本发明涉及医学诊断领域，具体而言，涉及一种用于检测hiv-1的合成肽。
背景技术
人类免疫缺陷病毒(humanimmunodeficiencyvirus，hiv)引起的艾滋病在20世纪80年代发现以来，已传遍全球。据世界卫生组织的报告，截至2016年底，全球约有3670万艾滋病毒感染者。截至2017年6月30日，我国共有hiv感染者/艾滋病患者71.8万。hiv主要攻击人体的辅助t淋巴细胞系统，择性地侵犯带有cd4分子的细胞，破坏人体的免疫能力，导致免疫系统失去抵抗力，常合并严重的机会感染，从而导致各种疾病和癌症在人体内生存，发展到最后导致艾滋病。迄今为止尚无有效药物及疫苗来治疗和预防艾滋病，因而hiv感染已成为当今全球威胁最严重的传染病及公共卫生问题。
hiv病毒是带有类脂包膜的rna逆转录病毒，其单拷贝基因rna全长约9.2-9.8kb。hiv有三个主要结构基因：env、gag、pol，它们分别编码产生不同功能的蛋白质即抗原。hiv侵入机体后，一般在6周左右产生抗体。血清中首先出现的是hiv前体p55抗体和核心蛋白p24抗体；然后出现外包膜蛋白gp120抗体和跨膜糖蛋白gp41抗体。目前发现hiv主要有hiv-1、hiv-2，已知艾滋病毒毒株共有4种，分别是m、n、o、p，其中m和n传播最广，全球至今只有两宗p型病例，o型亦只有10万人，主要集中在中西非。这几种类型在生物学特性上很相似，它们基因组有40％-50％的同源性。目前，我国流行的主要是hiv-1型。
由于hiv抗原和核酸检测所使用的仪器、试剂、人力成本过高，占据hiv检测市场主流的还是hiv抗体检测。目前，hiv抗体检测原料一方面朝着提高灵敏度和特异性，缩短窗口期的方向发展，另一方面朝着简便快速的方向发展。为了顺应以上发展趋势，本领域还需要提供可以应用于hiv-1抗体检测的hiv-1重组蛋白。
有鉴于此，特提出本发明。
技术实现要素：
本发明总的来说涉及人类免疫缺陷病毒(hiv)感染的诊断用方法和物质，更具体地说，本发明涉及具有与hiv-1型抗体结合的反应原性的合成肽及其应用。本发明的目的是为诊断实验室提供一种手段，具体说来是一种特异性肽，其使得可以更好地检测抗hiv-1抗体，并且能够更好地避免潜在的“假阴性”以及“假阳性”结果。
所述的合成肽，为包含突变位点的seqidno:1所示的氨基酸序列；
所述突变位点选自下面的至少一个：
t77置换为v、n或s；
n101置换为d、e或q；
g105置换为k、h或r；
p124置换为d或e；
k127置换为d、e或q；
或，与上述任一种序列具有至少80％的序列同一性的氨基酸序列，且具有大于99％的灵敏度和/或大于99.4％的特异性。。
与现有技术相比，本发明所提供的合成肽通过一个或多个氨基酸突变位点，灵敏度可达到100％，特异性达到99.75％以上。
具体实施方式
本发明涉及一种合成肽，其为包含突变位点的seqidno:1所示的氨基酸序列；
所述突变位点选自下面的1、2、3、4或5个：
t77置换为v、n或s；
n101置换为d、e或q；
g105置换为k、h或r；
p124置换为d或e；
k127置换为d、e或q；
或，与上述任一种序列具有至少80％、85％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％的序列同一性的氨基酸序列；
在一些实施方案中，本发明提供的合成肽、试剂盒或检测方法具有大于99％、大于99.1％、大于99.2％、大于99.3％、大于99.4％、大于99.5％、大于99.6％、大于99.7％、大于99.8％、大于99.9％的灵敏度。
在一些实施方案中，本发明提供的合成肽、试剂盒或检测方法具有大于99.4％(如99.5％以上、99.6％以上、99.7％以上、99.8％以上、99.9％以上或更高)的特异性。
上述所指的灵敏度和特异性根据本发明实施例中的发明进行确定。
在一些实施方式中，本发明提供包含来自seqidno:1所示序列的全部或部分，例如至少30个连续氨基酸的多肽。
本发明所提供的合成肽优选通过提纯处理；特别适用于动物、特别哺乳动物、特别是灵长类动物，特别是人的hiv-1型病毒的鉴定和/或富集。hiv-1逆转录病毒是最普遍的，其在世界上多个地区占优势。
在一些实施方式中，所述突变位点包括：t77置换为v、n或s。
在一些实施方式中，所述突变位点包括：n101置换为d、e或q。
在一些实施方式中，所述突变位点包括：g105置换为k、h或r。
在一些实施方式中，所述突变位点包括：p124置换为d或e。
在一些实施方式中，所述突变位点包括：k127置换为d、e或q。
在一些实施方式中，所述突变位点还包括下面的1、2、3、4或5个突变位点：
r18置换为s；
q95置换为e；
l106置换为e；
l123置换为k；
n130置换为k。
在一些实施方式中，所述突变位点包括：r18置换为s。
在一些实施方式中，所述突变位点包括：q95置换为e。
在一些实施方式中，所述突变位点包括：l106置换为e。
在一些实施方式中，所述突变位点包括：l123置换为k。
在一些实施方式中，所述突变位点包括：n130置换为k。
在一些实施方式中，所述突变位点为：
r18置换为s；t77置换为v、n或s；q95置换为e；n101置换为d、e或q；g105置换为k、h或r；l106置换为e；l123置换为k；p124置换为d或e；k127置换为d、e或q；n130置换为k。
在一些实施方式中，所述突变位点为：
t77置换为v；q95置换为e，或不置换；n101置换为d、e或q；g105置换为k、h或r；l106置换为e，或不置换；p124置换为d或ek127置换为d、e或q。
在一些实施方式中，所述突变位点为：r18置换为s，或不置换；t77置换为v、n或s；q95置换为e，或不置换；n101置换为d、e或q；g105置换为k、h或r；l106置换为e，或不置换；l123置换为k，或不置换；p124置换为d或e；k127置换为d、e或q；n130置换为k，或不置换。
在一些实施方式中，所述突变位点为：r18置换为s；t77置换为s；q95置换为e，或不置换；n101置换为d、e或q；g105置换为k、h或r；l106置换为e，或不置换；l123置换为k；p124置换为d；k127置换为d、e或q；n130置换为k。
在一些实施方式中，本发明提供包括所述合成肽的制品，如微量滴定板(其上可以包被有所述合成肽)。
本发明还涉及一种分离的核酸分子，其编码如上所述的合成肽。
本发明还涉及一种载体，其包含如上所述的核酸分子。
本发明还涉及一种宿主细胞，其被如上所述的载体所转化。
所述宿主细胞可以为真核细胞，比如哺乳动物细胞。
本发明还涉及一种产生如上所述的合成肽的方法，包括：
a)表达如上所述的核酸分子；或者
b)化学合成，将氨基酸加入以获得完整多肽。
通过上述a)合成的方法，可采用总所周知的亲和性纯化来富集表达的都多肽。
化学合成可以通过本领域技术人员所公知的设备，例如自动肽合成仪，进行合成，比如appliedbiosystems等销售的自动肽合成仪，通过肽合成获得。
本发明还涉及修饰的合成肽，其由如上所述的合成肽标记显示信号强度的指示剂得到。
在一些实施方式中，所述显示信号强度的指示剂包括荧光物质、量子点、地高辛标记探针、生物素、放射性同位素、放射性造影剂、顺磁离子荧光微球、电子致密物质、化学发光标记物、超声造影剂、光敏剂、胶体金或酶中的任一种。
在一些实施方式中，所述荧光物质包括alexa350、alexa405、alexa430、alexa488、alexa555、alexa647、amca、氨基吖啶、bodipy630/650、bodipy650/665、bodipy-fl、bodipy-r6g、bodipy-tmr、bodipy-trx、5-羧基-4′，5′-二氯-2′，7′-二甲氧基荧光素、5-羧基-2′，4′，5′，7′-四氯荧光素、5-羧基荧光素、5-羧基罗丹明、6-羧基罗丹明、6-羧基四甲基罗丹明、cascadeblue、cy2、cy3、cy5、cy7、6-fam、丹磺酰氯、荧光素、hex、6-joe、nbd(7-硝基苯并-2-氧杂-1，3-二唑)、oregongreen488、oregongreen500、oregongreen514、pacificblue、邻苯二甲酸、对苯二甲酸、间苯二甲酸、甲酚固紫、甲酚蓝紫、亮甲酚蓝、对氨基苯甲酸、赤藓红、酞菁、偶氮甲碱、花青、黄嘌呤、琥珀酰荧光素、稀土金属穴状化合物、三双吡啶基二胺铕、铕穴状化合物或螯合物、二胺、双花青苷、lajolla蓝染料、别藻蓝蛋白、allococyaninb、藻蓝蛋白c、藻蓝蛋白r、硫胺、藻红青蛋白、藻红蛋白r、reg、罗丹明绿、罗丹明异硫氰酸酯、罗丹明红、rox、tamra、tet、trit(四甲基罗丹明异硫醇)、四甲基罗丹明和德克萨斯红中的任一种。
在一些实施方式中，所述放射性同位素包括110in、111in、177lu、18f、52fe、62cu、64cu、67cu、67ga、68ga、86y、90y、89zr、94mtc、94tc、99mtc、120i、123i、124i、125i、131i、154-158gd、32p、11c、13n、15o、186re、188re、51mn、52mmn、55co、72as、75br、76br、82mrb和83sr中的任一种。
在一些实施方式中，所述酶包括辣根过氧化酶、碱性磷酸酶和葡萄糖氧化酶中的任一种。
在一些实施方式中，所述荧光微球为：聚苯乙烯荧光微球，内部包裹有稀土荧光离子铕。
本发明也涉及一种试剂盒，其包括如上所述的合成肽、或如上所述的修饰的合成肽。
在一些实施方式中，所述试剂盒还包括免疫学上可接受的稀释剂、缓冲液、蛋白酶抑制剂、用于阻断抗体非特异性结合的封闭剂、对hiv-1抗体具有亲和力的第二抗体中的一种或多种。
在一些实施方式中，蛋白酶抑制剂可以选择包括pmsf、edta、nan3、pepstantin、leupeptin、aprotinin、indinavir、ritonavir、nelfinavir、amprenavir、kaletra中的一种或多种。
在一些实施方式中，对hiv-1抗体具有亲和力的第二抗体可采用抗人fc段的抗体，种属可以为小鼠、大鼠、兔、狗、羊、马或者人；
在一些实施方式中，对hiv-1抗体具有亲和力的第二抗体标记有上述的显示信号强度的指示剂。
在一些实施方式中，所述用于阻断抗体非特异性结合的封闭剂包括bsa，fbs。
在一些实施方式中，所述缓冲液为磷酸缓冲液(pbs)、tris盐缓冲液(tbs)、tris盐缓冲液-吐温(tbst)或tris盐缓冲液-triton(tbst)。
在一些实施方式中，所述试剂盒还包括例如上述微量滴定板。
在一些实施方式中，当所述试剂盒包括如上所述的修饰的合成肽时，所述试剂盒还包括用于检测所述显示信号强度的指示剂的试剂；
用于检测所述显示信号强度的指示剂的试剂为本领域技术人员所公知，作为一个例子，当指示剂为辣根过氧化物酶(hrp)时，对应的试剂可以选择双氧水和鲁米诺；当指示剂为生物素时，对应的试剂可以选择亲和素，等等。
本发明还涉及一种检测抗hiv-1抗体的方法，其包括将生物学样品与如上所述的合成肽、或如上所述的修饰的合成肽、或如上所述的试剂盒中的试剂相接触形成免疫复合物；
检测所述免疫复合物中所述合成肽或所述修饰的合成肽的存在，以指示所述生物学样品中hiv-1抗体的存在；
所述方法为诊断或非诊断目的，于体内或体外进行。
本发明还涉及如上所述的合成肽、或如上所述的修饰的合成肽、或如上所述的试剂盒在制备hiv-1诊断剂中的应用。
在一些实施方案中，本文提供获得或设计用于检测hiv的重组蛋白的方法，所述方法可以包括以下步骤中的一个或多个：
选取人类免疫缺陷病毒包膜蛋白，选取蛋白的部分区段，并对其中部分位点做突变设计，通过表达纯化制备相应的重组蛋白，通过活性及特异性筛选，获得活性高，特异性好的重组蛋白；
合成序列片段，并连接到载体如pmd18-t载体上，构建含有目的片段的t载体；
通过定点突变设计，构建含有特定突变目的片段的载体如pmd18-t载体；
重组蛋白的制备方法：设计上游引物(例如带ecori酶切位点)和下游引物(例如带bamhi酶切位点)，以含有目的片段的载体如t载体为模板，扩增目的基因，双酶切并纯化后连接到载体如pet-28a上，转化细胞如大肠杆菌bl21；筛选得到阳性克隆后，挑取单菌落接种到培养基如含50ul/mlkan的lb培养基中，在适当温度如37度震荡培养；待od600达到0.6-0.8后，加入1.0mmiptg，37度诱导培养2-4h，提取总蛋白，sds-page鉴定重组蛋白表达情况；用ni离子螯合柱对目的蛋白进行第一次纯化，用sp柱对目的蛋白进行第二次纯化，sds-page鉴定重组蛋白的纯度。
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1
重组蛋白的设计
通过基因合成的方式合成编码seqidno：1的基因序列，并对其中x77(x77代表seqidno：1所示序列的第77位，下同)、x95、x101、x105、x106、x124、x127位点的氨基酸进行突变设计，
将x77位的氨基酸由t突变为v或n或s，将x95位的氨基酸由q突变为e，将x101位的氨基酸由n突变为e或d或q，将x105位的氨基酸由g突变为k或h或r，将x106位的氨基酸由l突变为e，将x124位氨基酸由p突变为d或e，将x127位氨基酸由k突变为d或e或q。
根据以上突变方向构建突变克隆，其中优选方案为其中优选突变方案x77、x101、x105、x124、x127分别为v、e、k、d、d命名为hiv-ag-1，分别为n、d、h、e、e命名为hiv-ag-2，分别为s、q、r、d、q命名为hiv-ag-3，分别为s、d、r、e、e命名为hiv-ag-4，分别为v、d、k、e、d命名为hiv-ag-5,分别为n、e、h、d、e命名为hiv-ag-6，分别为v、q、r、d、q命名为hiv-ag-7，分别为s、q、k、e、d命名为hiv-ag-8，分别为n、q、h、e、q命名为hiv-ag-9。并构建到pmd18-t载体(takara大连宝生物，货号：6011)中。seqidno：1的基因序列构建克隆命名为pmd18-t-hiv-ag-0，突变克隆分别命名为pmd18-t-hiv-ag-1至pmd18-t-hiv-ag-9用于后续扩增与核酸片段保存。
实施例2
重组蛋白的设计
在实施例1基础上，对hiv-ag-1至hiv-ag-9中序列x18、x95、x106、x123和x130的氨基酸进行突变设计。
将x18位的氨基酸r突变为s，将x95位的氨基酸由q突变为e，将x106位氨基酸由l突变为e，将x123位的氨基酸由l突变为k，将x130位氨基酸由n突变为k。
新序列分别命名为hiv-ag-10至hiv-ag-18。并构建到pmd18-t载体中。分别命名为pmd18-t-hiv-ag-10至pmd18-t-hiv-ag-18用于后续扩增与核酸片段保存。
实施例3
重组蛋白表达载体的构建、诱导表达及纯化
重组蛋白表达载体的构建与诱导表达：设计上游引物(带ecori酶切位点)和下游引物(带bamhi酶切位点)，以pmd18-t-hiv-ag-0至pmd18-t-hiv-ag-18为模板，扩增目的基因。目的基因纯化后，用ecori(takara大连宝生物，货号：1010a)和bamhi限制性内切酶(takara大连宝生物，货号：1040a)进行双酶切，37℃孵育2h。纯化酶切后的产物并与经过相同酶切过的载体pet-28a进行连接，22℃孵育2h，16℃孵育2h。用热激法将连接产物转化大肠杆菌bl21感受态(neb(newenglandbiolabs)，货号：c2530h)，并涂布于含50ug/mlkan的lb平板，37℃培养16h。挑取阳性克隆，经菌液pcr鉴定、双酶切鉴定后送测序。选取测序完全正确的阳性单克隆接种到含50ug/mlkan的lb培养基中，37度震荡培养。待od600达到0.6-0.8后，加入1.0mmiptg，37℃诱导培养2-4h，提取总蛋白，sds-page鉴定重组蛋白表达情况。通过重组蛋白n端带有的6*his标签，经过镍离子螯合纯化和sp柱纯化后得到纯度达到96％的蛋白。将得到的蛋白分别命名为hiv-ag-0至hiv-ag-18。
实施例4
突变克隆hiv-ag-1至hiv-ag-9重组抗原在酶免产品工艺中的应用与活性及特异性评价
酶免检测按如下方式进行操作：
包被：将重组蛋白按100ng/ml的工作浓度加入到50mmcbph9.6的包被液中，混匀后按每孔100ul加入到聚苯乙烯板中，4℃包被18-20小时。
封闭：取出包被板室温平衡30min，用洗涤液洗板2次，每孔加150ul封闭液37℃封闭2小时。拍干置于湿度小于30％的电子干燥箱中干燥24h后待用。
标记：将重组蛋白按推荐方式标记hrp按50ng/ml用酶工作液稀释后混匀(酶稀释液配方：20mmpb150mmnacl0.5％bsa0.05％tween-2000.1％p300)。
反应模式和反应时间：50ul待测样品+50ul样品稀释液，37度恒温箱反应60min；洗板5次，拍干后加入100ul标记重组蛋白-hrp工作液，37℃反应30min；洗板5次，加显色剂a和b各50ul，显色30min；加入终止液50ul，用450nm和630nm双波长检测，检测要求在10min之内读完。
与市售试剂盒进行性能对比实验，hiv-1阳性血清500份、hiv-1抗体阴性血清3000份。结果如表1所示，本发明的重组蛋白用于hiv-1抗体检测，灵敏度有提升，特异性明显改善，优于现有产品。
表1突变后检测结果
实施例5
突变克隆hiv-ag-1至hiv-ag-18重组抗原在酶免工艺中的活性评价
酶免检测按如下方式进行操作：
包被：将重组蛋白按100ng/ml的工作浓度加入到50mmcbph9.6的包被液中，混匀后按每孔100ul加入到聚苯乙烯板中，4℃包被18-20小时。
封闭：取出包被板室温平衡30min，用洗涤液洗板2次，每孔加150ul封闭液37℃封闭2小时。拍干置于湿度小于30％的电子干燥箱中干燥24h后待用。
标记：将重组蛋白按推荐方式标记hrp按50ng/ml用酶工作液稀释后混匀(酶稀释液配方：20mmpb150mmnacl0.5％bsa0.05％tween-2000.1％p300)。
反应模式和反应时间：50ul待测样品+50ul样品稀释液，37度恒温箱反应60min；洗板5次，拍干后加入100ul标记重组蛋白-hrp工作液，37℃反应30min；洗板5次，加显色剂a和b各50ul，显色30min；加入终止液50ul，用450nm和630nm双波长检测，检测要求在10min之内读完。
hiv-1阳性血清500份，每份按1:200用样品稀释液进行稀释后作为待测标本进行活性检测。结果如表2所示，进行突变后，500份阳性标本稀释后检测的平均灵敏度有显著提高。
表2突变后检测结果
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
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