一种热带假丝酵母培养物及其制备方法和应用与流程

本发明涉及微生物应用
技术领域：
，具体涉及一种能够抑制炭疽菌的热带假丝酵母培养物及其制备方法和应用。
背景技术：
植物病害是农业生产的大敌，据联合国粮农组织(fao)统计，谷物生产因病害损失10％，棉花生产因病害损失12％，全世界因有害生物所造成的经济损失高达1200亿美元，相当于中国农业总产值的一半。植物病害的发生不仅直接影响到我国农民的收入，还会影响到其他相关产业的发展，特别是农产品加工业。1880年，法国波尔多地区葡萄种植业因遭受霜霉病的危害而导致酿酒业濒临破产停业。最为严重的是不利于农业及其相关产业的长远和可持续发展。目前，防治植物病害的主要手段为化学农药。由于采用化学农药进行植物病害防治见效快，杀菌谱广，成本低，使用简便等优点，使其在农业防治中迅速发展，成为防病丰产的有效手段之一。但是长期、反复和大量的使用化学农药存在着潜在的危害。不仅带来了环境污染和对人类健康的潜在危害，而且还带来了对非靶标生物的影响及植物病原菌抗药性的发展等问题，使得化学农药的发展受到了来自各不同方面的限制。寻找广谱、高效、低毒的生物农药已成为科研人员及农药使用者的共识。炭疽病是由炭疽菌引起的一类植物病害的统称，该病害主要的危害是能够引起叶斑、枝枯、果实腐烂甚至死苗等。近年来，炭疽病的发生愈演愈烈，尤其是在一些高温湿热的地区，如热带和亚热带地区，病害的发生给许多蔬菜、果树、园林植物以及农作物等造成了极为严重的损失，己在世界范围内引起了普遍关注。炭疽菌属(colletorichum)内有约有590种，可危害许多种类的寄主，导致炭疽病害的发生，给世界各国的农业生产带来了很大的威胁。炭疽病是水果特别是热带水果的主要病害之一，在世界各水果产区广泛发生。病菌以分生孢子侵染植物的叶、梢、花穗、果，导致梢枯、叶斑、落叶和落果。炭疽菌具有潜伏侵染的特性，透过皮孔侵入进果实的附着孢，埋藏在表皮或角质层中，可进行长达数月的休眠。炭疽病菌于水果采前在田间潜伏侵染果实，采后很难控制，因而易导致贮运期间果实腐烂，缩短水果的商品货架期。目前控制水果炭疽病的方法主要是采前的品种抗性、果园的栽培管理条件、降雨量、气温其他因素，采后的气调贮藏、热处理，化学杀菌剂处理和生物防治等。对炭疽病的生物防治目前还没有成型的产品面市。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种热带假丝酵母培养物及其制备方法和应用。本发明制备方法得到的热带假丝酵母培养物能抑制炭疽菌，所述热带假丝酵母培养物对炭疽菌的抑制作用不低于75％。本发明提供了一种热带假丝酵母培养物的制备方法，所述热带假丝酵母candidatropicalis，保藏编号为cgmccno.8688，包括以下步骤：1)将所述热带假丝酵母接种于种子培养基中进行种子培养，得到种子液；2)将步骤1)得到的种子液接种于液体发酵培养基中进行第一发酵培养16～24h，得到发酵液；3)当步骤2)所述发酵液中热带假丝酵母菌数达到5×108～1×109个/ml时，连续加入几丁质溶液进行诱导培养20～30h，得到诱导培养液；控制几丁质在发酵液中总的质量百分浓度0.1～0.8‰；4)将步骤3)得到的诱导培养液进行第二发酵培养6～54h，得到培养物。优选的是，所述种子培养基包括3～6％重量百分比的麦芽浸出粉或糖度为6～8波美度的麦芽水解液。优选的是，步骤2)所述接种用种子液中热带假丝酵母的浓度为5×106～1×108个/ml。优选的是，步骤2)所述接种的接种量为3～7％。优选的是，步骤2)所述液体发酵培养基以麦芽培养基为基准，还包括质量百分含量为1％的果糖，10g/l的七水硫酸镁，7g/l的磷酸二氢钾，30g/l的冷榨豆饼粉，40iu/ml的淀粉酶和20iu/ml的糖化酶；所述麦芽培养基包括质量百分含量为4～8％的麦芽浸出粉或糖度为6～11的麦芽水解液。优选的是，步骤2)所述第一发酵培养和步骤4)所述第二发酵培养的条件独立地包括：温度27～30℃，通入通气比为1:(0.7～1.1)的无菌空气。优选的是，步骤3)所述诱导培养的条件包括：温度27～29℃，通入通气比为1:(0.7～0.9)的无菌空气。本发明还提供了上述技术方案所述制备方法得到的热带假丝酵母培养物。本发明还提供了上述技术方案所述制备方法得到的培养物或上述技术方案所述培养物在抑制炭疽菌中的应用。本发明提供了一株热带假丝酵母培养物的制备方法，所述制备方法得到的热带假丝酵母培养物能抑制炭疽菌，抑制效果好，对炭疽菌的抑制作用不低于75％。附图说明图1为本发明实施例5提供的qjztout1-2菌株发酵培养物抑制炭疽菌的平板结果图。具体实施方式本发明提供了一种热带假丝酵母培养物的制备方法，所述热带假丝酵母candidatropicalis，保藏编号为cgmccno.8688，包括以下步骤：1)将所述热带假丝酵母接种于种子培养基中进行种子培养，得到种子液；2)将步骤1)得到的种子液接种于液体发酵培养基中进行第一发酵培养，得到发酵液；3)当步骤2)所述发酵液中热带假丝酵母菌数达到5×108～1×109个/ml时，连续加入几丁质溶液进行诱导培养20～30h，得到诱导培养液；控制几丁质在发酵液中的质量百分浓度0.1～0.8‰；4)将步骤3)得到的诱导培养液进行第二发酵培养6～54h，得到培养物。本发明的热带假丝酵母candidatropicalis命名为qjztout1-2，该菌株于2014年1月6日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。本发明所述热带假丝酵母qjztout1-2的培养物能抑制炭疽菌；热带假丝酵母qjztout1-2的有效抑制培养物的获得可以通过液体发酵得到，且抑制效果好。本发明将热带假丝酵母接种于种子培养基中进行种子培养，得到种子液。在本发明中，所述种子培养基优选包括3～6％重量百分比，更优选为4％重量百分比的麦芽浸出粉或糖度为6～8波美度，更优选为7波美度的麦芽水解液，即所述种子培养基优选为麦芽培养基。本发明对所述种子培养基的配制和灭菌方法没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的常规麦芽培养基配制和灭菌方法即可。在本发明中，所述种子液优选在所述种子液中热带假丝酵母的浓度为5×106～1×108个/ml时停止培养。得到种子液后，本发明将种子液接种于液体发酵培养基中进行第一发酵培养16～24h，得到发酵液。在本发明中，所述发酵培养的时间优选为20h。在本发明中，所述接种的接种量为3～7％，优选为5％。在本发明中，所述液体发酵培养基以麦芽培养基为基准，还包括质量百分含量为1％的果糖，10g/l的七水硫酸镁，7g/l的磷酸二氢钾，30g/l的冷榨豆饼粉，40iu/ml的淀粉酶和20iu/ml的糖化酶；所述麦芽培养基包括质量百分含量为4～8％的麦芽浸出粉或糖度为6～11波美度的麦芽水解液，更优选包括包括质量百分含量为5％的麦芽浸出粉或糖度为8波美度的麦芽水解液。在本发明中，所述液体发酵培养基的灭菌方法优选包括以下步骤：在45℃保温30min，72℃保温30min，115℃灭菌20min。在本发明中，所述第一发酵培养的条件包括：温度27～30℃，通入通气比为1:(0.7～1.1)的无菌空气，更优选温度28℃，通入通气比为1:1.0的无菌空气。在本发明中，所述发酵培养的温度优选为29℃，所述通气比优选为1:1.1。当所述发酵液中酵母菌数达到5×108～1×109个/ml时，本发明通过连续加入几丁质溶液进行诱导培养20～30h，得到诱导培养液；几丁质在发酵液中的浓度应控制在加入几丁质后，发酵液中几丁质的质量百分比浓度0.1～0.8‰。在本发明中，所述几丁质添加的作用为诱导本申请菌株产生对炭疽菌有效抑制作用的物质，稳定并增加培养物中有效抑菌物质的产生，稳定并提高本申请菌株培养物对炭疽菌的抑制作用。在本发明中，所述连续加入几丁质溶液的操作优选为无菌方式，且所述几丁质溶液优选无菌。在本发明中，几丁质的加入量应以加入几丁质后发酵液中的几丁质百分比浓度0.1～8‰为控制基准，更优选为2～6‰。在本发明中，所述几丁质溶液的质量百分比浓度优选为1～10％，更优选为8％。在本发明中，所述几丁质溶液的加入速度优选为300～450ml/h，更优选为400ml/h。在本发明中，所述诱导培养的条件包括：温度27～29℃，通入通气比为1:(0.7～0.9)的无菌空气。在本发明中，所述诱导培养的温度优选为27℃，所述通气比优选为1:0.8。在本发明中，所述诱导培养的时间优选为20～30h。在本发明中，当发酵液对炭疽菌的抑制作用已经超过75％时，所述诱导培养优选终止，第二发酵培养阶段不再进行。本发明将所述诱导培养液进行第二发酵培养6～54h，得到培养物。在本发明中，当发酵液对炭疽菌的抑制作用超过75％时，所述第二发酵培养阶段终止。在本发明中，自接种种子液开始，第一发酵培养、诱导培养和第二发酵培养的总时间优选为60～90h。在本发明中，所述第二发酵培养的条件包括：温度27～30℃，通入通气比为1:(0.7～1.1)的无菌空气，更优选温度28℃，通入通气比为1:1.0的无菌空气。在本发明中，所述发酵培养的温度优选为29℃，所述通气比优选为1:1.1。本发明还提供了上述技术方案所述制备方法得到的热带假丝酵母培养物。本发明还提供了上述技术方案所述培养物或上述技术方案所述培养方法得到的培养物在抑制炭疽菌中的应用。本发明所述培养物对炭疽菌的抑制作用不低于75％。在本发明中，所述培养物对炭疽菌的抑制率测定优选采用常规的病原菌作为指示菌的体外平皿抑制测定法进行。下面结合具体实施例对本发明所述的一种热带假丝酵母培养物及其制备方法和应用做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。实施例1种子培养基：3％重量百分比的麦芽浸出粉或糖度为6波美度的麦芽水解液；发酵培养基：4％重量百分比的麦芽浸出粉或糖度为6波美度的麦芽水解液，1％质量百分浓度的果糖，七水硫酸镁10克/升，磷酸二氢钾7克/升，冷榨豆饼粉30克/升，40iu/毫升的淀粉酶，20iu/毫升的糖化酶；种子培养基灭菌条件115℃20分钟。液体发酵培养基灭菌时在45℃保温30分钟，72℃保温30分钟，115℃灭菌20分钟。将热带假丝酵母接种于种子培养基中进行种子培养，得到种子液，当种子液每毫升培养液含酵母菌数达到5×106个时，按发酵罐培养液3％的量接入发酵罐中进行第一发酵培养，温度控制在27℃，保持持续通入无菌空气，通气比为1:0.7，培养20小时。当每毫升发酵液中含酵母菌数达到5×108个时，以每小时300毫升的速度通过无菌方式连续加入重量百分比浓度为1％的无菌几丁质溶液，其量控制在发酵液中几丁质重量百分比总浓度0.1‰，温度控制在27℃，保持持续通入无菌空气，通气比为1:0.7，诱导培养24小时。进行第二发酵培养16h，收集发酵液，即为目的培养物备用，测定抑制率为75％。实施例2种子培养基：6％重量百分比的麦芽浸出粉或糖度为8波美度的麦芽水解液；液体发酵培养基：6％重量百分比的麦芽浸出粉或糖度为9波美度的麦芽水解液，1％质量百分浓度的果糖，七水硫酸镁10克/升，磷酸二氢钾7克/升，冷榨豆饼粉30克/升，40iu/毫升的淀粉酶，20iu/毫升的糖化酶；种子培养基灭菌条件115℃20分钟。液体发酵培养基灭菌时在45℃保温30分钟，72℃保温30分钟，115℃灭菌20分钟。将热带假丝酵母接种于种子培养基中进行种子培养，得到种子液，当种子液每毫升培养液含酵母菌数达到1×107个时，按发酵罐培养液5％的量接入发酵罐中进行第一发酵培养，温度控制在29℃，保持持续通入无菌空气，通气比为1:1.0，培养22小时。当每毫升发酵液中含酵母菌数达到8×108个时，以每小时400毫升的速度通过无菌方式连续加入重量百分比浓度为8％的无菌几丁质溶液，其量控制在发酵液中几丁质重量百分比总浓度不超过0.4‰，温度控制在28℃，保持持续通入无菌空气，通气比为1:0.8，诱导培养30小时。进行第二发酵培养28h，收集发酵液，即为目的培养物备用，测定抑制率为85％。实施例3种子培养基：6％重量百分比的麦芽浸出粉或糖度为8波美度的麦芽水解液；发酵培养基：8％重量百分比的麦芽浸出粉或糖度为11波美度的麦芽水解液，1％质量百分浓度的果糖，七水硫酸镁10克/升，磷酸二氢钾7克/升，冷榨豆饼粉30克/升，40iu/毫升的淀粉酶，20iu/毫升的糖化酶；种子培养基灭菌条件115℃20分钟。液体发酵培养基灭菌时在45℃保温30分钟，72℃保温30分钟，115℃灭菌20分钟。将热带假丝酵母接种于种子培养基中进行种子培养，得到种子液，当种子液每毫升培养液含酵母菌数达到1×108个时，按发酵罐培养液7％的量接入发酵罐中进行第一发酵培养，温度控制在30℃，保持持续通入无菌空气，通气比为1:1.1，培养24小时。当每毫升发酵液中含酵母菌数达到1×109个时，以每小时450毫升的速度无菌连续加入重量百分比浓度为10％的几丁质溶液，其量控制在发酵液中几丁质重量百分比总浓度不超过0.8‰，温度控制在29℃，保持持续通入无菌空气，通气比为1:0.9，诱导培养36小时。进行第二发酵培养30h，收集发酵液，即为目的培养物备用，测定抑制率为95％。实施例4将发酵液喷撒梨树叶面和果实，以喷撒清水的作为对照，60天后统计果树炭疽病的发病情况，与对照相比，发酵液对果树炭疽病的抑抑制制作用达到92.6％。实施例5选取瓦克青霉(penicilliumwaksmanzaleski)、枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)、小红酵母(rhodotorulaminuta)、假丝酵母(candidaspp.)及本申请菌株，按实施例3的操作进行，其中培养基按青霉、细菌、酵母和本申请菌株分别配制，最终各菌株抑制炭疽菌情况如表1所示：表1各菌株抑制炭疽菌情况瓦克青霉枯草芽孢杆菌小红酵母假丝酵母qjztout1-2菌株抑制率(％)73.749.379.59.794从表1数据可以看出，本申请对炭疽菌的抑制作用优于其它菌株。图1为本申请菌株qjztout1-2、瓦克青霉(penicilliumwaksmanzaleski)、枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)及假丝酵母(candidaspp.)培养液对炭疽菌的平板抑菌试验结果图。从图1的平板抑菌试验结果也可以看出，本申请菌株培养液对炭疽菌的抑制作用优于其它菌株。实施例6将qjztout1-2菌株按实施3的发酵液喷撒果树叶面和果实，以喷撒清水的作为对照，化学农药对照为甲基托布津可湿性粉剂。60天后统计果树炭疽病的发病情况，最终菌株发酵液抑制炭疽菌情况如表2所示：表2菌株发酵液抑制炭疽菌情况注：清水对照没有抑制作用。从上表数据可以看出，本申请能抑制多种水果炭疽菌病。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。当前第1页12