一种减毒棒状病毒的制备方法及应用与流程

本公开涉及肿瘤学、病毒学和分子细胞生物学领域。具体来说，本公开涉及一种使用非整合、可复制的负义链rna病毒的载体系统及其构建方法，以及通过上述方法构建的载体的用途。
背景技术：
：过去十年里，癌症患者治疗方案的选择范围发生了巨大的变化。随着对肿瘤生长和发展相关驱动突变(drivermutation)的认识、加上这些特定突变靶向分子抑制剂研发工作的开展，一个新的肿瘤治疗领域即精准肿瘤学随之而生，肿瘤免疫治疗的理论基础是免疫系统具有识别肿瘤相关抗原、调控机体攻击肿瘤细胞(高度特异性的细胞溶解)的能力。这个生物过程十分复杂，目前仍处于大量的基础研究之中。上世纪90年代，多个科研小组已经发现了肿瘤抗原，t淋巴细胞可以通过主要组织相容性复合体依赖性方式识别这些肿瘤抗原。在某些情况下，抗原通常指病毒蛋白、突变的自体抗原(其中一些是驱动致癌基因)、去阻遏胚胎抗原、过表达的已分化或自体正常蛋白。肿瘤细胞以多种途径产生并释放抗原，例如细胞内激酶，肿瘤细胞原发性坏死，放疗、化疗或靶向治疗的机体反应。除了抗原外，在细胞应激、缺氧、营养物质枯竭和创伤的环境中，死亡的肿瘤细胞也可以释放多种免疫原性的分子，这些分子可以与细胞表面或细胞内受体(例如toll样受体)结合，从而触发先天免疫反应。此外，肿瘤微环境中的特异性抗原递呈细胞(例如树突细胞)可以吞噬死亡的肿瘤细胞和可溶性抗原，cd8+t细胞。为了达到更好的区分效果，t细胞激活还设置了二级信号识别系统，一种由共刺激分子介导的信号通路。一旦在共刺激分子存在的情况下被激活，t细胞可以循着局部趋化因子的浓度梯度迁移到肿瘤微环境中。t细胞到达肿瘤细胞附近后，t细胞受体可以通过i型mhc-多肽复合物识别肿瘤细胞表面的同源抗原。t细胞可以释放细胞毒性因子(例如granzymeb和perforins)，这些细胞毒性因子可以调控抗原-表达性肿瘤细胞的直接溶解，同时对毗邻的无抗原-表达性肿瘤细胞产生旁观者效应。有些肿瘤的微环境中存在大量的激活型效应淋巴细胞，这些肿瘤一般有较好的预后，而且对免疫治疗有较好的治疗响应，尽管存在肿瘤-免疫循环，但是已经成形的肿瘤可能通过多种宿主、肿瘤和免疫机制逃脱宿主的免疫侦测和清除。此外，有研究报道肿瘤微环境会聚集大量的抑制性免疫细胞，例如调控性cd4+阳性t细胞、肿瘤相关巨噬细胞、髓样抑制细胞，这些免疫细胞可以抑制激活型效应t细胞的活性。肿瘤细胞以何种方式死亡可能决定了何种免疫反应会被激活。例如，肿瘤细胞凋亡可能会诱发t细胞耐受，而肿瘤细胞坏死或焦亡(pyroptosis)、程序性细胞死亡可能会诱发激活型肿瘤特异性t细胞反应癌症长期居于各种死因之首。世界卫生组织早就预测21世纪恶性肿瘤将成为人类的“第一杀手”，故癌症控制已成为全球性的卫生战略重点。我国虽是发展中国家，但疾病谱已发生转变，中国已成为世界第一癌症大国。近年来，恶性肿瘤发病和死亡情况更加严重，年新发病例约为160万，死亡达130万，现症病人200多万。而且，多数癌症还将呈上升趋势，值得高度重视。虽然若干恶性肿瘤的治愈率已得到显著改善，但在过去的数十年中晚期实体瘤患者的结果仍残酷地维持不变。目前已经投入到实体瘤临床使用的就是肿瘤免疫检查点的抗体，例如pd-1/pdl1和ctla4的抗体治疗，这些有效拮抗免疫检查点分子的单克隆抗体的关键点在于单位体积有效产能，除此之外，免疫检查点抗体面临耐药性的问题亟待解决，目前肿瘤免疫治疗的研究进展受到各国关注。衍生出包括t细胞节点抑制剂、溶瘤病毒、嵌合抗原受体t细胞等多种免疫相关的肿瘤治疗策略。众所周知，高效的免疫疗法需要具备以下几大特点：诱导产生持久的临床反应；没有典型的耐药性；诱导产生自体免疫样毒性。临床肿瘤学家需要深入了解肿瘤靶向治疗和肿瘤免疫治疗的临床应用现状，只有这样才能为癌症患者提供高质量的治疗方案。肿瘤免疫治疗的理论基础是免疫系统具有识别肿瘤相关抗原、调控机体攻击肿瘤细胞(高度特异性的细胞溶解)的能力。一些基因编辑修饰的重组病毒作为一种新的肿瘤治疗制剂，通过病毒对肿瘤细胞的杀伤作用和诱导全身性抗肿瘤免疫反应两种作用机制引发抗肿瘤免疫反应。但是，其具体的分子机制尚不明确，部分已有的研究结果显示机制是病毒在肿瘤细胞中的复制增殖而诱导细胞死亡、与肿瘤细胞抗病毒元件的相互作用、促进内在自发的或特异性抗肿瘤免疫反应等多种作用因素共同作用。水疱性口炎病毒(vsv)是一种负链rna病毒，其感染大部分哺乳动物细胞并在受感染细胞中表达高达总蛋白60％的病毒蛋白。在自然界中，vsv感染猪、牛和马，并在口和足附近导致水痘性疾病。虽然已有报道人感染vsv，但是vsv在人类中没有导致任何严重的症状。vsv编码5种蛋白，包括核壳蛋白(n)、磷蛋白(p)、基质蛋白(m)、表面糖蛋白(g)和rna依赖性rna聚合酶(l)。由vsv基质蛋白(m)阻断宿主细胞蛋白合成会诱导细胞死亡。但是，现有技术中存在的药品仍然面临用药周期长、具有耐药性、价格昂贵等诸多不足之处。因此，需要提供新的药物以克服上述缺陷。技术实现要素：发明要解决的问题基于现有技术的不足，本公开提供了一种嵌合表达针对特定靶点的抗体的减毒rna病毒重组表达载体系统，具体为靶向肿瘤微环境的减毒病毒载体系统(attenuatedvirusvectorsystemtargetingtumormicroenvironment，avtm系统)。前述载体系统可以稳定表达针对特定靶点的相应抗体。与此同时，本公开还涉及上述减毒病毒载体系统的制备方法和应用。用于解决问题的方案本公开涉及的技术方案如下。(1)一种减毒病毒载体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(s1)将如seqidno:1所示(vsv的m基因)的编码水疱性口炎病毒基质蛋白的基因的核苷酸序列和第一载体混合，加入转座酶进行转座反应；(s2)将步骤(s1)得到的转座产物和感受态细菌混合，进行转化；(s3)提取通过步骤(s2)得到的细菌的质粒，得到转座后的所述编码水疱性口炎病毒基质蛋白的基因；(s4)将步骤(s3)得到的所述基因重组至第二载体中，得到所述减毒病毒载体；其中，所述编码第二载体的序列包含水疱性口炎病毒的基因组序列；其中，所述第一载体选自具有转座功能的载体；可选的，所述第一载体包含如seqidno:2所示的序列；可选的，所述第二载体包含如genebank编号为eu849003.1所示的序列。(2)一种减毒病毒载体，其通过(1)所述的制备方法得到。(3)根据(2)所述的减毒病毒载体，其特征在于，所述编码减毒病毒载体的序列包含如seqidno：3所示的序列。(4)根据(3)所述的减毒病毒载体，其特征在于，所述编码减毒病毒载体的序列包含如seqidno：4所示的序列。(5)一种克隆骨架载体系统，其特征在于，所述克隆骨架载体系统将如seqidno:5所示的序列重组至如(3)所述的载体中；其中，所述seqidno:5所示的序列插入编码如(3)所述的载体的位点为如seqidno：4所示的序列的第4632位。(6)根据(5)所述的克隆骨架载体系统，其特征在于，编码所述克隆骨架载体系统的序列包含如seqidno:6所示的序列。(7)一种制备减毒单克隆病毒株的方法，其特征在于，包括如下步骤：(s1)培养第一待转染细胞；(s2)将包含如seqidno:3所示的序列的质粒，和包含如seqidno:7所示的序列的质粒(pn)，包含如seqidno:8所示的序列的质粒(pl)，包含如seqidno:9所示的序列的质粒(pp)的质粒混合物，共转染至步骤(s1)中的待转染细胞中；(s3)提取步骤(s2)共转染后得到的细胞混合液中的上清液，转染至第二待转染细胞细胞中；(s4)将步骤(s3)中被转染后的第二待转染细胞进行培养，筛选，得到减毒单克隆病毒株。(8)根据(7)所述的方法，其中，包含如seqidno:3所示的序列的质粒，包含如seqidno:7所示的序列的质粒(pn)，包含如seqidno:8所示的序列的质粒(pl)和包含如seqidno:9所示的序列的质粒(pp)的重量比为10:4:1:5。(9)根据(7)-(8)任一项所述的方法，其中，所述包含如seqidno:3所示的序列的质粒为包含如seqidno:4所示的序列的质粒；可选的，所述第二待转染细胞选自vero细胞；所述第一待转染细胞选自bsr-t7细胞；(10)根据(9)所述的方法，其中，步骤(s2)中所述包含如seqidno:4所示的序列的质粒选自包含如seqidno:6所示的序列的质粒。(11)根据(10)所述的方法，其中，步骤(s2)中所述包含如seqidno:6所示的序列的质粒的编码序列进一步包含如seqidno:10所示的序列和如seqidno:11所示的序列。(12)根据(10)所述的方法，其中，步骤(s2)中所述包含如seqidno:6所示的序列的质粒的编码序列进一步包含如seqidno:12所示的序列。(13)根据(12)所述的方法，其中，所述包含如seqidno:12所示的序列的5’端还包含信号肽序列；所述信号肽序列选自如seqidno:13，seqidno:14，seqidno:15或seqidno:16所示的序列；优选的，所述信号肽序列选自如seqidno:15所示的序列。(14)根据(7)-(13)任一项所述的制备减毒单克隆病毒株的方法制备得到的减毒单克隆病毒株。(15)根据(14)所述的减毒单克隆病毒株分泌的单克隆抗体。(16)一种单克隆抗体，其包含由如seqidno:4所示的序列、如seqidno:10所示的序列和如seqidno:11所示的编码序列编码的片段。(17)根据(16)所示的单克隆抗体，其中，所述包含如seqidno:4所示的序列选自包含如seqidno:6所示的序列。(18)根据(17)所示的单克隆抗体，其中，所述编码序列还包含如如seqidno:13，seqidno:14，seqidno:15或seqidno:16所示的序列；优选的，所述编码序列还包含如seqidno:15所示的序列。(19)一种药物组合物，其特征在于，包含(15)-(18)任一项所述的单克隆抗体。(20)根据(15)-(18)任一项所述的单克隆抗体或(19)所述的药物组合物在制备用于杀死异常增生性细胞、诱导促进抗肿瘤免疫反应或消除肿瘤组织微环境免疫抑制的药物中的应用。(21)根据(20)所述的应用，其中所述异常增生性细胞被包含在患者体内。(22)根据(21)所述的应用，其中所述异常增生性细胞选自肿瘤细胞或肿瘤组织相关细胞；优选的，所述肿瘤细胞是癌细胞；更优选的，所述癌细胞是转移性癌细胞。(23)—种缓慢持续杀伤异常增生性细胞的方法，其特征在于，包括将所述异常增生性细胞与(15)-(18)任一项所述的单克隆抗体或(19)所述的药物组合物接触的步骤。(24)根据(23)所述的方法，其中所述异常增生性细胞被包含在患者体内。(25)根据(23)所述的方法，其中所述异常增生性细胞选自肿瘤细胞或肿瘤组织相关细胞；优选的，所述肿瘤细胞是癌细胞；更优选的，所述癌细胞是转移性癌细胞。(26)根据(23)所述的方法，其中(15)-(18)任一项所述的单克隆抗体或(19)所述的药物组合物被施用至患者体内。(27)根据(23)所述的方法，其中(15)-(18)任一项所述的单克隆抗体或(19)所述的药物组合物通过包括腹膜内、静脉内、动脉内、肌肉内、皮肤内、瘤内、皮下或鼻内给药中的一种或多种的给药方式而被施用；优选的，所述给药方式的给药途径包括内镜、腔镜、介入、微创、传统手术中的一种或多种。(28)根据(23)所述的方法，所述方法进ー步包括施用第二抗肿瘤疗法的步骤。(29)根据(28)所述的方法，其中所述第二抗肿瘤疗法选自化学疗法、放射疗法、免疫疗法、手术疗法中的一种或多种。(30)一种多核苷酸，其特征在于，包含如seqidno:6所示的序列。发明的效果本公开的avtm载体系统的宿主细胞来源广泛。因为该病毒系统表面糖蛋白(g)的存在，不需要特定的受体介导就能进入宿主细胞，能够感染几乎所有的哺乳动物的细胞，还能够同时完成病毒复制和实现外源嵌合基因的高效表达，因此，极大的提高了外源嵌合的类抗体的体内外的表达效率。本公开涉及的avtm减毒载体系统对应的棒状病毒的基因组是单股负链rna，同时该系统的外源基因的表达是非常稳定的，该减毒病毒载体系统在细胞中不会发生基因组整合，病毒载体系统本身的基因组简单且稳定，突变率低。本公开涉及的系统能够快速高效嵌合表达人源的特异性抗体，在肿瘤细胞中完成特异性复制的同时，表达外分泌拮抗肿瘤细胞的特异性抗体。与此同时，在释放肿瘤抗原激活免疫细胞抗肿瘤的特异性免疫应答的同时，大量的去免疫抑制的特异性抗体在短时间内在肿瘤局部微环境聚集，有效打破区域免疫抑制屏障，激活t细胞的特异性杀伤活性，促进杀伤性t细胞对肿瘤细胞的清除，同时促进机体产生系统性的特异性抗肿瘤免疫记忆反应。本公开的avtm的基因由于进行了基因突变改造，使得病毒的毒性降低，在37℃表达抗体时不会对宿主的正常细胞不产生明显的损伤，因此，受感染的细胞在一段时间内能够持续表达分泌型抗体。相反的，对于传统转染的骨髓瘤细胞，用于表达特异性抗体的细胞株，则需要复制到高数量级时才能用来规模化生产抗体。在一个技术方案中，本公开将编码免疫检查点分子的抗体的核苷酸序列通过基因编辑的手段插入到修饰过的病毒表达载体中，在特定的真核细胞中重组，进而获得稳定表达嵌合抗体的减毒病毒系统。在一个技术方案中，本公开通过优化抗体的分泌信号肽序列，筛选得到能够在瘤体组织中高效表达单链抗体的avtm-scfv载体系统，同时利用该系统进一步在实体瘤模型中对该重组系统的疗效进行评价，为开发实体瘤的治疗产品提供了新的技术方案和选择。附图说明图1a所示的是棒状病毒载体系统的通过外源碱基随机碱基插入建立的弱毒病毒株的筛选库，并筛选到四基因突变株rv-mut4减毒株的具体流程示意图。图1b所示的是prv-2mcs载体棒状病毒核心骨架修饰改造的载体示意图，改造后的系统可以同时整合两种不同的外源基因(pdl1抗体重链和pdl1抗体轻链基因)。图2所示的是rv-2mcs载体系统外源同时表达2种基因的示意图。其中，图2中的a部分所示的是分别表达pdl1抗体的重链和轻链的示意图；图2中的b部分所示的是rv-2mcs载体系统同时表达pdl1抗体的重链和轻链的示意图；图2中的c部分所示的是rv-2mcs载体系统同时整合绿色荧光蛋白(gfp)和红色荧光蛋白(rfp)在vero细胞中的荧光表达情况的示意图。图3所示的是嵌合了pdl1单链抗体avtm载体系统的密码子偏好性的模拟分析优化的示意图。其中，图3中的a部分所示的是设计优化后的外源基因序列中平均gc含量(为58％)；图3中的b部分所示的是密码子在哺乳动物细胞中的偏好性，对应的复数cai为0.95，图3中的c部分所示的是多种密码子在哺乳动物细胞中的最优分布格局以及氨基酸同义密码子在基因序列中的相对分布频率的示意图。图4所示的是rv-g21e-m51a-l111f-v221f(rv-mut4)四突变载体系统优异性的比较。其中，图4中的a部分与图4中的b部分所示的是载体rv-mut4在体外细胞中具备长时效的持续表达外源蛋白的特性的示意图；图4中的c部分所示的是通过facs检测方法，绘制rv-mut4及其它突变株在vero细胞中复制的表达外源gfp蛋白量随时间的变化曲线的示意图；图4中的d部分所示的是mtt检测rv-mut4及另外三株突变株对肿瘤细胞的毒性的比较性实验的示意图。图5所示的是利用工程细胞系vero(rv-mut4-scfv-pdl1高表达pdl1单链抗体)外分泌出的外源单链抗体，将上清中抗体与两种稳定表达人源pdl1的细胞llc和mc38体外共孵育，通过facs检测pdl1单链抗体的结合上述两种肿瘤细胞表面分子的能力的示意图。图6所示的是在真核细胞中，通过ib(蛋白免疫印迹)实验鉴定三种不同信号肽连接介导的免疫检查点分子pdl1单链抗体在体外细胞系水平中外分泌的水平的示意图。图7a所示的是在工程细胞vero中，avtm载体系统介导的四种单链抗体在分泌到上清中的单链抗体pdl1的情况的示意图。图7b所示的是以signal3信号肽连接的单链抗体在llc动物模型中以两种不同接种方式分别检测血清和局部瘤组织中的抗体存在情况(近瘤组织皮下注射和瘤内注射)的示意图。图8是所示的avtm介导单链抗体在肺癌中的治疗效果评价示意图。如图8中的a部分所示，共有三种治疗组，分别是avtm系统介导表达单链抗体组(rv-scfv-pdl1减毒株)，rv-wt实验对照组及pbs空白对照组，在llc介导的非小细胞肺癌模型鼠动物模型中的对实体瘤的治疗效果的整体统计图；其中，为了进一不确定不同治疗组个体之间的差异，而将前述每组的个体单独进行统计；图8中的b部分所示的是pbs治疗组的个体统计图；图8中的c部分所示的是rv-gfp-wt治疗组的个体统计示意图；图8中的d部分所示的是rv-scfv-pdl1治疗组个体统计图。采取模型鼠瘤内(模型鼠非小细胞肺癌组织)接种，隔天接种一次107pfu的减毒30μl，共免疫三次，隔天检测一次各实验组的模型鼠肿瘤体积的变化情况，图8中的b-d部分分别代表的是同时展现出了三组中的单独个体的肿瘤体积随时间的变化情况。图9中的a-c部分分别代表的是pbs,rv-gfp及rv-scfv-pdl1在肺癌模型的个体单独治疗效果示意图；图9中的d部分是第10天上述三组药物的治疗效果统计图；图9中的e部分是第20天上述三组药物的治疗效果统计图。图10所示的是评价rv-scfv-pdl1减毒株在肺癌转移动物模型中的作用评价，实验组及对照组治疗的模型鼠肺组织转移模型(llc-jsp)在低倍显微镜下的转移情况(图10中的a部分)及模型鼠生存率情况(图10中的b部分)。图11所示的是首先建立表达人源的cd274的结肠癌模型鼠模型(表达人源的pdl1)，rv-scfv-pdl1以及相应的对照组病毒(rv-wt)瘤内给药，30μl107pfu的剂量，隔天给药一次，总共给药3次后，记录肿瘤的体积的变化情况的示意图。具体实施方式定义在本公开的权利要求和/或说明书中，词语“一(a)”或“一(an)”或“一(the)”可以指“一个”，但也可以指“一个或多个”、“至少一个”以及“一个或多于一个”。如在权利要求和说明书中所使用的，词语“包含”、“具有”、“包括”或“含有”是指包括在内的或开放式的，并不排除额外的、未引述的元件或方法步骤。与此同时，“包含”、“具有”、“包括”或“含有”也可以表示封闭式的，排除额外的、未引述的元件或方法步骤。在整个申请文件中，术语“约”表示：一个值包括测定该值所使用的装置或方法的误差的标准偏差。虽然所公开的内容支持术语“或”的定义仅为替代物以及“和/或”，但除非明确表示仅为替代物或替代物之间相互排斥外，权利要求中的术语“或”是指“和/或”。当用于权利要求和/或说明书中时，术语“抑制”、“降低”或“防止”或这些术语的任何变形，包括为实现期望结果(例如肿瘤治疗)的任何可测量的减少或完全抑制。期望结果包括但不限于癌症或增生性病症或癌症相关症状的缓解、降低、减慢或根除，以及改善的生活质量或生命延长。本公开的疫苗接种方法可用于治疗哺乳动物的肿瘤，可选的，本公开的疫苗接种方法可用于治疗哺乳动物的癌症。本公开使用的术语“癌症”包括任何癌症，包括但不限于黑素瘤、肉瘤、淋巴瘤、癌(例如脑癌、乳癌、肝癌、胃癌、肺癌和结肠癌)及白血病。术语“哺乳动物”是指人以及非人类哺乳动物。本公开的所述方法包括将表达哺乳动物对之具有预存免疫力的肿瘤抗原的溶瘤载体给予哺乳动物。本公开使用的术语“预存免疫力”意指包括通过用抗原接种诱导的免疫力以及哺乳动物内天然存在的免疫力。本公开中采用的术语“rv病毒”是指减毒的vsv溶瘤棒状病毒。术语“rv-mut”是指和野生型的vsv溶瘤棒状病毒相比，存在突变的溶瘤棒状病毒。术语“rv-mut4”是指和野生型的vsv溶瘤棒状病毒相比，在4个位点存在突变的溶瘤棒状病毒。术语“vsv”是指水疱性口炎病毒，其属于溶瘤棒状病毒的一种。其编码5种蛋白，包括核壳蛋白(n)、磷蛋白(p)、基质蛋白(m)、表面糖蛋白(g)和rna依赖性rna聚合酶(l)。术语“pdl1”是指细胞程式死亡配体1。pdl1蛋白是pd1的配体，与免疫系统的抑制有关，可以传导抑制性的信号。pd1和pdl1一旦结合便会向t细胞传递一种负向调控信号，诱导t细胞进入静息状态，减低淋巴结cd8+t细胞的增生，让其无法识别癌细胞，并且使t细胞自身增殖减少或凋亡。本公开中的术语“疫苗”是将病原微生物(如细菌等)及其代谢产物，经过人工减毒、灭活或利用转基因等方法制成的用于预防疾病的免疫制剂。本公开中的术语“放疗剂”包括使用引起dna损伤的药物。放疗已广泛用于癌症和疾病治疗，并且包括通常称为γ射线、x射线的那些和/或将放射性同位素定向递送至肿瘤细胞。本公开中的术语“化疗剂”是可用于治疗癌症的化学化合物。化疗剂的类别包括，但不限于：烷化剂、抗代谢产物、激酶抑制剂、纺锤体毒物植物生物碱、细胞毒/抗肿瘤抗生素、拓扑异构酶抑制剂、光敏剂、抗-雌激素和选择性雌激素受体调节剂、抗-孕酮、雌激素受体下调剂、雌激素受体拮抗剂、促黄体激素释放激素激动剂、抗-雄激素类、芳香化酶抑制剂、egfr抑制剂、vegf抑制剂、抑制涉及异常细胞增殖或肿瘤生长的基因表达的反义寡核苷酸。可用于本公开的治疗方法的化疗剂包括细胞生长抑制剂和/或细胞毒性剂。本公开中的术语“免疫治疗剂”包括“免疫调节剂”和促进或介导促进细胞介导的免疫应答的抗原呈递的试剂。其中，“免疫调节剂”包含免疫检查点调节剂，例如免疫检查点蛋白受体及其配体介导t细胞介导的细胞毒性的抑制，并且通常由肿瘤或在肿瘤微环境中的无反应性t细胞上表达，并允许肿瘤逃避免疫攻击。免疫抑制检查点蛋白受体及其配体的活性的抑制剂可以克服免疫抑制性肿瘤环境，以允许肿瘤的细胞毒性t细胞攻击。免疫检查点蛋白质的实例包括但不限于pd-1、pd-l1、pdl2、ctla4、lag3、tim3、tigit和cd103。此类蛋白质的活性的调节(包括抑制)可以通过免疫检查点调节剂完成，其可以包括例如靶向检查点蛋白质的抗体、适体、小分子和检测点受体蛋白质的可溶性形式，等等。pd-1靶向抑制剂包括经批准的药物试剂派姆单抗(pembrolizumab)和纳武单抗(nivolumab)，而易普利姆玛(ipilimumab)是经批准的ctla-4抑制剂。对pd-l1、pd-l2、lag3、tim3、tigit和cd103特异性的抗体是已知的和/或商品化的，并且也可以由本领域技术人员产生。本公开中的“本领域的常规生物学方法”，可以参见“最新分子生物学实验方法汇编(currentprotocolsinmolecularbiology，wiley出版)”，“分子克隆实验指南(molecularcloning：alaboratorymanual，冷泉港实验室出版)”等公开出版物中记载的相应方法。本公开中所涉及的核苷酸/氨基酸序列的具体含义如下。seqidno:1所示的是vsv核心骨架中的m基因(即prv-core载体中的m基因)的核苷酸序列。seqidno:2所示的是具有转座功能载体entranceposon的核苷酸序列。seqidno:3所示的是通过本公开的方法制备得到减毒病毒载体中，m基因的核苷酸序列。seqidno:4所示的是prv-coremut4载体的核苷酸序列。seqidno:5所示的是2mcs的核苷酸序列。seqidno:6所示的是prv-2mcs载体的核苷酸序列。seqidno:7所示的是含有vsv核心骨架中的n基因的质粒的核苷酸序列。seqidno:8所示的是含有vsv核心骨架中的l基因的质粒的核苷酸序列。seqidno:9所示的是含有vsv核心骨架中的p基因的质粒的核苷酸序列。seqidno:10所示的是pdl1抗体的重链部分的核苷酸序列。seqidno:11所示的是pdl1抗体的轻链部分的核苷酸序列。seqidno:12所示的是单链pdl1单链抗体的核苷酸序列。seqidno:13所示的是分泌pdl1单链抗体的信号肽sig1的氨基酸序列。seqidno:14所示的是分泌pdl1单链抗体的信号肽sig2的氨基酸序列。seqidno:15所示的是分泌pdl1单链抗体的信号肽sig3的氨基酸序列。seqidno:16所示的是分泌pdl1单链抗体的信号肽sig4的氨基酸序列。实施例本公开的其他目的、特征和优点将从以下详细描述中变得明显。但是，应当理解的是，详细描述和具体实施例(虽然表示本公开的具体实施方式)仅为解释性目的而给出，因为在阅读该详细说明后，在本公开的精神和范围内所作出的各种改变和修饰，对于本领域技术人员来说将变得显而易见。本公开采用的试剂及耗材的来源如下：pbs(hyclonesh30256.01)，dmem高糖培养基(gibcoc11995500)，rpmi1640(gibcoc22400500cp)，双抗体(gibco15140-122)，胎牛血清(gibco10099141)，ireducedserummedium(gibco31985-070)，lipofectamineltx(invitrogen15338100),96孔细胞培养板(corning3599)，6孔细胞培养板(corning3516)，0.22um滤器(milliporeslgp033rb)，dmso(macklind806645)，噻唑蓝(sigmam2128)。除非特别指出，否则本公开实施例中提及的试剂均可以通过商业途径购买得到。其中，本公开所涉及的病毒包装的方法如下：1、bsr-t7细胞铺6孔板，使细胞量达到3×105个/孔，铺板14-16h后加入表达t7聚合酶的痘病毒，病毒感染6h后，进行转染。2、使用200μlopti-mem培养基稀释质粒，质粒总量5μg，质粒的质量比例prv-core:pp:pn:pl＝10:5:4:1，再加入7.5μllife公司的转染试剂plusreagent。使用200μl培养基稀释lipofectamineltx10μl。其中，pn表示棒状病毒核蛋白基因，pl表示棒状病毒聚合酶蛋白基因，pp表示棒状病毒磷酸蛋白基因,pp,pl,pn三个质粒对应的母体载体是pcaggs(购自于atcc)。3、将ltx混合液200μl与dna混合液200μl混合，室温孵育15min。4、将6孔板中的培养基换成opti-mem培养基，将步骤3中的混合液逐滴加入培养细胞的6孔板中，轻轻摇动6孔板，使均匀分布在6孔板内。5、转染6-8h后，吸去转染试剂，加入3ml新鲜的完全培养基。6、72h后收获细胞上清，使用0.22μm滤器进行过滤。实施例1：减毒病毒载体筛选库的建立在此实施案例中，利用thermo公司产的试剂盒，即mu噬菌体转座技术，该技术已经被广泛用于各种病毒基因组功能及病毒与宿主相互作用的研究。mu噬菌体转座试剂盒进行随机突变库的建立原理：mu噬菌体转座子介导(transposon-mediatedmutagenesis)的随机插入高密度突变技术是在dna中随机性插入一段15bp(5'-nnnnntgcggccgca-3'，5个n代表靶序列dna上5个重复碱基序列)的短核昔酸序列，从而产生高库容的基因插入突变体文库的方法。将其与病毒方向遗传学操作技术结合就能获得相应的病毒突变体文库，再结合pcr扩增、毛细管电泳、荧光标记dna测序技术和片段长度多态性分析(aflp)等技术就能够准确鉴定突变数量和插入位点转化涉及的质粒dna为m1-mmut，即m基因的突变序列库整合到m1-kan载体，形成m突变基因库(实施步骤参照thermoscientificmutationgenerationsystemkit标准说明书)。目标m基因载体质粒会在转座子及转座酶的共同作用下，m基因碱基位置随机插入片段，最终m基因产生了数量级的随机突变，利用5’-tgcggccgca-3’特异性引物将突变基因m扩增，建立突变库，进一步将m基因库酶切克隆到prv-core核心骨架质粒中。建立病毒库系统的实验方法及步骤如下：1、在离心管中进行反应。其中转座酶应该最后添加,体外转座反应的体系如表1所示：表1体外转座反应体系试剂体积目标dna(棒状病毒核心骨架中的m基因)1-14μl5x转座酶的反应缓冲液4μlm1-kan转座子(entranceposon)100ng1μlmua转座酶1μlh2o总体积至20μl使用试剂盒thermoscientificmutationgenerationsystemkit(购自于thermo公司，货号f701)中提供的阳性对照dna即pblank370ng(1μl)做阳性对照反应。2、轻轻混匀。3、在30摄氏度孵育1小时进行转座。4、75摄氏度孵育10分钟使转座酶灭活。5、制备感受态细菌，其中所述细菌来源于dh5α。将步骤4得到的反应混合物在去离子水中稀释10倍，每次使用最大量为10ul。或者，先将反应混合物中的dna沉淀，然后悬浮在去离子水，进行电穿孔。对于化学转化，每次转化使用5-10μl。6、在琼脂平板上加入10μg/ml氯霉素或10μg/ml卡那霉素，另外加入目标dna克隆的抗生素。7、用标准的碱性裂解法或任何商业dna制备试剂盒，从平板的菌落中提取质粒。8、用限制酶酶切质粒dna。确定穿梭子片段(thermoscientificmutationgenerationsystemkit试剂盒提供)的单克隆酶切位点(noti)，两种限制性内切酶酶切质粒，切出载体骨架的一部分，以便通过琼脂糖凝胶电泳区分片段。9、用标准琼脂糖凝胶电泳分离检测穿梭载体的存在，通过胶回收得到前述穿梭载体ptrans质粒。10、将提取的dna片段克隆到新的克隆载体m1-camr(试剂盒提供)。11、在添加了加入10μg/ml氯霉素或10μg/ml卡那霉素，另外加入选择克隆载体的抗生素的细菌琼脂平板上进行转化12、从平板上挑取菌落，扩大培养，用标准的碱性裂解法或任何商业dna制备试剂盒提取质粒dna。13、用noti酶切质粒，去除穿梭载体。可选用标准琼脂糖电泳分离所得片段。提取克隆载体上有目的dna大小的片段。14、用noti酶切产物进行连接。如果酶切产物没有经过琼脂糖电泳分离，为了促使酶切产物自连，调整dna混合物的浓度使之在1-5ng/ml。15、用大肠杆菌dh5α感受态细胞进行转化。16、在平板上只添加筛选克隆载体的抗生素。noti酶切去除了穿梭载体后不要添加氯霉素和卡那霉素。17、从平板上挑取菌落，培养细菌，提取质粒dna，进一步通过酶切将mmut基因片段从m1-mmut质粒上获取，按照上述步骤完成m突变库的建立。减毒株病毒拯救体系步骤：进一步在突变库建立完成后，将m1-mmut基因突变片段克隆到骨架载体prv-core。其中，prv-core是包装病毒的核心骨架载体，病毒骨架全基因合成，序列参考展现在文稿中的prv-4mut，prv-core核心骨架对应的病毒基因按参照vsv的muddsummer株型的基因合成，genbank的编号为eu849003.1。prv-core质粒与prv-4mut只存在m基因4个氨基酸位点发生了非同义突变，prv-core是原始骨架载体)，目的载体中的野生型m基因已经通过双酶切去除，形成新的m基因突变库的核心骨架载体库，将该突变质粒库命名为prv-coremut。进一步将在辅助质粒的帮助下，在bsr-t7细胞系中通过病毒拯救，进而得到多种重组的rv-mut减毒株。其中，前述病毒拯救的具体步骤如下：使用磷酸钙转染试剂盒，通过细胞转染技术，将5μg的骨架质粒prv-coremut转染bsr-t7细胞(购自于atcc)。其中，使用200μlopti-mem培养基稀释前述质粒，质粒总量5μg，质粒比例prv-core:pp:pn:pl＝10:5:4:1，再加入7.5μllife公司的转染试剂plusreagent。使用200μl培养基稀释lipofectamineltx10μl。其中，pn表示棒状病毒核蛋白基因，pl表示棒状病毒聚合酶蛋白基因，pp表示棒状病毒磷酸蛋白基因。其中，pp，pl，pn三个质粒对应的母体载体为pcaggs(购自于atcc)。6小时后pbs清洗细胞两次，进一步在10％胎牛血清的dmem中培养3天，将获得的细胞上清转移到vero细胞中在37℃培养3天，荧光显微镜观察细胞中绿色荧光确定病毒拯救的情况，进一步将拯救的突变棒状病毒库通过vero细胞传代，在建立的噬菌斑筛选系统中挑取单克隆病毒株。该转座系统反应时，体外转座子不受外源dna影响，伴随的微小杂质影响，每个反应的目的dna的最佳量取决于质粒的大小，可以通过如下公式，计算目的dna的量(ng)＝反应质粒大小(kb)×40ng。通过dna克隆技术可以将dna和穿梭载体一起插入到克隆载体中。因此，用限制性酶将dna从克隆载体上切下来，并且穿梭载体上没有这个酶切位点。此外，由于克隆载体的大小和插入的dna有明显的大小差异，因此，可以通过琼脂糖凝胶电泳分离出目的片段。为了最大量的插入克隆，转化效率也是十分重要的考虑因素(例如对于puc19质粒，电穿孔细胞>108cfu/μg)。因此，电穿孔是我们选择的出最佳的转化方法。与此同时，考虑到穿梭载体含有50bp的反向末端重复序列，因此，为了避免潜在的重复序列之间的同源重组，使用了大肠杆菌产生的reca作为同源重组酶。得到prv-coremut质粒后，病毒拯救的具体步骤如下：将5x106的bsr-t7细胞均匀铺在10cm细胞培养皿中，用10％的胎牛血清dmem过夜培养至细胞密度达到80％，转染前一个小时，细胞用无血清deme清洗2次。使用磷酸钙转染试剂盒细胞转染5μg的骨架质粒prv-coremut，5μg的pn(棒状病毒核蛋白基因)，2.5μg的pl(棒状病毒聚合酶蛋白基因)，2.5μg的pp(棒状病毒磷酸蛋白基因),pp,pl,pn三个质粒对应的母体载体是pcaggs(购自于atcc)。2-3小时后pbs清洗细胞两次，在10％胎牛血清的dmem中培养3天，将获得的细胞上清转移到vero细胞中在37℃培养3天，荧光显微镜观察细胞中绿色荧光确定病毒拯救的情况，进一步将拯救的突变棒状病毒库通过vero细胞传代，在建立的噬菌斑筛选系统中挑取单克隆病毒，进一步将挑选出单克隆的病毒株继续感染新的vero细胞，从中挑选得到裂解细胞能力减弱的单克隆病毒株。克隆骨架质粒系统的具体操作步骤如下：通过基因合成技术，将基因片段2mcs(seqidno:5)，克隆至载体prv-coremut4，对应的核心骨架prv-core(prv-coremut4是在prv-core质粒对应的m基因上产生了4个位点的突变，具体是m蛋白的第21位的氨基酸g突变为氨基酸e，51位的氨基酸m突变为氨基酸a，第111位亮氨酸l突变为苯丙氨酸f，221位的缬氨基酸v突变为苯丙氨基酸f)，克隆得到的新的骨架命名为，prv-2mcs。克隆酶切位点上游是xhoi,下游酶切位点是noti(见附图1b),2mcs基因位于载体基因g与基因l之间。实验结果：图1a所示的是通过上述病毒库建立的制备方法，将外源碱基随机插入后，产生棒状病毒m基因的随机突变库，进一步如图1a所示，利用棒状病毒载体系统建立弱毒病毒株的筛选库(见案例1步骤1-17)。其中，通过上述方法得到的复制能力降低的减毒株包括：rv-m51r(单突变株)，rv-m51r-v221f(双突变株),rv-g21e-m51r-l111f(三突变株)，rv-g21e-m51a-l111f(三突变株)和四基因突变株rv-mut4(rv-g21e-m51a-l111f-v221f)。所述的rv-mut4的致病基因即vsv病毒的m基因的四个氨基酸突变株(对应的病毒核心骨架质粒为prv-coremut4)，即m蛋白的第21位的氨基酸g突变为氨基酸e，51位的氨基酸m突变为氨基酸a，第111位亮氨酸l突变为苯丙氨酸f，221位的缬氨基酸v突变为苯丙氨基酸f。图1b所示的是基于病毒rv-mut4的核心骨架载体prv-coremut4示意图。进一步通过基因合成及分子克隆技术将图1b中所示的2mcs基因(同时克隆2个外源基因的间隔序列，间隔基因序列具备单独特性的酶切位点)重组至prv-coremut4核心骨架质粒特定位置(即病毒g基因和l基因间隔序列)中，新的骨架质粒系统命名为prv-2mcs。prv-2mcs核心骨架质粒克隆的具体步骤：1.通过基因合成技术，将基因片段2mcs酶切克隆至质粒prv-coremut4(病毒g基因及l基因间隔序列)，重组后的新的核心骨架质粒为prv-2mcs(图1b)。实施例2：利用减毒病毒载体系统prv-2mcs同时表达特异性抗体实验方法：基于实施例1制备得到的质粒系统prv-2mcs，将pdl1抗体的重链和轻链抗体序列单独克隆到骨架质粒prv-2mcs，形成的新的克隆载体prv-pdl1-h和prv-pdl1-l，拯救出重组的病毒，在工程细胞vero中以不同的pdl1的重链/pdl1轻链的比例，表达分泌形成对应的有活性的pdl1完整抗体。前述方法的具体操作步骤如下：pdl1的完整抗体序列按照roche公司pdl1抗体，将pdl1抗体重链基因pdl1-h(泓迅生物基因合成)，克隆到骨架质粒prv-2mcs(nhei和noti特异性酶切位点克隆)，形成新的核心骨架质粒prv-pdl1-h,同理将合成的pdl1轻链抗体序列通过双酶切克隆(xhoi和asci特异性酶切位点)到质粒prv-2mcs,形成新的核心骨架质粒prv-pdl1-l,形成的两个骨架质粒，通过如实施例1所述的病毒拯救系统及其方法，获得重组的病毒rv-pdl1-h(嵌合表达pdl1重链抗体)及rv-pdl1-l(嵌合表达pdl1抗体轻链)，进一步通过免疫印迹检测，确定pdl1的重链/pdl1轻链的最优的病毒感染比例。如图2中的a部分所示的实验结果，蛋白质免疫印迹检测得出pdl1的重链/pdl1轻链的比例为6:1时(即rv-pdl1-h对应的病毒感染复数是rv-pdl1-l的6倍)，分泌到上清中的pdl1完整抗体的量最多。同理参照prv-pdl1-h和prv-pdl1-l的克隆步骤，将pdl1抗体的重链和轻链抗体基因同时克隆到骨架质粒prv-2mcs质粒，形成的新的克隆载体prv-pdl1-(h+l)，pdl1重链及轻链抗体克隆具体位置如图1b所示，pdl1重链通过xhoi和asci克隆到特定位置，pdl1轻链通过nhei和noti克隆到骨架载体。如图2中的b部分所示，克隆载体prv-pdl1-(h+l)对应的重组病毒rv-pdl1-(h+l)在vero细胞中复制表达外源蛋白(pdl1抗体的重链和轻链)，进一步通过免疫印迹实验检测到外泌的上清液中存在大量的pdl1完整单克隆抗体，证明prv-2mcs质粒系统同时整合免疫检查点抗体的重链和轻链，可以在工程细胞vero中高效表达具备活性的完整单克隆抗体。实施例3：减毒病毒载体系统prv-2mcs的稳定性将gfp和rfp基因序列同时克隆到减毒病毒载体系统prv-2mcs，形成的新的克隆载体prv-2mcs-gfp-rfp。拯救得到重组病毒后，在工程细胞vero中孵育12h后，如图2中的c部分所示，在荧光显微镜中可以观察到在固定视野中，大部分细胞都同时看到绿色和红色荧光。上述实验结果直接证明prv-2mcs-gfp-rfp在细胞中同时表达gfp和rfp荧光蛋白。更进一步的，将重组的prv-2mcs-gfp-rfp传代五次后，对应的外源基因表达检测与第一代感染的表达效率没有差异，进一步证明prv-2mcs棒状病毒系统的稳定高效性。实施例4：整合至减毒病毒载体系统prv-2mcs的的外源pdl1单链抗体序列选择根据现有技术中已知的pdl1抗体，对外源pdl1单链抗体avtm重组载体(rv-scfv-pdl1)中的pdl1氨基酸序列进行优化。实验结果：如图3中的a部分所示，设计优化后的外源基因pdl1单链抗体序列中平均gc含量为58％。如图3中的b部分所示，将密码子示意图修改密码子偏好性复数至最合理的范围(cai＝0.95)，图3中的c部分所示展现的是多种密码子在哺乳动物细胞中的最优分布格局以及氨基酸同义密码子在基因序列中的相对分布频率。实施例5：减毒株筛选系统筛选得到的rv-mut4棒状病毒减毒株的特性根据实施例1中的筛选方法和如图1a所示的减毒株筛选系统，筛选得到了不同点突变的棒状病毒减毒株，包括：rv-m51r(单突变株)，rv-m51r-v221f(双突变株),rv-g21e-m51r-l111f(三突变株)，rv-g21e-m51a-l111f(三突变株)，rv-g21e-m51a-l111f-v221f(四突变株，即rv-mut4)。本实施例中采用的具体方法步骤如下：mtt实验方法：1、在96孔培养板中每孔加入llc细胞悬液100μl，使细胞量达到1×104个/孔，37℃，5％co2培养16h。2、分别将病毒稀释到104pfu、103pfu、102pfu、101pfu，每一稀释梯度接种4个孔，每孔100μl，37℃，5％co2培养40h。3、弃去96孔培养板中的上清，加入新鲜培养基，加入mtt溶液，20μl/孔。37℃，5％co2培养4h。4、将96孔板离心，设置转速2500rpm/分钟，室温离心5分钟。5、使用1ml一次性无菌注射器，轻轻吸掉上清。6、向每孔中加入dmso，100μl/孔，37℃放置10分钟。7、使用多功能酶标仪，震荡2分钟，在570nm或490nm波长下，测定各孔的od值。统计流式检测gfp阳性细胞总数：1、在48孔培养板中每孔加入vero(llc/hela/mef)细胞悬液100μl，使细胞量达到2×104个/孔，37℃，5％co2培养16h。2、每个孔分别加入特定的突变株病毒100pfu，每种病毒21个孔，空白对照组12个孔。3、在各时间点(24h、36h、48h、60h、72h、84h、96h)分别收获细胞,每种病毒收获3个细胞孔的细胞，空白对照组收获1个孔的细胞，均用400ulpbs重悬细胞，取100ul细胞悬液用lifelaunchattunenxt–next型流式细胞仪进行分析，统计gfp阳性细胞总数。如图4中的a部分和图4中的b部分所示，首先在48孔培养板中每孔加入mef/vero/mc38细胞悬液100μl，使细胞量达到2×104个/孔，每个孔分别加入特定的突变株病毒100pfu，每种病毒21个孔，空白对照组12个孔。在各时间点(24h、36h、48h、60h、72h、84h、96h)分别收获细胞,每种病毒收获3个细胞孔的细胞，空白对照组收获1个孔的细胞，均用400μlpbs重悬细胞，取100ul细胞悬液用lifelaunchattunenxt–next型流式细胞仪进行分析，统计gfp阳性细胞总数。实验结果：如图4中的a部分-c部分所示，发现筛选得到的突变株(即rv-m51r(单突变株)，rv-m51r-v221f(双突变株),rv-g21e-m51r-l111f(三突变株)，rv-g21e-m51a-l111f(三突变株))，进行外源基因的检测表达的比较时发现，rv-mut4具备在细胞中持续表达外源蛋白的能力，在三天后达到峰值，然后表达水平逐步回落。进一步通过比较实验发现(如图4中的c部分)，rv-mut4与对照组突变株相比，外源基因的表达在48h达到峰值，并且表达量远远高于对照组。rv-mut4减毒株整合的外源蛋白(gfp)表达量显著上升，同时病毒本身对肿瘤细胞的特异性杀伤能力并没有减弱，如图4中的d部分所示，对肿瘤细胞的裂解杀伤能力与对照组相比没有显著差异。综上所述，在上述病毒株中，rv-mut4的特点最为突出。该毒株4个氨基酸突变并没有让病毒毒性返强，同时继续保留了杀伤肿瘤的特异性。与此同时，尽管在体外细胞水平发现裂解肿瘤细胞的时间点延后，但特异性杀伤肿瘤的属性完整的保留。进一步的，rv-mut4对正常细胞没有任何毒性，完全符合生物安全要求。实施例6：rv-scfv-pdl1载体在vero细胞中的表达实验步骤：利用如图2中所示的prv-2mcs系统，采用如实施例1所示的方法，在prv-2mcs空骨架质粒的基础上，将scfv-pdl1基因通过特异性内切酶xhoi和nhei双酶切系统，scfv-pdl1外源基因位置在病毒核心骨架g蛋白和l蛋白之间，克隆到骨架质粒prv-2mcs上(详细步骤参照实施案例1的外源基因克隆到核心骨架质粒的过程)，得到新的骨架质粒，命名为prv-scfv-pdl1。进一步在bsr-t7细胞中拯救得到重组的病毒rv-scfv-pdl1，收集重组的病毒在vero细胞中表达的上清，将上清分别与细胞表面高表达cd274(人源)细胞mc-38-hpdl1及llc-hpdl1室温共孵育一个小时后(上清中分泌表达的pdl1单链抗体可以与细胞表面高表达的cd274受体分子结合)，通过流式细胞仪检测pdl1阳性的细胞具体数目及比例。实验结果：如图5所示，pdl1阳性比例超过了50％，表明rv-scfv-pdl1可以通过细胞介质表达出具备活性的抗cd274分子的单链抗体，同时进一步证明rv-scfv-pdl1表达的单链抗体具备结合人源及鼠源cd274的能力，具备人鼠交叉反应，有利于临床前动物模型的药效的快速验证。实施例7：信号肽对rv-scfv-pdl1的影响通过建立的非截短负链rna载体系统avtm嵌合外源免疫球蛋白重链和轻链的可变区域，设计特定的重链和轻链可变区域的连接序列15个氨基酸，即国际通用的(g4s)3作为柔性多肽接头，同时设计了4条不同的分泌抗体的信号肽，在体外细胞水平(质粒在293t细胞瞬时转染表达体系)比较了每条信号肽对单链抗体外泌的效率影响。前述实验的具体实验步骤如下：1.pdl1单链抗体n端分别添加sig1,sig2,sig3及sig4信号肽序列(序列见表2)，共计四段碱基序列，利用分子克隆技术，将这四段基因序列分别克隆到pcdna3.1骨架上(购自于atcc公司)，最终形成四个真核表达载体，即：pcdna3.1-sig1-scfv-pdl1，pcdna3.1-sig2-scfv-pdl1，pcdna3.1-sig3-scfv-pdl1，pcdna3.1-sig4-scfv-pdl1。2.将上述四个载体转染293t细胞48h后，分别收集外泌的上清即细胞，利用上样缓冲液裂解制备成样品，利用免疫印迹的技术检测上清中pdl1单链抗体的表达量(pcdna3.1载体自带his标签，通过his标签抗体进行目的蛋白表达的检测)。表2分泌抗体的信号肽的氨基酸序列sig1信号肽mlltliillpvvsksig2信号肽mwlqsllllgtvacsissig3信号肽myrmqllscialslalvtnssig4信号肽metdtlllwvlllwvpgstg实验结果如图6所示，在293t细胞中，转染三种不同信号肽连接的真核表达载体，分别收集细胞及上清培养液，合成密码子优化后的scfv-pdl1的3’端融合了his标签，分别连接的三种不同信号肽在细胞中的分泌表达水平都过蛋白免疫印迹实验检测发现与另外2种信号肽相比，sig3信号肽对应的scfv-pdl1抗体的外泌效率最高，呈现指数增长的态势。将表2中涉及到的四种抗体分泌信号肽，通过分子克隆技术分别整合到prv-coremut4质粒系统中，按照下述病毒拯救技术完成重组病毒的的拯救过程，将四种重组病毒感染veroe6细胞系，感染复数moi＝0.01，24h后收集细胞上清，检测上清中单链抗体的表达情况。上述病毒拯救技术的具体步骤如下：将5x106的bsr-t7细胞均匀铺在10cmdish中用10％的胎牛血清dmem过夜培养至细胞密度达到80％，转染前一个小时，细胞用无血清deme清洗2次。使用磷酸钙转染试剂盒细胞转染5μg的骨架质粒prv-coremut4(或者是重组的核心骨架质粒)，5μg的pn(表达棒状病毒核蛋白的质粒)，2.5μg的pl(表达棒状病毒聚合酶蛋白的质粒)，2.5μg的pp(表达棒状病毒磷酸蛋白的质粒)。2-3小时后pbs清洗细胞两次，在10％胎牛血清的dmem中培养3天，将获得的细胞上清转移到vero细胞中在37℃培养3天。用fitc标记的棒状病毒g蛋白特异性抗体通过免疫荧光实验检测bsr-t7p细胞拯救的病毒表达情况。病毒拯救的结果如图7a所示。图7a显示，sig3和sig4对应的表达系统在上清中表达量都很高，而sig1和sig2的表达量几乎检测不到。进一步的，以sig3作为信号肽的rv-scfv-pdl1(sig3)减毒株，分别通过近瘤部位皮下注射以及瘤内注射这两种方式，接种2天后分别收集模型鼠血清及局部肿瘤组织，研磨组织样品，通过免疫印迹的方法分别检测荷瘤模型鼠不同的部位抗体表达情况及病毒相关蛋白的存在情况。实验结果如图7b所示，与未接种病毒组(标记c)相比，rv-scfv-pdl1(sig3)减毒株近瘤部位皮下注射给药后，小鼠肿瘤组织(2号标记)出检测到了病毒的囊膜蛋白的存在，同时外源基因单链抗体也检测到了表达，而对应小鼠的血清中没有检测到病毒相关基因的表达(1号标记)，进一步给予小鼠瘤内局部给药，无论是血清(3号标记)还是瘤组织(4号标记)中都检测到了明显的病毒相关蛋白的存在，尤其是在瘤内给药时，瘤组织中的外源表达量显著上升，实验结果直接证明了rv-scfv-pdl1(sig3)具备在肿瘤组织中快速高效表达外源单链抗体的能力。实施例8：在转移型非小细胞肺癌模型下，rv-scfv-pdl1免疫治疗药效性能测试评价首先是转移型非小细胞肺癌模型的建立，如图8中的a部分所示，按每只c57bl/6皮下接种1.0*10^6(200ul)llc-jsp细胞(购买于美国atcc)。每隔1天测量肿瘤大小，按如下公式计算：m12*m2/2(m1：短径，m2：长径)。待每组模型鼠肿瘤体积生长接近200mm3后，分别在day12，day14和day16给予106pfu(20ul)的瘤内注射病毒进行治疗，连续观察记录肿瘤体积的变化情况。实验结果：如图8中的a部分所示，共有三种治疗组，分别是avtm系统介导表达单链抗体组(rv-scfv-pdl1减毒株)，rv-wt实验对照组及pbs空白对照组，在llc介导的非小细胞肺癌模型鼠动物模型中的对实体瘤的治疗效果的整体统计图，为了进一不确定不同治疗组个体之间的差异，将每组的个体单独进行统计；图8中的b部分是pbs治疗组的个体统计图；图8中的c部分是rv-gfp-wt治疗组的个体统计示意图；图8中的d部分代表的是rv-scfv-pdl1治疗组个体统计图，采取模型鼠瘤内(模型鼠非小细胞肺癌组织)接种，隔天接种一次107pfu的减毒30μl，共免疫三次，隔天检测一次各实验组的模型鼠肿瘤体积的变化情况，图8中的d部分示出了rv-scfv-pdl1免疫治疗药效性能测试评价。连续3次隔天的瘤内注射治疗能有效抑制肿瘤的生长趋势，大大延缓模型鼠的生命周期，通过独立分析每只模型鼠接受rv-scfv-pdl1系统的治疗效果，发现约40％的模型鼠肿瘤缩小直至消失(即完全缓解)，近30％的模型鼠肿瘤的生长速度得到有效抑制，部分缓解，总体有效率接近70％，与对照治疗组rv-gfp-wt相比，治疗效果显著提升，优异性明显。图9中的a部分-图9中的c部分进一步示出了不同治疗组模型鼠在治疗20天后，每只独立个体的肿瘤体积变化情况，进一步分析不同组治疗小鼠第10天(图9中的d部分)和治疗第20天(图9中的e部分)的肿瘤体积变化情况，在治疗第10天，可以发现rv-gfp实验对照组在早期治疗阶段，对非小细胞肺癌具备一定的抑制作用，当时间推移到20天时，肿瘤持续缩小的仅有2只(n＝19)，而rv-scfv-pdl1药物治疗组从治疗第10天推移到治疗第20天，肿瘤体积呈现持续缩小的态势，有效控制率接近80％，证明rv-scfv-pdl1瘤内给药组的，三次给药激活了肿瘤局部的免疫细胞，诱导产生了持续性抗肿瘤的免疫反应，特异性免疫细胞聚集在肿瘤局部，最终清除了肿瘤细胞，肿瘤组织缩小直至消失。从实验结果进一步分析发现，rv-scfv-pdl1药物三次瘤内给药，所有模型鼠均没有耐药性，初期产生治疗效果的模型鼠也并没有出现后期复发的情况。进一步的，通过将实验组及对照组的模型鼠肺部组织取出，通过荧光显微镜观察并记录模型鼠肺部组织中的癌细胞转移的情况(llc-jsp)皮下接种转移到肺部组织)，从图10中的a部分可以看到，rv-scfv-pdl1免疫治疗组的模型鼠肺部转移的数目最少。进一步通过对荷瘤模型鼠接受治疗后的有效生存期记录发现，实验组的存活率最高，接近65％的模型鼠在近2个月内维持正常的生命状态(如图10中的b部分所示)。实施例9：在结肠癌模型下，rv-scfv-pdl1免疫治疗药效性能测试评价我们首先建立表达人源pdl1的肿瘤细胞系(mc38-hpdl1)，将该细胞系接种到c57bl/6，建立人源化的模型鼠结肠癌模型，进而进一步验证嵌合表达人鼠通用型单链抗体rv-scfv-pdl1的疗效。该结肠癌模型的建立是基于将结肠癌细胞系(mc-38)鼠源pdl1分子敲除后嵌合表达人源pdl1。建立该模型的步骤及方法如下所示：步骤一，将鼠源的pdl1(mpdl1)通过crispr-cas9的方法敲除：依据crispr-cas9技术，首先设计短链引导rna(sgrna)，设计序列如下：5’-gcttgcgttagtggtgtact-3’。将合成的dna双链通过bbsi插入sgrna表达载体上(fg-bb-u6-sgrna)。再和cas9表达质粒(fg-hef/htlv-cas9-pgk-puro-wpre)共转mc-38细胞，60小时候用嘌呤霉素(puro)筛选48小时(此处的表达载体和转染筛选方法参见scientificreports，第7卷，文章号(articlenumber):42687，anfeihuang等，2017年2月16日)。随后扩大培养，获得敲除细胞库，抽提dna并通过如下引物进行pcr：正向引物：5’-tggttccttttaaacaagactggg-3’，反向引物：5’-cgcaccaccgtagctgatta-3’，回收pcr产物并进行ta克隆，随后送样测序。步骤二、通过慢病毒体系将人源的pdl1过表达在这种mpdl1ko的mc-38细胞中：首先克隆人pdl1的基因，并插入fg-hef/htlv-humancd274-pgk-puro-wpre腺病毒表达载体，随后再转染hek293t细胞进行病毒包装。产生的病毒侵染mc-38mpdl1ko细胞48h，并通过嘌呤霉素筛选48小时。通过测序的方法检测mpdl1的敲除效率，干扰素-γ(ifn-γ)能显著的刺激pdl1的表达，我们分别通过流式检测了正常细胞和敲除细胞ifn-γ刺激前后细胞pdl1的表达情况，结果均进一步表明mc-38细胞中mpdl1的敲除成功。同样的，采用流式分析的方法检测了通过慢病毒过表达的hpdl1在mpdl1ko的mc-38细胞中的分子表达水平，流式结果表明hpdl1能够在该细胞系中正常表达。综上所述，经过各步骤的验证，建立人源化的pdl1的肿瘤细胞系mc-38-hpdl1。进一步通过对荷瘤模型鼠接受治疗后的有效生存期记录发现，rv-scfv-pdl1药物治疗组的模型鼠存活率最高，接近70％的模型鼠在近2个月内维持正常的生命状态(如图11所示)，在结肠癌的模型鼠模型中疗效评价中，如图11所示，经过隔天瘤内接种一次，共治疗三次后，治疗组与对照组(pbs)相比明显的抑制了肿瘤的生长，延长了模型鼠的生存周期，从治疗组的单一个体分析有近70％的个体肿瘤体积持续缩小或肿瘤维持一定的体积，rv-scfv-pdl1治疗组与对照组相比，显著控制了肿瘤体积的生长，效果显著，具备极佳的治疗效果，同时利用avtm病毒载体系统介导免疫检查点抗体对临床上治愈此类癌症具备可行性，avtm载体系统对潜在的恶性肿瘤治疗效果具备可靠的靶向性，耐药性好，可重复多次给药，治疗效果显著。本公开的上述实施例仅是为清楚地说明本公开所作的举例，而并非是对本公开的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本公开的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本公开权利要求的保护范围之内。序列表<110>苏州奥特铭医药科技有限公司<120>一种减毒棒状病毒的制备方法及应用<130>6514-180407i<160>16<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>690<212>dna<213>水疱性口炎病毒(vesicularstomatitisvirus)<400>1atgagttccttaaagaagattctcggtctgaaggggaaaggtaagaaatctaagaaatta60gggatcgcaccacccccttatgaagaggacactagcatggagtatgctccgagcgctcca120attgacaaatcctattttggagttgacgagatggacacctatgatccgaatcaattaaga180tatgagaaattcttctttacagtgaaaatgacggttagatctaatcgtccgttcagaaca240tactcagatgtggcagccgctgtatcccattgggatcacatgtacatcggaatggcaggg300aaacgtcccttctacaaaatcttggcttttttgggttcttctaatctaaaggccactcca360gcggtattggcagatcaaggtcaaccagagtatcacgctcactgcgaaggcagggcttat420ttgccacataggatggggaagacccctcccatgctcaatgtaccagagcacttcagaaga480ccattcaatataggtctttacaagggaacgattgagctcacaatgaccatctacgatgat540gagtcactggaagcagctcctatgatctgggatcatttcaattcttccaaattttctgat600ttcagagagaaggccttaatgtttggcctgattgtcgagaaaaaggcatctggagcgtgg660gtcctggactctatcggccacttcaaatga690<210>2<211>1139<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2gatctgcggccgcgcacgaaaaacgcgaaagcgtttcacgataaatgcgaaaacggatcg60atcctagtaagccacgttgtgtctcaaaatctctgatgttacattgcacaagataaaaat120atatcatcatgaacaataaaactgtctgcttacataaacagtaatacaaggggtgttatg180agccatattcaacgggaaacgtcttgctcgaggccgcgattaaattccaacatggatgct240gatttatatgggtataaatgggctcgcgataatgtcgggcaatcaggtgcgacaatctat300cgattgtatgggaagcccgatgcgccagagttgtttctgaaacatggcaaaggtagcgtt360gccaatgatgttacagatgagatggtcagactaaactggctgacggaatttatgcctctt420ccgaccatcaagcattttatccgtactcctgatgatgcatggttactcaccactgcgatc480cccgggaaaacagcattccaggtattagaagaatatcctgattcaggtgaaaatattgtt540gatgcgctggcagtgttcctgcgccggttgcattcgat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