一种选择性杀灭肝癌细胞的新型溶瘤病毒及其构建方法与流程

本发明涉及生物技术和基因治疗领域，具体的说是涉及一种选择性杀灭肝癌细胞的新型溶瘤病毒及其构建方法。

背景技术：

溶瘤病毒疗法是一种利用病毒特异性地在肿瘤细胞中复制继而杀伤肿瘤细胞，并刺激机体产生特异性抗肿瘤免疫反应的新型肿瘤治疗方法。相比其他肿瘤治疗方法，溶瘤病毒疗法具有复制高效、杀伤效果好和毒副作用小等特点，已经成为肿瘤治疗研究领域的新热点。

美国amgen公司的ⅰ型单纯疱疹重组病毒t-vec(talimogenelaherparepvec)在治疗晚期黑色素瘤患者的ⅲ期临床试验中显示出良好的肿瘤治疗效果，并成为首个获得美国fda批准上市的溶瘤病毒类治疗药物。溶瘤病毒在黑色素瘤治疗上取得的成功引起了科学家对溶瘤病毒疗法更广泛的关注，溶瘤病毒的研究得到了进一步的推动。至今用于溶瘤治疗的病毒高达数十种，包括ⅰ型单纯疱疹病毒(herpessimplexvirustype1，hsv-1)、腺病毒、呼肠孤病毒、新城疫病毒、脊髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒、麻疹病毒、人类免疫缺陷病毒、腮腺炎病毒、牛痘病毒、水泡性口炎病毒(vesicularstomatitisvirus，vsv)和流感病毒等。溶瘤病毒按发展历程大致可分为4种类型：(1)野生型病毒株或自然减毒株，如新城疫病毒、柯萨奇病毒和呼肠孤病毒等；(2)基因工程选择性减毒株，主要是删除病毒某些关键基因而实现病毒复制的肿瘤选择性，如onyx-015、g207等；(3)基因加载型病毒株，主要是在前述两种溶瘤病毒基础上加载外源治疗基因，如加载粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(granulocytemacrophagecolonystimulatingfactor，gm-csf)的jx-594和t-vec等；(4)转录靶向型病毒株，即在病毒必需基因前插入组织或肿瘤特异性启动子来控制溶瘤病毒在肿瘤细胞内复制，如g92a等。

肝癌是一种常见恶性肿瘤。甲胎蛋白(alphafetoprotein，afp)是一种主要在肝癌细胞表达的分泌性蛋白，本发明利用肝癌特异性表达afp的特点构建选择性在肝癌细胞感染繁殖的新型溶瘤病毒hsv^afp+il-12。该病毒不感染正常肝细胞及其它正常组织，可静脉给药，具有高效、特异性强等优点。对血液中的循环肝癌细胞及转移性肝癌灶均有杀灭作用。

技术实现要素：

为解决上述背景技术中提出的问题，本发明的目的在于提供一种选择性杀灭肝癌细胞的新型溶瘤病毒及其构建方法。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

本发明公开了一种选择性杀灭肝癌细胞的新型溶瘤病毒构建方法，包括以下步骤：

步骤一、构建pdicp4-promoter质粒：pcr分别扩增i型单纯疱疹病毒17+株icp4基因启动子上游和下游的侧翼序列后，用限制性内切酶ecori/spei分别消化后获得icp4基因启动子的上游侧翼序列、下游侧翼序列及去除icp4启动子的i型单纯疱疹病毒17+株，并用互补的连接酶linker1和linker2将所述icp4基因启动子的上游侧翼序列和下游侧翼序列连接起来，并把连接后的产物克隆到pbluescript的ecori和sali酶切位点创建质粒pdicp4-promoter；

步骤二、构建pdicp4-afp-promoter质粒：用ecori/xhoi双酶切消化的方式把由cmv启动子控制的人afp启动子序列表达盒从质粒pcdna3.1-afp-promoter中释放出来，用t4dna多聚酶处理后克隆入步骤一所得质粒pdicp4-promoter的限制性内切酶ecohv酶切位点处，从而构建质粒pdicp4-afp-promoter；

步骤三、bhk细胞内同源重组i型单纯疱疹病毒17+株：将步骤一中去除icp4启动子的i型单纯疱疹病毒17+株与步骤二中质粒pdicp4-afp-promoter共同转染bhk细胞，使这两者在bhk细胞发生同源重组，获得表达afp启动子的重组病毒载体17-d4-afp-promoter；

步骤四、构建pdicp34.5质粒：pcr分别扩增i型单纯疱疹病毒17+株中icp34.5基因的上游和下游侧翼序列，得到的icp34.5上游和下游侧翼序列两个片段用重叠pcr进行连接，随后把连接后的产物插入预先用限制性内切酶bamhi/xhoi消化后的质粒psp72中，用t4dna多聚酶补平质粒的粘性末端，得到的质粒命名为pdicp34.5；

步骤五、构建质粒pdicp34.5-hil-12：用hil-12基因替代质粒pcdna3.1-afp-promoter中的afp-promoter，产生质粒pcdna3.1-hil-12；把来自质粒pcdna3.1-hil-12中的hil-12表达盒克隆入质粒pdicp34.5的afel位点处，创建质粒pdicp34.5-hil-12；

步骤六、步骤五中的质粒pdicp34.5-hil-12用来删除步骤三中重组病毒载体17-d4-afp-promoter中icp34.5基因，从而构建出溶瘤病毒hsv^afp+il-12。

上述技术方案中，步骤一中的icp4启动子中，

上游侧翼序列的引物对包括：上游序列icp4-promoterusf为aaaagaattcgatacacatcgttcagacggagc；

下游序列icp4-promoterusr为aaaaactagtgatcgatctcgcacatggcct；

下游侧翼序列的引物对包括：上游序列icp4-promoterdsf为aaaaaagctttcacgcgcatgctcttctc；

下游序列icp4-promoterdsr为aaaacagctgcaccgtgcccgtgatgaa。

上述技术方案中，步骤四中的icp34.5基因中，

上游侧翼序列的引物对包括：上游序列icp34.5usf为ctctgacctgagattggcggcactg；

下游序列icp34.5usr为gcggccgcagcgctgcggccgccgcgggcgcgtcctgaccgcggg；

下游侧翼序列的引物对包括：上游序列icp34.5dsf为gcggccgcagcgctgcggccgccagcgcggcggggcccggccaacca；

下游序列icp34.5dsr为ttcttccctcttctcccgccctcca。

上述技术方案中，步骤一中，linker1的引物序列为ctagtgaattctagtggatcccccgggctgcaggaattcgatatca；

linker2的引物序列为agcttgatatcgaattcctgcagcccgggggatccactagaattca。

上述技术方案中，步骤三中重组病毒载体17-d4-afp-promoter通过四轮挑取嗜毒斑的方法进行纯化。

本发明还公开了一种选择性杀灭肝癌细胞的新型溶瘤病毒，采用下述构建方法：将i型单纯疱疹病毒17+株基因组上的icp4基因启动子置换成肝癌特异性启动子afp启动子，再将i型单纯疱疹病毒17+株基因组上icp34.5基因剔除并插入il-12表达序列构建得新型溶瘤病毒hsv^afp+il-12。

上述技术方案中，所述肝癌特异性启动子为afp启动子。

上述技术方案中，所述构建方法为一种选择性杀灭肝癌细胞的新型溶瘤病毒构建方法中所述的构建方法。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明通过将i型单纯疱疹病毒17+株(hsv母病毒)基因组上的icp4基因启动子置换成肝癌特异性启动子(甲胎蛋白afp启动子)、再将i型单纯疱疹病毒17+株基因组上的icp34.5基因剔除并插入il-12表达序列，得到hsv^afp+il-12。

几乎所有肝癌细胞能够表达afp，故afp启动子能保证hsv^afp+il-12选择性地在肝癌细胞内繁殖。icp34.5可对抗正常细胞中干扰素抗病毒的作用，而大约90％以上肿瘤细胞的干扰素抗病毒作用均有不同程度的缺损，剔除icp34.5基因使得病毒hsv^afp+il-12不能在正常细胞内而仅能在肿瘤细胞内生长繁殖，确保该病毒不感染正常组织细胞。同时，插入il-12表达序列可增强该病毒的免疫调节作用，确保受损的肝癌细胞被机体自身的免疫细胞彻底清除干净。

附图说明

图1为本发明中重组病毒hsv^afp+il-12的示意图；

图2为hsv^afp+il-12选择性抑制肝癌细胞hepg2的存活能力的条形图；

图3为hsv^afp+il-12选择性抑制肝癌细胞hepg2的克隆形成能力的条形图；

图4为hsv^afp+il-12选择性抑制肝癌细胞hepg2的迁移能力的条形图；

图5为hsv^afp+il-12选择性抑制肝癌细胞hepg2的侵袭能力的条形图。

具体实施方式

为使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合附图和具体实施方式，进一步阐述本发明是如何实施的。

本发明中，限制性内切酶ecori/spei：购于thermoscientific；pbluescript：购于stratagene；pcdna3.1-afp-promoter：购于赢润生物yrgene，中国；限制性内切酶bamhi/xhoi：购于thermoscientific；psp72：购于promega公司；hil-12基因：购于invitrogen公司。

本发明公开了一种选择性杀灭肝癌细胞的新型溶瘤病毒构建方法，包括以下步骤：

步骤一、构建pdicp4-promoter质粒：pcr分别扩增i型单纯疱疹病毒17+株icp4基因启动子上游(up-stream，us)和下游(down-stream，ds)的侧翼序列(flankingregions，flrs)后，用限制性内切酶ecori/spei分别消化后获得的icp4基因启动子的上游侧翼序列usflrs、下游侧翼序列dsflrs及去除icp4启动子的i型单纯疱疹病毒17+株，并用互补的连接酶linker1和linker2将icp4基因启动子的上游侧翼序列usflrs和下游侧翼序列dsflrs连接起来，随后把连接后的产物克隆到pbluescript的ecori和sali酶切位点创建质粒pdicp4-promoter；

步骤二、构建pdicp4-afp-promoter质粒：用ecori/xhoi双酶切消化的方式把由cmv启动子控制的人afp启动子序列表达盒从质粒pcdna3.1-afp-promoter中释放出来，用t4dna多聚酶处理后克隆入步骤一所得质粒pdicp4-promoter的限制性内切酶ecohv酶切位点处，从而构建质粒pdicp4-afp-promoter；

步骤三、bhk细胞内同源重组i型单纯疱疹病毒17+株：将步骤一中去除icp4启动子的i型单纯疱疹病毒17+株与步骤二中质粒pdicp4-afp-promoter共同转染bhk细胞，使这两者在bhk细胞发生同源重组，获得表达afp启动子的重组病毒载体17-d4-afp-promoter；

步骤四、构建pdicp34.5质粒：pcr分别扩增i型单纯疱疹病毒17+株中icp34.5基因的上游侧翼序列usflrs和下游侧翼序列dsflrs，得到的icp34.5usflrs和icp34.5dsflrs两个片段用重叠pcr进行连接，随后把连接后的产物插入预先用限制性内切酶bamhi/xhoi消化后的质粒psp72中，用t4dna多聚酶补平质粒的粘性末端，得到的质粒命名为pdicp34.5；

步骤五、构建质粒pdicp34.5-hil-12：用hil-12基因替代质粒pcdna3.1-afp-promoter中的afp-promoter，产生质粒pcdna3.1-hil-12；把来自质粒pcdna3.1-hil-12中的hil-12表达盒克隆入质粒pdicp34.5的afel位点处，创建质粒pdicp34.5-hil-12；

步骤六、步骤五中的质粒pdicp34.5-hil-12用来删除步骤三中重组病毒载体17-d4-afp-promoter的icp34.5基因，从而构建出溶瘤病毒hsv^afp+il-12。

如表1所示，步骤一中的icp4启动子中，上游侧翼序列的引物对包括：上游序列icp4-promoterusf为aaaagaattcgatacacatcgttcagacggagc(seqidno：1)；

下游序列icp4-promoterusr为aaaaactagtgatcgatctcgcacatggcct(seqidno：2)；

下游侧翼序列的引物对包括：上游序列icp4-promoterdsf为aaaaaagctttcacgcgcatgctcttctc(seqidno：3)；

下游序列icp4-promoterdsr为aaaacagctgcaccgtgcccgtgatgaa(seqidno：4)。

步骤四中的icp34.5基因中，上游侧翼序列的引物对包括：上游序列icp34.5usf为ctctgacctgagattggcggcactg(seqidno：5)；

下游序列icp34.5usr为gcggccgcagcgctgcggccgccgcgggcgcgtcctgaccgcggg(seqidno：6)；

下游侧翼序列的引物对包括：

上游序列icp34.5dsf为gcggccgcagcgctgcggccgccagcgcggcggggcccggccaacca(seqidno：7)；

下游序列icp34.5dsr为ttcttccctcttctcccgccctcca(seqidno：8)。

步骤一中，linker1的引物序列为ctagtgaattctagtggatcccccgggctgcaggaattcgatatca(seqidno：9)；

linker2的引物序列为agcttgatatcgaattcctgcagcccgggggatccactagaattca(seqidno：10)。

表1.构建质粒pdicp34.5和pdicp4-promoter所用的引物

注：基因组序列用下划线标出,穿梭质粒构建时所用的限制性酶切位点用粗斜体表示。在icp34.5usr和icp34.5dsf中进行重复pcr连接icp34.5us和dsflrs的互补序列用粗体标出。

本发明中，步骤三中重组病毒载体17-d4-afp-promoter通过四轮挑取嗜毒斑的方法进行纯化。

本发明还公开了一种选择性杀灭肝癌细胞的新型溶瘤病毒，采用下述构建方法：将i型单纯疱疹病毒17+株基因组上的icp4基因启动子置换成肝癌特异性启动子，再将i型单纯疱疹病毒17+株基因组上icp34.5基因剔除并插入il-12表达序列构建得新型溶瘤病毒hsv^afp+il-12；其中，所述肝癌特异性启动子为afp启动子；如图1所示。

本发明中，所述构建方法为一种选择性杀灭肝癌细胞的新型溶瘤病毒构建方法中所述的构建方法。

hsv^afp+il-12溶瘤效果验证实验：

本发明中，新型溶瘤病毒hsv^afp+il-12对肝癌细胞有选择性抑制作用，不感染正常肝细胞，在其它肿瘤细胞中感染率也很低。

1、mtt实验

mtt是反映细胞存活能力的良好方法。本发明使用mtt检测了不同病毒滴度下(0，0.001，0.01，0.1，1)hsv^afp+il-12对肝癌细胞hepg2、正常肝细胞wrl68的存活能力的影响，发现这种新型溶瘤病毒hsv^afp+il-12可以显著抑制肝癌细胞hepg2的存活能力，对正常肝细胞wrl68的存活能力没有影响(见图2)。

2、平板克隆形成实验

克隆形成能力是恶性肿瘤细胞的一种独有特性。平板克隆形成实验能很好地反映肿瘤细胞的克隆形成能力。本发明使用平板克隆形成实验检测hsv^afp+il-12对肝癌细胞hepg2、正常肝细胞wrl68克隆形成能力的影响，发现这种新型溶瘤病毒hsv^afp+il-12可以显著抑制肝癌细胞hepg2的克隆形成能力，对正常肝细胞wrl68的克隆形成能力没有影响(见图3)。

3、transwell小室迁移实验

迁移能力是恶性肿瘤的一种特性，反映了肿瘤转移的能力。transwell小室迁移实验能够检测这种迁移能力。本发明使用transwell小室迁移实验检测hsv^afp+il-12对肝癌细胞hepg2、正常肝细胞wrl68迁移能力的影响，发现这种新型溶瘤病毒hsv^afp+il-12可以显著抑制肝癌细胞hepg2的迁移能力，对正常肝细胞wrl68的迁移能力没有影响(见图4)。

4、transwell小室侵袭实验

侵袭是恶性肿瘤独有的特性，transwell小室侵袭实验能够反映这种侵袭能力。本发明使用transwell小室侵袭实验检测hsv^afp+il-12对肝癌细胞hepg2、正常肝细胞wrl68侵袭能力的影响，发现这种新型溶瘤病毒hsv^afp+il-12可以显著抑制肝癌细胞hepg2的侵袭能力，对正常肝细胞wrl68的侵袭能力没有影响(见图5)。

本发明通过mtt检测、平板克隆形成实验、transwell小室迁移实验和transwell小室侵袭实验，表明了本发明提供的新型病毒hsv^afp+il-12具有选择性地抑制肝癌细胞hepg2的存活、克隆形成、迁移和侵袭的能力，说明hsv^afp+il-12可以选择性杀灭肝癌细胞。

本发明中，afp启动子序列(seqidno：11)：

icp4基因的启动子(seqidno：12)：

i型单纯疱疹病毒17+株基因组icp34.5上游(up-stream，us)和下游(down-stream，ds)的侧翼序列：

icp34.5上游侧翼序列(seqidno：13)：

icp34.5下游侧翼序列(seqidno：14)：

i型单纯疱疹病毒17+株基因组icp4promoter上游(up-stream,us)和下游(down-stream，ds)的侧翼序列：

icp4promoter上游的侧翼序列(seqidno：15)：

icp4promoter下游的侧翼序列(seqidno：16)：

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。

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<110>湖北科技学院

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