一种猪圆环病毒三价亚单位疫苗的制作方法

本发明属于生物技术基因工程领域，主要涉及一种猪圆环病毒三价亚单位疫苗制备与应用。具体地，利用基因重组技术，将猪圆环病毒3型cap蛋白与筛选的猪圆环病毒2型和1型cap蛋白b细胞及t细胞表位串联并克隆入载体，转化宿主菌，经过发酵、纯化、制剂等工艺，得到一种猪圆环病毒三价亚单位疫苗以及该疫苗在预防猪圆环病毒导致的多种疾病中的应用。
背景技术：
猪圆环病毒(porcinecircoviruses，pcv)是单股环状的dna病毒，基因组长度约为1.7kb长，是最小的动物dna病毒之一。已经确定有两种类型的pcv，即圆环病毒1型(pcv1)和圆环病毒2型(pcv2)。pcv1于1974年首次在pk细胞培养物中作为一种污染物鉴定，其对猪只没有致病性。pcv2于1998年首次报道，其在临床条件下能引起猪只的猪圆环病毒相关疾病(porcinecircovirusassociateddiseases，pcvad)，主要引起仔猪多系统衰竭综合征，肺炎，猪皮炎和肾病终合症和繁殖障碍，主要表现为呼吸、泌尿、肠道、淋巴、心血管、神经、繁殖系统以及皮肤的功能紊乱，它是影响生猪产业的最具破坏性的疾病之一，并在全球范围内造成重大经济损失。2016年发现了一种新的猪圆环病毒，猪圆环病毒3型(pcv3)。第一次记录的事件发生在美国2至3周和9至10周的猪中，这些猪具有多系统炎症和未确定病因的心脏病理病征，临床表现为感染仔猪消瘦、关节肿胀、呼吸系统疾病和母猪繁殖障碍等。在猪皮炎和肾病综合征(pdns)的母猪以及从这些母猪中流产的木乃伊胎儿中也检测到pcv3。此外，在48份存档的pdns组织样本中的45份中发现pcv3，并且通过实时pcr(qpcr)在从呼吸疾病病例收集的271份样品中的34份中检测到pcv3。在中国，pcv3在呼吸道疾病和发热的小猪中检测到，这些仔猪对pcv2，猪生殖和呼吸综合征病毒以及奥耶斯基病病毒也呈阴性。此外，巴西、波兰、德国、韩国、泰国、英国等国家的流行病学研究也发现了猪圆环病毒3型。pcv3可以从不同的猪组织中检测得出，死胎和精液样本中的pcv3阳性检测结果表明pcv3具有垂直传播的风险。基因组序列分析发现pcv3基因组包含2000碱基，具有与pcv1和pcv2相似的基因组结构，主要编码cap和rep两个基因。cap基因编码214个氨基酸残基，较pcv2少19～20个，此外，pcv2和鸭圆环病毒相比，相似性仅为36～37％。发明概述本发明以猪圆环病毒3型不同流行毒株的共有保守cap蛋白、猪圆环病毒2型的b细胞表位和猪圆环病毒1型的t细胞表位作为疫苗结构，在大肠杆菌中表达后，经过蛋白纯化、制剂等工艺，获得具有理想免疫原性的猪圆环病毒三价亚单位疫苗。本疫苗免疫靶动物后可诱导有效体液免疫和细胞免疫反应。本发明的目的之一在于提供了一种新的能够激发体液免疫、细胞免疫的猪圆环病毒三价亚单位疫苗多肽及其疫苗组合物，疫苗组合物可用于预防猪圆环病毒引发的相关疾病；本发明的目的之二在于提供了所述猪圆环病毒三价亚单位疫苗的构建及获得方法；本发明的目的之三在于提供了能够表达所述猪圆环病毒三价亚单位疫苗的基因工程菌株；本发明的目的之四在于提供了所述猪圆环病毒三价亚单位疫苗的制备方法；本发明的目的之五在于提供了所述圆环病毒三价亚单位疫苗在预防猪圆环病毒病中的用途。在第一方面，本发明提供了一种用于预防的重组猪圆环病毒三价亚单位疫苗多肽及其组合物。其含有猪圆环病毒3型不同流行毒株的共有保守cap蛋白、猪圆环病毒2型的b细胞表位和猪圆环病毒1型的t细胞表位。b细胞表位、t细胞表位是指具有免疫原性的主要核衣壳蛋白中的一部分多肽或其具有基本相同免疫原性功能的等价物。串联可以通过遗传工程方法或人工合成进行，重组猪圆环病毒三价亚单位疫苗中除了含有主要核衣壳蛋白抗原表位，还包含非免疫活性物质。所述非免疫活性物质为各多肽的连接部分，不具有核衣壳蛋白抗原免疫原性，也不具有任何佐剂活性，主要有接头肽、化学修饰部分、n端信号肽和c端多聚腺苷酸等。所述药学上可接受的盐是指无毒性、刺激和变态反应，适用于人或动物组织的盐。非活性物质和药学上可接受的盐为本领域技术人员所熟知。优选在本发明第一方面的重组猪圆环病毒三价亚单位疫苗多肽中所述的主要核衣壳蛋白抗原及其表位序列分别选自猪圆环病毒3型不同流行毒株的共有保守cap蛋白、猪圆环病毒2型的b细胞表位和猪圆环病毒1型的t细胞表位。另外优选，本发明第一方面所述重组猪圆环病毒三价亚单位疫苗多肽的氨基酸序列如下：(1)猪圆环病毒3型不同流行毒株的共有保守cap蛋白(seqidno.4)：(2)猪圆环病毒2型的b细胞表位1氨基酸序列为be1(seqidno.6)：vdmmrfnindflppgggsnp；(3)猪圆环病毒2型的b细胞表位2氨基酸序列为be2(seqidno.8)：vpfeyyrirkvkvefwpcspitqgdrgv；(4)猪圆环病毒2型的b细胞表位3氨基酸序列为be3(seqidno.10)：(5)猪圆环病毒2型的b细胞表位4氨基酸序列为be4(seqidno.12)：tmyvqfrefnlkdpplnp；(6)猪圆环病毒1型的t细胞表位1氨基酸序列为te1(seqidno.14)：pylahpafrnryrwrrktgifngsgefvltik(7)猪圆环病毒1型的t细胞表位2氨基酸序列为te2(seqidno.16)：(8)猪圆环病毒1型的t细胞表位3氨基酸序列为te3(seqidno.18)：(9)猪圆环病毒1型的t细胞表位4氨基酸序列为te4(seqidno.120)：基于疫苗激发免疫反应机理和疫苗本身生物化学特性考虑，更佳的肽片段组合次序为：pcv3cap-pcv2be1-pcv2be2-pcv2be3-pcv2be4-pcv1te1-pcv1te2-pcv1te3-pcv1te4。因此，重组猪圆环病毒三价亚单位疫苗多肽氨基酸序列如下：在第二方面，本发明提供了一种核苷酸分子，其编码本发明第一方面所述的重组猪圆环病毒三价亚单位疫苗多肽。本发明中核苷酸可以是rna形式，dna形式，通过人工合成方式合成多抗原表位串联序列，然后经过基因工程操作连接后克隆入载体，转化入大肠杆菌，筛选、发酵、纯化后获得重组猪圆环病毒三价亚单位疫苗多肽。在本发明中可以对该核酸进行常规的分子生物学操作，如：pcr、限制性内切酶酶切、连接等，核酸设计5’端和3’端均加入酶切位点。优选本发明中的核苷酸序列如下：注：方框内为酶切位点。在第三方面，本发明提供了一种载体，其除了含有本发明第二方面所述的编码重组猪圆环病毒三价亚单位疫苗核苷酸分子，还含有与该核苷酸序列可操作的连接，在原核细胞表达(转录和翻译)所需的表达控制元件。最基本的表达控制元件包括启动子、转录终止子、增强子，选择性标记等，这些调控元件为本领域所熟知。本发明中优选prsetb作为目的基因的表达载体。在第四方面，本发明提供了一种宿主细胞，其含有本发明第三方面所述的载体。宿主细胞经转化或转染含有本发明所述编码蛋白的基因序列，而后经检测具有良好的的遗传和表达稳定性后，可用于发酵表达生产所需的重组猪圆环病毒三价亚单位疫苗抗原。本发明中优选大肠杆菌bl21(de3，plys)作为目的蛋白表达用宿主菌。在第五方面，本发明提供了一种重组猪圆环病毒三价亚单位疫苗的制备方法，其包括以下步骤：工程菌发酵表达重组猪圆环病毒三价亚单位疫苗多肽，经过粗纯化与精细纯化工艺以及后续配苗工艺，获得所需要的重组猪圆环病毒三价亚单位疫苗。其中涉及的方法包括但不限制于菌体破碎、包涵体洗涤、离心、变性、亲和层析、疏水层析、阴离子交换色谱、反相色谱、复性、乳化等。在第六方面，本发明提供了一种用于预防重组猪圆环病毒三价亚单位疫苗，其包括本发明第一方面所述的多肽以及药学上可接受的载体。所述重组猪圆环病毒三价亚单位疫苗能够预防猪圆环病引起的综合征。本发明所述的药学上可接受的载体为免疫增强剂或免疫佐剂，优选免疫佐剂为水包油包水佐剂。在第七方面，本发明提供了第六方面所述的重组猪圆环病毒三价亚单位疫苗的应用。疫苗可以一定有效剂量肌肉注射，皮内或皮下注射接种动物，优选肌肉注射能够产生足够有效的体液免疫和细胞免疫反应(见实施例五、六、七、八、九、十、十一、十二)，刺激igg的产生，诱导ifnγ产生，同时提供抗病毒活性，减少病变反应，保护动物免于猪圆环病毒的攻击。此外，在本发明的实施方案中，通过对疫苗进行实验室安全性试验，表明本发明所述的重组猪圆环病毒三价亚单位疫苗是安全的(见实施例四)。另外，需要指出的是，在本申请的上下文的公开内容的基础上，本发明的其他具有实质性特点的方面对本领域的普通技术人来说是显而易见的。此外，本发明亦使用了公开文献，他们的全文内容均纳入本文进行参考。附图说明下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。图1重组猪圆环病毒三价亚单位疫苗表达质粒prsetb-pcv(3/2/1)构建图；图2prsetb-pcv(3/2/1)载体质粒酶切图，其中泳道1为dnamarker，从上至下分子量依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp，泳道2为空白对照，泳道3为完整质粒，泳道4为酶切质粒；图3sds-page检测图，其中泳道1为未诱导对照样品，泳道2为蛋白marker，从上至下依次为175kda、80kda、58kda、46kda、30kda、25kda、17kda、7kda，泳道3为诱导样品，箭头所指为表达的目的蛋白；图4western-blot检测图，其中泳道1为预染marker，从上至下依次为99kda、70kda、43kda、31kda、24kda、15kda，泳道2为阴性对照，泳道3为目的蛋白。图5为发酵样品sds-page图：其中泳道1为蛋白marker，从上至下依次为175kda、80kda、58kda、46kda、30kda、25kda、17kda、7kda，泳道2为未诱导对照，泳道3为阳性对照，泳道4为发酵诱导样品；图6为发酵样品western-blot检测图，其中泳道1为预染marker，从上至下依次为99kda、70kda、43kda、31kda、24kda、15kda，泳道2为阴性对照，泳道3为阳性对照泳道，泳道4为发酵纯化样品。图7为elisa方法检测疫苗pcv1igg抗体结果；图8为elisa方法检测疫苗pcv2；图9为elisa方法检测疫苗pcv3igg抗体结果；图10免疫动物血清中ifn-gamma检测结果。具体实施方式实施例中所述的具体试验方法描述仅是示例性描述，用于详细阐述本发明，但并不构成对本发明范围的限制。实施例一重组猪圆环病毒三价亚单位疫苗蛋白的设计思路本发明根据目前猪圆环病毒3型不同流行毒株的共有保守cap蛋白、猪圆环病毒2型的b细胞表位和猪圆环病毒1型的t细胞表位分析。将所设计表位串联后在大肠杆菌中表达，经过发酵、纯化、制剂等工艺，获得具有理想免疫原性的重组猪圆环病毒三价亚单位疫苗。利用本发明制备的疫苗可以有效预防猪圆环病毒引起的综合征。综合分析国内猪圆环病毒3型、2型、1型流行株基因组序列、抗原结构、流行病学研究进展，对重组猪圆环病毒三价亚单位疫苗进行了优化设计，最终确定猪圆环病毒3型不同流行毒株的共有保守cap蛋白一段，pcv2b细胞表位4段，pcv1t细胞抗原表位4段，将所有表位串联后形成疫苗的骨架结构。该疫苗的总体结构为：pcv3cap-pcv2be1-pcv2be2-pcv2be3-pcv2be4-pcv1te1-pcv1te2-pcv1te3-pcv1te4。实施例二大肠杆菌表达载体与表达菌株的构建1将设计好的多肽编码核苷酸送上海英俊生物技术公司合成，核苷酸片段两端分别设计了bamhi(5’端)和hindiii(3’端)限制性酶切位点，把这片段合成后分别克隆到pmd18t载体上，序列测定证实插入基因片段与设计序列一致(见序列表)。将重组质粒分别命名为pmd18t-pcv(3/2/1)。用相应的限制性内切酶将质粒进行酶切处理，大肠杆菌表达载体选用invitrogen公司的prsetb质粒，也使用相同的限制性内切酶处理，酶切条件：10μl反应体系，体系内加入2μl质粒，限制性内切酶为5个活性单位(newenglandbiolabs)，加入10×缓冲液1μl，去离子水补齐，37℃酶切1.5小时。酶切结束后加入1μl200mmedta终止反应。在1％琼脂糖凝胶电泳中，电泳30分钟。紫外灯下将2.85kbprsetb质粒和1614bppcv(3/2/1)片段切下，按照qiagen公司凝胶回收试剂盒说明书进行胶回收。按照载体：片段1∶2～3的比例将多表位核苷酸片段单独和表达载体混合，反应体系15μl，由t4dna连接酶进行连接，16℃连接过夜，获得重组质粒命名为prsetb-pcv(3/2/1)，(见图1)，转化感受态大肠杆菌bl21(de3)plyss。2转化：将prsetb-pcv(3/2/1)置冰上融化，加入2μl连接反应液，再次混匀，冰水浴30分钟，42℃30秒，然后迅速放回冰浴1.5分钟，加入1mllb培养液，37℃，静置培养1小时，4000g低温离心10秒钟弃上清，用200μllb培养基重悬菌体；将菌液均匀涂布于含有100μg/ml氨苄青霉素的lb琼脂培养板上，倒置于37℃恒温箱中培养12～16小时，直至克隆形成。3鉴定：挑取平板上的单克隆至lb培养基中，37℃，200rpm震荡培养12小时，提取质粒，分别使用内切酶bamhi和hindiii进行双酶切，可以切出相应猪圆环病毒三价亚单位疫苗基因大小片段的克隆，1614bp，可初步确定为阳性克隆(见图2)；阳性克隆进行dna序列测定进一步验证其正确性(见序列表)。4诱导表达。即将阳性克隆过夜培养，次日早上按1∶100转接，培养3小时后，加入0.1mmiptg，继续培养4小时，制备样品；常规sds-page检测目的蛋白表达情况——在65kd(见图3)，见到特异性条带为正确克隆；取正确克隆，放大培养，sds-page证实表达正确后，使用常规western-blot进一步证实其表达准确性(见图4)；经过上述构建及鉴定程序后，可将挑选的阳性克隆作为工程菌进行原始种子库的建立，菌种命名prsetb-pcv(3/2/1)/bl21(de3，plys)。实施例三工程菌的发酵、纯化与制剂1发酵取生产菌种prsetb-pcv(3/2/1)/bl21(de3，plys)，接种于2mllb液体培养基中(含100μg/ml氨苄青霉素)，37℃，200rpm振荡培养12小时活化菌种。再以1∶100的接种量接入摇瓶，37℃振荡培养至od600＝3，可按10％比例接种入发酵罐。发酵用培养基为半合成培养基，用蒸馏水配制。校正溶氧和ph值电极，开启罐体搅拌，转数为300rpm，罐体在线灭菌，待罐内培养液温度降至37.0℃时，标定ph及溶氧(od)零点。发酵温度为37.0±0.1℃，溶氧控制在40％左右，ph控制在7.0，接种后培养菌体od600＝1.0～1.2时流加补料500ml，补料后1小时加入iptg(终浓度为0.2mm)诱导表达，连续诱导5个小时后发酵结束，取样做sds-page鉴定表达情况(见图5)。2纯化将收集到的菌体，用包含体洗液i(1％tritonx-100，20mmtris-clph8.0)混悬后进行超声，2000w超声裂解1小时。4℃，12000rpm离心收集包含体，并用包含体洗液ii(1％doc，4m尿素，20mmtris-clph8.0)混悬二次超声洗涤包含体，二次低温离心收集包含体。包含体沉淀用8m尿素，0.3％β-me，20mmtris-cl(ph＝8.00)混匀，室温搅拌4小时，8000rpm低温离心30min，弃去沉淀。变性蛋白1∶100稀释，复性液用tris(ph8.0)缓冲体系，加入0.3m精氨酸，4℃搅拌复性24小时。复性液用ph＝8.0的20mm磷酸缓冲液，0.5m氯化钠，20mm咪唑，平衡上亲和层析柱，用ph＝8.0的20mm磷酸缓冲液，0.5m氯化钠，0.5m咪唑洗脱；即得重组猪圆环病毒三价亚单位疫苗半成品原液，取半成品原液做western-blot鉴定(见图6)。3制剂将纯化的半成品用灭菌的pbs稀释至300μg/ml，206油佐剂经过121℃，灭菌15分钟，备用。按佐剂∶疫苗＝1∶1的比例配制，80～100r/min的速度缓慢搅拌，混匀无菌分装后即可用于免疫。实施例四重组猪圆环病毒三价亚单位疫苗安全性试验1材料1.1疫苗：重组猪圆环病毒三价亚单位疫苗由青岛明勤生物研发中心提供，批号为201701、201702、201703。1.2试验动物：18-22gbalb/c小白鼠购自北京华阜康。20～30日龄健康仔猪(elisa方法检测pcv1、pcv2、pcv3抗体阴性，pcr方法检测pcv1、pcv2、pcv3抗原阴性)由广东永顺制药提供。2方法2.1疫苗对小白鼠的安全性18-22gbalb/c小白鼠，每批疫苗免疫5只，共三个批次，免疫15只小白鼠，免疫方法为：每只皮下注射0.5ml，同时设定2只空白对照，连续观察10天，观测小白鼠的健康状况。2.2疫苗对仔猪的安全性选择20～30日龄健康仔猪，重组猪圆环病毒三价亚单位疫苗，每批次5头，共三个批次，免疫15头仔猪。免疫方法为：每头猪耳后肌肉注射2ml，同时设立空白对照5头，临床观察14天。3结果3.1疫苗对小白鼠的安全性试验结果如表1，免疫后，所有小鼠的食欲、精神和健康状况无异常，与空白对照组一致，无死亡发生，可见重组猪圆环病毒三价亚单位疫苗对小白鼠是安全的，见表1。表1疫苗对小白鼠的安全性试验结果组别动物数量体温食欲精神健康状况死亡数量2017015只正常正常正常健康状况良好02017025只正常正常正常健康状况良好02017035只正常正常正常健康状况良好0对照2只正常正常正常健康状况良好03.2疫苗对仔猪的安全性试验结果如表2，整个试验观察期14天内，所有免疫的仔猪，体温、精神和食欲均正常，没有出现任何临床异常现象，试验结束后，15头仔猪均健活。空白对照组的5头仔猪也无任何不良反应。这说明，重组猪圆环病毒三价亚单位疫苗对仔猪是安全的。表2疫苗对仔猪的安全性试验结果组别动物数量体温食欲精神异常状况死亡数量2017015头正常正常正常无02017025头正常正常正常无02017035头正常正常正常无0对照5头正常正常正常无0实施例五重组猪圆环病毒三价亚单位疫苗效力试验动物分组、免疫、评价方法1试验动物20～30日龄健康仔猪(elisa方法检测pcv1、pcv2、pcv3抗体阴性，pcr方法检测pcv1、pcv2、pcv3抗原阴性)，试验猪在开始试验前环境适应一周。2疫苗重组猪圆环病毒三价亚单位疫苗由青岛明勤生物研发中心提供，批号为201701、201702、201703。3试验设计与方法3.1用20～30日龄健康仔猪45头(elisa方法检测pcv1、pcv2、pcv3抗体阴性，pcr方法检测pcv1、pcv2、pcv3抗原阴性)，分为3组，第一组为免疫攻毒组30头，每个批次疫苗免疫10头猪，第2组为非免疫攻毒组10头，第3组为空白对照组(非免疫、非攻毒)5头。免疫后0天、7天、14天、21天、28天，对试验动物采血备用。免疫后28天对每个批次免疫组随机选5头猪，每头猪经滴鼻和肌肉注射各接种2ml猪圆环病毒2型gd-sg-09株(病毒含量为1.0×107.0tcid50/ml)，每批次剩余5头猪接种猪圆环病毒3型，每头经猪滴鼻和肌肉注射圆环病毒3型sd-hz-17株(病毒含量为1.0×105.0tcid50/ml)。攻毒后观察试验仔猪的采食、饮水、精神、粪便、死亡情况，检测肛温并记录。对死亡仔猪进行剖检。攻毒后28日，宰杀所有仔猪，取腹股沟淋巴结和肠系膜淋巴结，进行病理切片检测。3.2抗体滴度及ifnγ检测采集免疫组和对照组在免疫后0天、7天、14天、21天、28天的血清，通过elisa方法检测进行免疫抗体igg的检测以及ifnγ浓度检测；3.3肛温攻毒前两天至攻毒后14天每天记录肛温；3.5攻毒保护率3.5.1发病标准临床观察结果异常连续超过三天，或者肛温连续三天超过40℃判为发病，死亡判为发病，剖检可见明显病理病变判为发病。3.5.2判定标准实验猪攻毒保护指数小于80％为无保护，大于或等于80％为有保护，再按以下公式计算试验猪攻毒保护率：实验猪攻毒保护率＝有保护试验猪数/试验猪总数。实施例六血清评价：igg抗体滴度检测用elisa方法对实验动物疫苗免疫后0天、7天、14天、21天、28天的血清抗体igg进行检测。pcv1、pcv2及pcv3igg变化规律见图7、图8、图9。三批疫苗，在免疫后0天、7天无抗体检出。免疫后14天均可以检测到低水平的抗体。在免疫后28天，可以检测到外周血内含有较高滴度的pcv1、pcv2和pcv3抗体滴度，相比非免非攻对照组，差异均显著(p＜0.05)。实施例七免疫动物ifnγ浓度检测常规方法采集免疫后0天、7天、14天、21天、28天实验动物血清，按照羊抗猪ifnγelisa检测试剂盒说明书对采集的血清进行ifnγ浓度检测。结果显示，疫苗免疫后，随着免疫时间增加，ifnγ浓度持续上升，免疫后28天浓度较高；而非免非攻对照组的试验猪ifnγ浓度始终保持较低的浓度(见图10)。实施例八攻毒后临床观察及肛温测量自攻毒前两天至攻毒后至14天测量肛温变化。猪圆环病毒2型gd-sg-09株免疫攻毒组所有免疫动物无体温升高现象。非免攻毒对照组有2头物体温连续三天检测正常，非免攻毒对照组有4头试验动物体温超过40℃，且有3头连续三天超过40℃。整个攻毒期间疫苗免疫组所有试验动物均未出现明显的临床症状，非免疫攻毒对照组从攻毒后的3天开始逐渐表现食欲减退、精神萎靡、活动不佳等临床表观症状。实施例九淋巴结病理切片切片结果显示：猪圆环病毒2型gd-sg-09株免疫攻毒组所有免疫动物未见明显淋巴结病理病变；非免攻毒对照组有4头实验动物可见明显的淋巴结病理病变。猪圆环病毒3型sd-hz-17株免疫攻毒组1头免疫动物见明显淋巴结病理病变；非免攻毒对照组有5头实验动物可见明显的淋巴结病理病变。实施例十二疫苗保护率判定将动物攻毒试验结果汇总见表3，整个实验过程无仔猪死亡发生。依据发病和判定标准，三个批次的疫苗免疫组实验动物针对的猪圆环病毒2型gd-sg-09株的保护率均为5/5，针对猪圆环病毒3型sd-hz-17株的保护率为分别为5/5、4/5、5/5，两个非免攻毒对照组分别为4/5、5/5发病。表3攻毒攻毒试验结果及判定当前第1页12