetal.，1990)扩增。其中用18srdna3'端引物作上游引物its5:5'-ggaaggtaaaagtcaagg-3'(seqidno.1)，用28srdna5'端引物作下游引物its4:5'-tcctccgcttattgatatgc-3'(seqidno.2)。反应体系为100μ1，含1×pcr反应缓冲液、1.5mmol/lmgcl2,0.2mmol/ldntps,0.5μmol/l的1对引物、100ng模板dna和5utaqdna聚合酶。扩增反应在pcr仪上进行，反应参数为:94℃变性3min然后为30轮循环，每个循环在94℃变性30s,55℃退火30s,72℃延伸30s,30轮循环后，在72℃延伸7min，最后在4℃停止反应。pcr产物用qiaquickpcr纯化试剂盒进行纯化。吸取pcr反应液置于1.5mleppendorf管中；加5倍体积的pb缓冲液，涡旋混匀；将上述混合液加入至qiaquick微型柱中，13000r/min离心30-60s；倒掉收集管中的废液，将微型柱重新放入收集管中；加0.75mlpe缓冲液至微型柱中，13000r/min离心30-60s；倒掉收集管中的废液，将微型柱重新放入收集管中，14000r/min离心1min；将微型柱放在一个新的eppendorf管中，加30μleb缓冲液或水，静止1min后13000r/min离心1min。纯化后的pcr产物，20℃保存备用。扩增产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统仪上观察并记录结果。4.pcr产物琼脂糖凝胶电泳检测、序列测定及系统发育树建立取琼脂糖0.24g，5％的tbe缓冲液30ml，在微波炉中加热，使琼脂糖充分溶解，倒胶，制成0.8％琼脂糖凝胶。pcr产物经0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，溟化乙锭(eb)溶液(10mg/ml)染色后的dna在紫外灯下显示清晰的条带，在紫外灯下检测出its序列片段大小为1000bp-700bp左右。未纯化pcr产物交测序公司测序。测得的its序列用软件dnaman将测得的反向序列编辑成反向互补的正向序列，再用软件mafft进行多重序列比对校正，最后运用软件mega5构建系统发育树。按照系统发育树中分支关系较近的菌种在genbank数据库中进行blast分析，将菌株的its序列和genbank中的相似序列进行比对，并下载相似性较高的菌株序列和外类群序列，将该菌株测得的的its序列和genbank中下载的相似性序列集成一组数据，再次用软件mega5.1将所有its序列clastalx1.83version进行多重序列比对校正，并用mega5建立系统发育树。在本发明中，所述水生木霉trichodermaaquatilisyz的its序列如seqidno.3所示。本发明还提供了上述技术方案所述水生木霉生产纤维素酶的方法，包括以下步骤：将水生木霉接种于液体发酵培养基中，在温度为26～31℃、溶氧为65～85％的条件下培养96～144小时，得到纤维素酶。在本发明中，所述水生木霉接种的体积分数为2～5％，更优选为4％。在本发明中，所述液体发酵培养基以不加琼脂的pda培养基为基准，还包括以下质量百分含量的组分：0.5％的纤维素钠、1.2％的麦芽糖、0.8％的硫酸镁、0.5％的磷酸氢二钾和0.1％的氯化锂。以上成分的加入能提高本发明菌株纤维素酶的产量和丰富纤维酶的种类。本发明对所述纤维素钠、麦芽糖、硫酸镁、磷酸氢二钾和氯化锂的来源没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的纤维素钠、麦芽糖、硫酸镁、磷酸氢二钾和氯化锂的常规市售产品即可。在本发明中，所述培养优选分阶段对条件进行限定，所述培养优选在0～40h期间，培养温度为28～31℃，溶氧为75～85％；在40h后，培养温度为26～30℃，溶氧为65～75％。具体地，本发明更优选在0～40h期间，培养温度为30℃，溶氧为80％；在40h后，培养温度为28℃，溶氧为70％。在本发明中，所述发酵培养包括振荡培养。在本发明中，所述振荡培养的转速为145～190rpm/min。本发明通过振荡调节发酵过程中的溶氧，当所述发酵培养为振荡培养时，在0～40h期间，转速优选为167～190rpm/min，更优选为178rpm/min；在40h后，转速优选为145～167rpm/min，更优选为156rpm/min。在本发明中，所述纤维素酶包括胞外酶，所述胞外酶包括葡聚糖内切酶、葡萄糖外切酶和葡萄糖苷酶。本发明所述水生木霉所产纤维素酶酶系完整，酶活力高，葡聚糖内切酶、葡萄糖外切酶和葡萄糖苷酶的酶活分别高达2147iu/ml、1035iu/ml和710iu/ml，滤纸酶酶活为972iu/ml。在本发明中，所述纤维素酶酶活的测定方法：按常规纤维素酶dns法进行。具体地，所述测定方法如下：1、葡萄糖标准曲线的测定：1)将一定量无水葡萄糖放入108℃烘箱中2h，除去其全部水分。2)取0.5g无水葡萄糖加水溶解到50ml容量瓶中，加水定溶，配成10mg/ml的葡萄糖储液；3)向25ml的容量瓶中加入不同体积的葡萄糖储液；4)取0.5ml各个浓度的葡萄糖标准液，再加入3mldns试剂混匀，沸水浴10min后终止反应，定容至25ml。在540nm处测定吸光度，以空白作为对照调零值。每管取三个平行样。5)所得的吸光度值平行样取平均值，对应其葡萄糖标准液的浓度，以吸光度为x值，葡萄糖浓度为y值作图，做线性拟合，得葡萄糖标准曲线。2、酶活的测定：1)滤纸酶活力测定：将1cm×6cm卷曲滤纸置于1ml，0.2mol/lph8.0磷酸缓冲液中，加入1ml粗酶液，50℃恒温1h后，取反应液1.2ml，加2.5mldns试剂，置沸水浴中5min，冷却至室温后定容至5.0l，在540nm处测还原糖生成量：以煮沸灭活的粗酶液为空白对照组。2)cmc酶活力测定：取粗酶液0.2ml，1％cmc-naph8.0磷酸缓冲液1ml混匀后于50℃恒温30min，加入2.5mldns试剂终止反应，置沸水浴中5min，冷却至室温后定容至5.0ml，540nm测还原糖的生成量，以煮沸灭活的粗酶液作为空白对照组。3)β-葡萄糖苷酶活力：在反应体系中加入0.5ml粗酶液、1.5ml0.2mol/lph8.0磷酸缓冲液配制的0.5％水杨酸溶液，50℃恒温30min后，取1.2ml反应液加入2.5mldns试剂终比反应，沸水浴5min，冷却后定容至5.0ml，540nm测还原糖。3、酶活定义方法将1ml酶液在步骤2(酶活的测定)各反应体系中，每分钟产生1μg葡萄糖量定义为一个酶活力单位，以iu/ml表示。下面结合具体实施例对本发明所述的一株水生木霉及其生产纤维素酶的方法做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。实施例1菌株的获得：本发明的菌株按微生物分离的常规普通方法进行分离、纯化培养获得，采用的分离用培养基为cma培养基，经真菌its鉴定为trichodermaaquatilis，定名为yz；图1为yz木霉菌株在genbank上进行blast基因比对结果图，图2为yz木霉菌株nj系统树，从图中可以看出yz菌株属木霉属菌株，yz木霉菌株与其它菌株存在明显的差异。形态：cmd培养基上，分生孢子区呈大小不一的突起，气生菌丝不茂盛，pda培养基上气生菌丝茂盛，产孢区遍布整个平板，墨绿到灰绿，产生黄色色素，厚垣孢子顶生，球形。分生孢子梗粗壮，偶尔有一级分枝，极少二次分枝，顶端可育，瓶梗和侧枝单生或互生在主轴上，偶尔对生。瓶梗突椎状，顶端向上弯曲，瓶梗和侧枝与主轴呈直角，3.1-4.2×5.2-11.5μm。分生孢子椭圆到卵形，壁光滑，2.4-3.3×3.3-4.8μm。与其它的木霉相比：拟里氏木霉(t.parareesei)瓶梗(2.5-3.8×4.5-11μm)更宽，更长，孢子(2.5-3.5×3.3-6.2μm)更窄，更短。水毛茛木霉(trichodermabatrachium)瓶梗：(-2.5)3.1-4.2×5.2-11.5μm。yz菌株的培养：种子培养基：常规液体pda培养基。液体发酵培养基：无琼脂的pda培养基以及包含重量百分比的以下成分：0.5％纤维素钠、1.2％麦芽糖、0.8％硫酸镁、0.5％磷酸氢二钾、0.1％氯化锂。首先，无菌收集pda平板上培养的yz菌株孢子，将孢子接种到预先灭菌并含有玻璃珠的种子培养基中，28℃145rpm/min培养2～3天，视培养基中长满细小的菌丝球为止备用，此为水生木霉种子液。然后，将水生木霉种子液无菌接入预先灭菌的液体发酵培养基中，接入量为2～5％。26～31℃培养96～144小时，溶氧为65～85％(摇瓶按145～190rpm/min计算)：其中，0～40小时，培养温度28～31℃，溶氧为75～85％(转速为167～190rpm/min)；40小时后，培养温度26～30℃，溶氧为65～75％(转速为145～167rpm/min)。测定培养液中的纤维素酶含量，当纤维素酶含量最大时可终止培养。实施例21.用pda平板培养yz菌株，待平板上长出孢子时，取出备用；2.在无菌条件下收集平板上的孢子，将孢子接入含有玻璃珠的种子培养基中，28℃145rpm/min培养；3.培养2天，视培养基中长满细小的菌丝球为止备用，此为水生木霉种子液；4.将长好的水生木霉种子液无菌接入预先灭菌的液体发酵培养基中，接入量按液体发酵培养基装液量的4％计算，0～40小时，培养温度30℃，溶氧为80％(转速为178rpm/min)；40小时后，培养温度28℃，溶氧为70％(转速为156rpm/min)进行培养；5.用常规纤维素酶dns测定方法测定发酵液中的酶活，发酵液滤纸酶酶活超过900iu/ml，停止发酵。实施例31.用pda平板培养yz菌株，待平板上长出孢子时，取出备用；2.在无菌条件下收集平板上的孢子，将孢子接入含有玻璃珠的种子培养基中，28℃145rpm/min培养；3.培养2天，视培养基中长满细小的菌丝球为止备用，此为水生木霉种子液；4.将长好的水生木霉种子液无菌接入预先灭菌的液体发酵培养基中，接入量按液体发酵培养基装液量的2％计算，0-40小时，培养温度28℃，溶氧为75％(转速为167rpm/min)；40小时后，培养温度26℃，溶氧为65％(转速为145rpm/min)进行培养；5.用常规纤维素酶dns测定方法测定发酵液中酶活，发酵液滤纸酶酶活超过900iu/ml，停止发酵。实施例41.用pda平板培养yz菌株，待平板上长出孢子时，取出备用；2.在无菌条件下收集平板上的孢子，将孢子接入含有玻璃珠的种子培养基中，28℃145rpm/min培养；3.培养2天，视培养基中长满细小的菌丝球为止备用，此为水生木霉种子液；4.将长好的水生木霉种子液无菌接入预先灭菌的液体发酵培养基中，接入量按液体发酵培养基装液量的3％计算，0-40小时，培养温度29℃，溶氧为80％(转速为178rpm/min)；40小时后，培养温度27℃，溶氧为70％(转速为156rpm/min)进行培养；5.用常规纤维素酶dns测定方法测定发酵液中酶活，发酵液滤纸酶酶活超过900iu/ml，停止发酵。实施例51.用pda平板培养yz菌株，待平板上长出孢子时，取出备用；2.在无菌条件下收集平板上的孢子，将孢子接入含有玻璃珠的种子培养基中，28℃145rpm/min培养；3.培养2天，视培养基中长满细小的菌丝球为止备用，此为水生木霉种子液；4.将长好的水生木霉种子液无菌接入预先灭菌的液体发酵培养基中，接入量按液体发酵培养基装液量的5％计算，0-40小时，培养温度31℃，溶氧为85％(摇瓶按190rpm/min计算)；40小时后，培养温度30℃，溶氧为75％(摇瓶按167rpm/min计算)进行培养；5.用常规纤维素酶dns测定方法测定发酵液中酶活，发酵液滤纸酶酶活超过900iu/ml，停止发酵。实施例61.用pda平板培养yz菌株，待平板上长出孢子时，取出备用；2.在无菌条件下收集平板上的孢子，将孢子接入含有玻璃珠的种子培养基中，28℃145rpm/min培养；3.培养2天，视培养基中长满细小的菌丝球为止备用，此为水生木霉种子液；4.将长好的水生木霉种子液无菌接入预先灭菌的液体发酵培养基中，接入量按液体发酵培养基装液量的5％计算，0-40小时，培养温度28℃，溶氧为85％(摇瓶按190rpm/min计算)；40小时后，培养温度27℃，溶氧为75％(摇瓶按167rpm/min计算)进行培养；5.用常规纤维素酶dns测定方法测定发酵液中酶活，发酵液滤纸酶酶活超过900iu/ml，停止发酵。实施例7与其它产纤维素酶的木霉菌株的发酵产酶对比选取拟里氏木霉(trichodermaparareesei)、水毛茛木霉(trichodermabatrachium)、里氏木霉(trichodermareesei)及本申请菌株yz菌株，按实施例2的操作进行，最终各菌株产酶情况如表1所示：表1各菌株产酶情况种类拟里氏木霉水毛茛木霉里氏木霉水生木霉-yz葡聚糖内切酶(iu/ml)347105.314162147葡萄糖外切酶(iu/ml)--8711035葡萄糖苷酶(iu/ml)71.39-513710滤纸酶(iu/ml)21.0810.71319972从实验数据可以看出，yz菌株产生的纤维素酶系较其它菌株全面且酶活力高于其它木霉菌株。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。序列表<110>云南大学<120>一株水生木霉及其生产纤维素酶的方法<160>3<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>18<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1ggaaggtaaaagtcaagg18<210>2<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2tcctccgcttattgatatgc20<210>3<211>638<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3gtaaaagtcgtaacaaggtctccgttggtgaaccagcggagggatcattaccgagtttac60aactcccaaaccccaatgtgaacgttaccaatctgttgcctcggcgggattctctgcccc120gggcgcgtcgcagccccggatcccatggcgcccgccggaggaccaactcaaactcttttt180ttctctccgtcgcggcttccgtcgcggctctgttttacctttgctctgagcctttctcgg240cgaccctagcgggcgtctcgaaaatgaatcaaaactttcaacaacggatctcttggttct300ggcatcgatgaagaacgcagcgaaatgcgataagtaatgtgaattgcagaattcagtgaa360tcatcgaatctttgaacgcacattgcgcccgccagtattctggcgggcatgcctgtccga420gcgtcatttcaaccctcgaacccctccggggggtcggcgttggggatcggcccctcaccg480ggccgcccccgaaatccagtggcggtctcgccgcagcctctcctgcgcagtagtttgcac540actcgcaccgggagcgcggcgcggccacagccgtaaaacaccccaaactctgaaatgttg600acctcggatcaggtaggaatacccgctgaacttaagca638当前第1页12