一种增强免疫效应细胞功能的方法与流程

文档序号：20003996发布日期：2020-02-22 03:26阅读：509来源：国知局

本发明属于生物医药领域，具体地属于肿瘤的免疫治疗领域，涉及利用嵌合抗原受体t细胞治疗肿瘤。

背景技术：

过继细胞疗法(adoptivecelltransfertherapy,act)是指通过向肿瘤患者输注在体外培养扩增或激活后,有抗肿瘤活性的免疫细胞，直接杀伤或激发机体免疫反应杀伤肿瘤细胞，达到治疗肿瘤的目的。目前主要由t细胞受体(tcr)t和嵌合抗原受体(car)t细胞治疗构成。

cart细胞免疫疗法是一种使用基因修饰后表达嵌合抗原受体(car)的t细胞清除肿瘤细胞的免疫疗法。car是car-t的核心部件，它由构成抗体的抗原结合域的scfv、铰链和跨膜区、t细胞受体的胞内信号和共刺激信号组成，单链抗体scfv能够特异性结合肿瘤相关抗原，跨膜区和胞内信号结构域可以帮助t细胞激活，而共刺激信号可以维持t细胞的增殖。

目前的研究和临床试验表明car-t在血液恶性肿瘤的治疗中取得了优异的成绩,但是未能在实体瘤治疗中有所进展[pmid:27162934],cart免疫疗法在实体肿瘤的治疗应用中主要遇到三个障碍:首先难以获得适当的肿瘤特异性或相关抗原；其次过继输注的car-t细胞难以向肿瘤位点转移；最后肿瘤位点存在免疫抑制作用的肿瘤微环境又会对进入肿瘤微环境中的t细胞造成免疫抑制,因此car-t治疗在实体瘤中仅体现出有限的治疗效果[pmid:28331617]。近年来随着cart在实体瘤治疗中的尝试,肿瘤微环境逐渐成为重要的靶点。肿瘤微环境主要由间质成纤维细胞,浸润的免疫细胞,血液和淋巴管网络和细胞外基质组成,此外在肿瘤微环境中还充斥着各种肽因子(例如酶,趋化因子和细胞因子)和由肿瘤细胞和基质细胞产生的代谢物[pmid:23666510]。有研究表明在肿瘤微环境中因缺氧环境致使细胞外腺苷(adenosine,ado)大量积累,其与各种免疫细胞表面的腺苷受体结合后,会抑制免疫细胞的炎症反应,同时腺苷受体的信号传导上调了许多抗炎分子并招募免疫调节细胞,从而建立了持久的免疫抑制环境[pmid:28331617,pmid:28165340，pmid:16784779，pmid:16518376，pmid:27066002，pmid:25035124]。

adenosine是atp的水解代谢产物,胞外adenosine通常来源于位于细胞表面或以可溶形式存在于间质培养基或体液中的ecto-enzyme(如cd39和cd73)分解代谢胞外atp或直接来源于细胞裂解后释放,胞外adenosine水平的调节还与腺苷脱氨酶(ada)和腺苷激酶相关,前者不可逆地将adenosine代谢生成inosine,而后者可以重新磷酸化腺苷产生amp[pmid:16784779,pmid:25035124]。

adenosine依靠其与adenosinereceptor的结合和启动下游信号通路来介导肿瘤逃逸和其他细胞反应[pmid:28165340,pmid:16518376，pmid:27066002，pmid:25035124，pmid:18758473，pmid:24990240]。adenosinereceptor被划分为四个亚型,分别为a1、a2a、a2b、a3,四种亚型都是g-蛋白偶联受体(gpcr)的超家族的成员,每种亚型具有独特的药理学特征,组织分布和偶联效应物[pmid:16518376]。通常adenosinereceptor的信号被认为是通过抑制或刺激腺苷酸环化酶来进行传递地,a1和a3腺苷受体的激活通过激活gi蛋白来抑制腺苷酸环化酶活性；a2a和a2b受体的激活则通过激活gs蛋白增加腺苷酸环化酶活性,所有四种亚型的adenosinereceptor可以偶联到丝裂原活化蛋白激酶(mapk),使其在细胞生长,存活,死亡和分化中起作用[pmid:16518376]。

近期研究表明在快速增殖的肿瘤组织中缺乏血管系统支持从而导致实体瘤组织中发展成为缺氧区域,在此缺氧环境下低氧诱导因子(hif)启动应对缺氧条件的差异转录调节,影响细胞代谢和血管生成以减轻氧气需求,而依靠识别hif1α驱动的cd73和cd39在上皮细胞被激活从而导致了缺氧环境介导的adenosine生产[pmid:25035124],而adenosine通过激活adenosinereceptor(主要为a2a和a2b)及其下游信号通路。1.阻断nk和cd8+t细胞的细胞毒性功能,使肿瘤免疫逃逸；2.通过a2a腺苷受体的信号转导抑制th1cd4+t细胞应答,限制这些效应细胞所需的细胞因子环境；3.adenosine促使骨髓细胞分化为免疫抑制表型并增强treg的增殖,进一步影响t效应细胞增殖和功能。4.通过这些抑制细胞类型释放细胞因子和免疫调节因子,通过促进血管发生增强肿瘤的存活并抑制免疫监视[pmid:28165340,pmid:16518376，pmid:27066002，pmid:25035124，pmid:18758473，pmid:24990240]。

靶向腺苷代谢通路的免疫佐剂包括低氧-hif-1α信号通路抑制剂,cd39/cd73胞外酶抑制剂,细胞外腺苷降解药,腺苷受体拮抗药或激动剂。已有的研究表明针对低氧-hif-1α等早期阶段的抑制剂(如hif-1α抑制剂)能够减少低氧发生和促进抗肿瘤t细胞和nk细胞中hif-1α的降解。针对cd39或cd73的抗体或者抑制剂可以阻止肿瘤微环境中胞外腺苷的聚集,进而降低a2a或a2b介导的免疫抑制信号强度。腺苷脱氨酶已有上市药物,为我们提供了一种降解胞外腺苷的策略。类似地,腺苷激酶可以重新磷酸化腺苷,从而降低胞外腺苷浓度。

针对腺苷代谢通路的调控来增强和抑制cart细胞功能的研究目前还鲜有报道。最近phillipk.darcy团队发现cart细胞受到抗原刺激后会上调a2a受体[pmid:28165340]。他们进而尝试采用a2a受体缺陷的cart细胞,或者将靶向a2a受体的小分子化合物药物与cart细胞联用治疗肿瘤。结果表明靶向a2a受体介导的免疫抑制,可以增强cart细胞抗肿瘤功能。作用的机制包括提高ifn-γ分泌量,增强cart细胞激活程度等。另外,stevenm.albelda团队在cart细胞中表达一段小分子多肽riad可以抑制蛋白激酶pka结合免疫突触,从而阻断腺苷受体的下游信号,同样显示增强了cart细胞的功能[pmid:27045023]。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种增强免疫效应细胞功能的方法以及该方法所获得的药物组合物。

为了达到上述目的，本发明提供了一种增强免疫效应细胞功能的方法，其特征在于，包括通过免疫调节因子增强免疫效应细胞功能。

在一个优选例中，所述的免疫调节因子包括(但不限于)：bay60-6583(分子式c19h17n5o2s)、bay60-6583结构类似物或其盐形式。

在另一优选例中，所述的bay60-6583通过与免疫效应细胞在体外或者/和体内接触来增强免疫效应细胞功能。

在另一优选例中，所述的bay60-6583在培养免疫效应细胞时加入。

在另一优选例中，所述的bay60-6583在免疫效应细胞结合靶细胞时加入。

在另一优选例中，所述的免疫效应细胞包括：t淋巴细胞，nk细胞或nkt细胞。

在另一优选例中，所述的免疫效应细胞为被激活的免疫效应细胞。

在另一优选例中，所述的免疫效应细胞表达嵌合抗原受体(car)分子。

在另一优选例中，所述的嵌合抗原受体包括：胞外抗原结合区、铰链区、跨膜区和胞内信号区中的至少一种。

在另一优选例中，所述的胞外抗原结合区是特异性结合肿瘤抗原的抗体。

在另一优选例中，所述的肿瘤抗原包括(但不限于)：cd133、cd19和her2中的至少一种。

在另一优选例中，所述的增强免疫效应细胞功能包括(但不限于)：分泌更多细胞因子、使免疫效应细胞具有更强的细胞杀死能力、以及使免疫效应细胞具有更高的细胞扩增倍数中的至少一种。

在本发明的另一方面，提供一种制备增强型免疫效应细胞的方法，包括在培养免疫效应细胞时加入所述的免疫调节因子。

在本发明的另一方面，提供一种用于疾病治疗的药物组合物，其包括：所述的免疫效应细胞和所述的免疫调节因子。

在一个优选例中，所述的疾病为肿瘤或者癌症。

在本发明的另一方面，提供一种治疗方法，包括给病人所述的药物组合物。

在一个优选例中，所述的药物组合物中免疫效应细胞和免疫调节因子按照以下顺序提供给病人：先提供免疫调节因子，再提供免疫效应细胞；先提供免疫效应细胞，再提供免疫调节因子；同时提供免疫效应细胞和免疫调节因子；以上形式的任何组合。

在另一优选例中，所述的药物组合物通过静脉注射或者原位给药提供给病人。

在另一优选例中，所述的药物组合物按照能够增强治疗效果的量提供。

在本发明的另一方面，提供一种提高免疫治疗效果的方法，包括使用所述的增强免疫效应细胞功能的方法或者给病人所述的药物组合物。

在本发明的另一方面，提供所述的制备增强型免疫效应细胞的方法用于制备药物。

在本发明的另一方面，提供所述的药物组合物的用途，用于治疗疾病。

在一个优选例中，所述的疾病为肿瘤或者癌症。

在另一优选例中，所述的疾病具备难治或者复发的特征。

在另一优选例中，经过所述的药物组合物治疗，可以延长病人的生存期。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明提供了增强免疫效应细胞功能的方法以及该方法所获得的药物组合物，使用该方法，可以使得免疫效应细胞分泌更多细胞因子、使免疫效应细胞具有更强的细胞杀死能力、以及使免疫效应细胞具有更高的细胞扩增倍数。

附图说明

图1为在cd133过表达的脑胶质瘤细胞u251(u251-oe)和靶向cd133的cart细胞(cd133-cart)的共培养体系中加入不同浓度的八种的小分子药物和药物溶剂dmso，24小时后加入药物的上清中ifn-γ(图1a)和gm-csf(图1b)的分泌量与加入dmso的上清中对应细胞因子分泌量(设为1.0)的比值。

图2a至图2c为在cd133过表达的脑胶质瘤细胞u251(u251-oe)刺激靶向cd133的cart细胞(cd133-cart)条件下加入药物bay60-6583和药物溶剂dmso，24小时后加入药物的上清中三种细胞因子(gm-csf(图2a)，ifn-γ(图2b)和tnf-α(图2c))的分泌量与加入dmso的上清中对应细胞因子分泌量(设为1.0)的比值。

图2d至图2f为在抗cd3/cd28磁珠刺激靶向cd133的cart细胞(cd133-cart)条件下加入药物bay60-6583和药物溶剂dmso，24小时后加入药物的上清中三种细胞因子(gm-csf(图2d)，ifn-γ(图2e)和tnf-α(图2f))的分泌量与加入dmso的上清中对应细胞因子分泌量(设为1.0)的比值。

图2g至图2i为在未刺激的靶向cd133的cart细胞(cd133-cart)中加入药物bay60-6583和药物溶剂dmso，24小时后加入药物的上清中三种细胞因子(gm-csf(图2g)，ifn-γ(图2h)和tnf-α(图2f))的分泌量与加入dmso的上清中对应细胞因子分泌量(设为1.0)的比值。

图3为在cd133过表达表达萤火虫荧光素酶的脑胶质瘤细胞u251(u251-oefluc)和靶向cd133的cart细胞(cd133-cart)的共培养体系中加入bay60-6583和药物溶剂dmso，48小时后根据加入萤火虫荧光素酶底物后产生的生物发光信号计算得到的加入药物bay60-6583时肿瘤细胞裂解率和加入dmso时肿瘤细胞裂解率(设为1.0)的比值。

图4为在cd133过表达表达萤火虫荧光素酶的脑胶质瘤细胞u251(u251-oefluc)和靶向cd133的cart细胞(cd133-cart)的共培养体系中加入药物bay60-6583和neca，48小时后根据加入萤火虫荧光素酶底物后产生的生物发光信号计算得到的肿瘤细胞裂解率。

图5a至图5c为在表达cd19的肿瘤细胞raji刺激靶向cd19的cart细胞(cd19-cart)条件下加入药物bay60-6583和药物溶剂dmso，24小时后加入药物的上清中三种细胞因子(gm-csf(图5a)，ifn-γ(图5b)和tnf-α(图5c))的分泌量与加入dmso的上清中对应细胞因子分泌量(设为1.0)的比值。

图5d至图5f为在cd19阴性的肿瘤细胞k562刺激靶向cd19的cart细胞(cd19-cart)条件下加入药物bay60-6583和药物溶剂dmso，24小时后加入药物的上清中三种细胞因子(gm-csf(图5d)，ifn-γ(图5e)和tnf-α(图5f))的分泌量与加入dmso的上清中对应细胞因子分泌量(设为1.0)的比值。

图6为在快速扩增cd133-cart细胞时加入药物bay60-6583。分别在不同天计数，分析不同条件下的细胞扩增倍数(图6a)。图6b-6g为扩增得到的cd133-cart细胞表型分析，其中图6b-6d为同型对照抗体染色结果，而图6e-6g为抗cd45ro和抗cd62l抗体的染色结果.

图7为在含有药物bay60-6583条件下扩增得到的cd133-cart细胞的细胞裂解能力(图7a)和细胞因子分泌能力分析(图7b-d)。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例仅用于说明本发明的一部分实施例，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，视为可以通过市售购买获得的常规产品。

实施例1

本实施例提供制备cart细胞和靶细胞的详细方案:

1.将pbmc(allcells，pb005f)用t细胞培养基[含10％fbs(thermofisher,10091148)的rpmi1640(thermofisher,11875093)培养基]稍加培养1至2个小时后用于电转。

将10μgac133-carpiggybactransposon(或10μgcd19-carpiggybactransposon)和5μgsuperpiggybactransposase与人t细胞核转染试剂盒(lonza，vpa-1002)中的电转缓冲液混合，获得包含该2种质粒的大约110μl电转混合液；

质粒ac133-carpiggybactransposon和superpiggybactransposase的制备方法参见文献zhu,x.,etal.,patient-derivedglioblastomastemcellsarekilledbycd133-specificcartcellsbutinducethetcellagingmarkercd57.oncotarget,2015.6(1):p.171-84。在质粒ac133-carpiggybactransposon的基础上，通过基因合成和常规分子克隆的方法，将ac133-car中的scfv序列替换为抗cd19的scfv序列，获得cd19-carpiggybactransposon质粒载体。具体地，抗cd19的scfv序列来自克隆fmc63，由苏州金唯智生物科技有限公司采用常规方法合成相应的dna。进一步设计上游pcr引物5’-gctctagagccaccatgctgctgctggtcacttctctgctgctgtgcgaactgccccaccccgcctttctgctgattcccgacatccagatgacacag-3’(seqidno:1)和下游引物5’-gaagatcttcctcggaaatcagtttctgttctgaggagacggtgactga-3’(seqidno:2)，包含限制性内切酶xbai和bglii识别位点、部分载体序列和scfv序列，然后通过xbai和bglii将scfv基因克隆至转座子载体中。本实施例中未注明具体条件的分子生物学实验方法，通常按照常规条件如j.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。质粒ac133-carpiggybactransposon和cd19-carpiggybactransposon的序列如seqidno:3和seqidno:4所示。

2.参考人t细胞核转染试剂盒(lonza，vpa-1002)的说明书，用所述电转混合液悬起1-2×10⁷个pbmc细胞进行电转，电转结束后立刻将细胞转入预热的t细胞培养基；2个小时后再次更换一次培养基；

3.16-18小时后加入含100iu/ml的il-2的t细胞培养基，用偶联有cd3/cd28抗体的磁珠(thermofisherscientific,11141d)刺激激活cd3阳性t细胞；

4.每2至3天更换新的含100iu/ml的il-2的t细胞培养基，同时观察细胞扩增状况。根据其增殖状况决定其刺激时长，但刺激时间不超过一周；

5.分离去除磁珠后，加入1μg/ml嘌呤霉素继续培养5至7天。收取少量细胞用于检测，其余细胞可继续使用快速扩增法进一步大量扩增，得到靶向cd133的cart细胞(cd133-cart细胞)或靶向cd19的car-t细胞(cd19-cart)。

6.本发明以过表达cd133的人胶质瘤细胞系u251(u251cd133-oe)和cd19阳性的raji作为靶细胞，u251cd133-oe的构建方法参考文献prasad,s.,etal.,effectiveeradicationofglioblastomastemcellsbylocalapplicationofanac133/cd133-specifict-cell-engagingantibodyandcd8tcells.cancerres,2015.75(11):p.2166-76。u251和raji均购自中国科学院细胞库。进一步参考以上文献构建稳定表达荧光素酶的靶细胞(u251cd133-oe-luc)。

实施例2

本实施例表明作用在不同腺苷受体上的八种药物对于cd133-cart细胞分泌细胞因子的影响。

为了测定药物对于细胞因子分泌的影响，使用cd133过表达的脑胶质瘤细胞系u251(u251cd133-oe)(来自实施例1)作为靶细胞，靶向cd133的car-t细胞(cd133-cart)(来自实施例1)作为效应细胞，按照效应细胞数与靶细胞之比等于4的比例共培养在96孔板(corning，3599)中，共200μl培养体积(t细胞培养基，见实施例1)，在含5％co2的37℃恒温培养箱中进行，肿瘤细胞5000个/孔，car-t细胞20000个/孔，同时在培养体系中分别加入作用在不同腺苷受体上的八种药物：a1受体激动剂n6-cpa(sigma-aldrich，c8031，药物浓度50mm，使用浓度1μm、5μm、10μm)，拮抗剂kw3902(tocris，4167，药物浓度10mm，使用浓度1μm、5μm、10μm)；a2a受体激动剂cgs21680(abcam，ab120453，药物浓度10mm，使用浓度1μm、5μm、10μm)，拮抗剂sch58261(abcam，ab120439，药物浓度10mm，使用浓度1μm、5μm、10μm)；a2b受体激动剂bay60-6583(cayman，17127，药物浓度20mm，使用浓度1μm、5μm、10μm)，拮抗剂psb603(tocris，3198，药物浓度10mm，使用浓度1μm、5μm、10μm)；a3受体激动剂ib-meca(abcam，ab120438，药物浓度10mm，使用浓度1μm、5μm、10μm)，拮抗剂mre3008f20(tocris，4041，药物浓度50mm，使用浓度1μm、5μm、10μm))和药物溶剂dmso(按照使用药物的最高浓度等体积加入)。24小时后使用alpha-lisa试剂盒检测培养上清中ifn-γ和gm-csf的分泌量，并计算药物处理时与dmso处理时(设为1.0)细胞因子分泌量的比值。结果示于图1a和图1b。

如图1所示，在八种不同药物中腺苷a2b受体激动剂bay60-6583能显著促进cd133-cart细胞分泌细胞因子，且该促进作用随着药物用量的增加而增强。

实施例3

本实施例表明a2b受体激动剂bay60-6583对使用不同激活方式激活的cd133-cart细胞的细胞因子分泌都有影响。

除单独培养的cd133-cart细胞(来自实施例1)之外，还分别使用cd133过表达的脑胶质瘤细胞系u251(u251-oe)(来自实施例1)和包被了抗cd3/cd28的磁珠(thermofisherscientific,11141d)来刺激(刺激过程按照产品说明书进行，磁珠数量与细胞数量之比为3:1；u251-oe的数量为cd133-cart细胞的1/4)cd133-cart细胞(来自实施例1)。磁珠刺激在96孔板(corning公司，3599)中进行，共200μl培养体积(t细胞培养基，见实施例1)，在含5％co2的37℃恒温培养箱中进行，car-t细胞200000个/孔，在以上三种培养体系中分别加入药物bay60-6583(cayman，17127，浓度20mm，药物使用浓度5μm、10μm)和药物溶剂dmso(按照使用药物的最高浓度等体积加入)。24小时后使用alpha-lisa试剂盒检测培养上清中gm-csf，ifn-γ和tnf-α的分泌量，并计算药物处理时与dmso处理时(设为1.0)细胞因子分泌量的比值。结果示于图2a至图2i。

如图2a至图2c所示，在cd133过表达的脑胶质瘤细胞系u251(u251-oe)的刺激下，a2b受体激动剂bay60-6583能显著促进cd133-cart细胞分泌更多的gm-csf，ifn-γ和tnf-α。

如图2d至图2f所示，在包被了抗cd3/cd28的磁珠的刺激下，a2b受体激动剂bay60-6583能显著促进cd133-cart细胞分泌更多的gm-csf，ifn-γ和tnf-α。同时也表明该药物作用于cd133-cart细胞上。

如图2g至图2i所示，在没有被刺激激活的情况下，a2b受体激动剂bay60-6583对于cd133-cart细胞gm-csf，ifn-γ和tnf-α的分泌没有明显作用，表明该药物不能直接激活cd133-cart细胞。

实施例4

本实施例表明a2b受体激动剂bay60-6583对cd133-cart细胞的细胞裂解功能有促进作用。

为了测定cd133-cart细胞的细胞裂解功能，使用表达萤火虫荧光素酶的cd133过表达的脑胶质瘤细胞u251(u251cd133-oe-luc)(来自实施例1)作为靶细胞，靶向cd133的car-t细胞(cd133-cart)(来自实施例1)作为效应细胞，按照效应细胞数与靶细胞之比等于4的比例在白底96孔板(corning，3917)中共培养，共200μl培养体积(t细胞培养基，见实施例1)，在含5％co2的37℃恒温培养箱中进行，肿瘤细胞5000个/孔，car-t细胞20000个/孔，同时在培养体系中分别加入药物bay60-6583(cayman，17127，浓度20mm，药物使用1μm、5μm、10μm)和药物溶剂dmso(按照使用药物的最高浓度等体积加入)。48小时后去除全部培养上清，在加入150ug/ml的萤火虫荧光素酶底物(perkinelmer，货号122799)后使用enspire酶标仪检测生物发光信号，在连续检测6-10分钟之后使用稳定下来信号值按照公式((单独肿瘤细胞信号值-共培养测得信号值)/单独肿瘤细胞信号值)计算出肿瘤细胞的裂解率，并计算药物处理时与dmso处理时(设为1.0)肿瘤细胞裂解率的比值。结果示于图3。

如图3所示，腺苷a2b受体激动剂bay60-6583能显著促进cd133-cart细胞的裂解肿瘤细胞的能力，且该促进作用随着药物用量的增加而增强。

实施例5

本实施例表明在腺苷类似物neca模拟的高浓度腺苷带来的免疫抑制环境下，a2b受体激动剂bay60-6583仍然能促进cd133-cart细胞的细胞裂解功能。

为了测定cd133-cart细胞的细胞裂解功能，使用表达萤火虫荧光素酶的cd133过表达的脑胶质瘤细胞u251(u251cd133-oe-luc)(来自实施例1)作为靶细胞，靶向cd133的car-t细胞(cd133-cart)(来自实施例1)作为效应细胞，按照效应细胞数与靶细胞之比等于4的比例在白底96孔板(corning，3917)中共培养，共200μl培养体积(t细胞培养基，见实施例1)，在含5％co2的37℃恒温培养箱中进行，肿瘤细胞5000个/孔，car-t细胞20000个/孔，先在培养体系中分别加入腺苷类似物neca(abcam，ab120440，浓度50mm，药物使用浓度1μm)(模拟高浓度腺苷带来的免疫抑制环境)和药物溶剂dmso(按照使用药物的最高浓度等体积加入)，在培养1小时后分别加入药物bay60-6583(cayman，17127，浓度20mm，药物使用1μm、5μm、10μm)和药物溶剂dmso(按照使用药物的最高浓度等体积加入)。48小时后去除全部培养上清，在加入150ug/ml的萤火虫荧光素酶底物后使用enspire酶标仪检测生物发光信号，在连续检测6-10分钟之后使用稳定下来信号值按照公式((单独肿瘤细胞信号值-共培养测得信号值)/单独肿瘤细胞信号值)计算出肿瘤细胞的裂解率，并计算药物处理时与dmso处理时(设为1.0)肿瘤细胞裂解率的比值。结果示于图4a和图4b。

如图4a所示腺苷类似物neca模拟的高浓度腺苷带来的免疫抑制环境会显著的抑制cd133-cart细胞裂解肿瘤细胞的能力。

如图4b所示腺苷a2b受体激动剂bay60-6583在低浓度使用时能恢复由腺苷类似物neca模拟的高浓度腺苷带来的免疫抑制环境造成的cd133-cart细胞的裂解能力下降，而随着使用浓度的增加，腺苷a2b受体激动剂bay60-6583会显著提高cd133-cart细胞的裂解能力。

实施例6

本实施例表明a2b受体激动剂bay60-6583对刺激活化的cd19-cart细胞的细胞因子分泌有促进作用。

为了测定药物对于细胞因子分泌的影响，分别使用cd19阳性的淋巴瘤细胞raji(购自中国科学院细胞库)和cd19阴性的淋巴瘤细胞k562(购自中国科学院细胞库)作为靶细胞，靶向cd19的car-t细胞(cd19-cart)(来自实施例1)作为效应细胞，按照效应细胞数与靶细胞之比等于4的比例在96孔板(corning，3599)中共培养，共200μl培养体积(t细胞培养基，见实施例1)，在含5％co2的37℃恒温培养箱中进行，肿瘤细胞5000个/孔，car-t细胞20000个/孔，同时在培养体系中分别加入药物bay60-6583(cayman，17127，浓度20mm，药物使用1μm、5μm、10μm)和药物溶剂dmso(按照使用药物的最高浓度等体积加入)。24小时后使用alpha-lisa试剂盒检测培养上清中gm-csf，ifn-γ和tnf-α的分泌量，并计算药物处理时与dmso处理时(设为1.0)细胞因子分泌量的比值。结果示于图5a至图5f。

如图5a至图5c所示，在cd19阳性的淋巴瘤细胞系raji的刺激下，a2b受体激动剂bay60-6583能显著促进cd19-cart细胞分泌更多的gm-csf，ifn-γ和tnf-α。

如图5d至图5f所示，在cd19阴性的淋巴瘤细胞系k562的共培养过程中cd19-cart没有被刺激激活，a2b受体激动剂bay60-6583对于cd19-cart细胞gm-csf，ifn-γ和tnf-α的分泌没有促进作用，表明该药物不能作用于未激活的cd19-cart细胞

实施例7

本实施例表明在cd133-cart细胞的激活增殖过程中加入a2b受体激动剂bay60-6583对于cd133-cart细胞的增殖和分化状态的影响。

cd133-cart细胞的刺激增殖过程(来自实施例1)中，按照1000000个细胞/组进行分组，放置在48孔板中(corning，3548)，每组1ml含300iu/mlil-2和0.5μg/ml嘌呤霉素的培养体积(t细胞培养基，见实施例1)，在含5％co2的37℃恒温培养箱中进行扩增培养。在刺激当天分别加入药物bay60-6583(cayman，17127，浓度20mm，药物使用1μm、5μm)和药物溶剂dmso(按照使用药物的最高浓度等体积加入)，每间隔2-3天更换新的含il-2和嘌呤霉素以及对应药物的培养基(t细胞培养基，见实施例1)。在培养中的第六天(d6)和最后的第十天(d10)分别对不同处理条件下的细胞计数。结果示于图6a。并在第十天使用cd45ro(bdbiosciences，555493)和cd62l(bdbiosciences，559772)的抗体及其对应的同型对照抗体(bdbiosciences，555574和555751)对细胞进行染色，分析它们的分化情况。结果示于图6b至图6g。

如图6a所示，在cd133-cart细胞的激活增殖过程中加入a2b受体激动剂bay60-6583对于cd133-cart细胞的增殖没有抑制作用。

如图6b至图6d所示，cd45ro和cd62l的同型对照抗体标记可以帮助区分四个细胞亚群：cd45ro-，cd62l+的记忆干细胞(tstemmemorycells，tscm)；cd45ro+，cd62l+的中央记忆细胞(centralmemorycells，tcm)；cd45ro+，cd62l-的效应记忆细胞(effectmemorycells，tem)；cd45ro-，cd62l-的效应细胞(effectcells，te)。

如图6e至图6g所示，在含有a2b受体激动剂bay60-6583条件下扩增得到的cd133-cart细胞中，分化程度较低的tscm和tcm比例更高。

实施例8

本实施例表明在cd133-cart细胞的激活增殖过程中加入a2b受体激动剂bay60-6583对于cd133-cart细胞的功能的影响。

在含有a2b受体激动剂bay60-6583的cd133-cart细胞的激活增殖(见实施例7)结束后，将细胞在不含il-2和嘌呤霉素的培养基(t细胞培养基，见实施例1)中培养48h，48h后检测它们的功能：使用表达萤火虫荧光素酶的cd133过表达的脑胶质瘤细胞u251(u251cd133-oe-luc)(来自实施例1)作为靶细胞，不同条件下增殖得到的靶向cd133的car-t细胞(cd133-cart)(来自实施例7)作为效应细胞，按照效应细胞数与靶细胞之比等于4的比例共培养在96孔板(corning，3599)中，共200μl培养体积(t细胞培养基，见实施例1)，在含5％co2的37℃恒温培养箱中进行，肿瘤细胞5000个/孔，car-t细胞20000个/孔。24小时后使用alpha-lisa试剂盒检测培养上清中ifn-γ，gm-csf和tnf-α的分泌量，并计算药物处理时与dmso处理时(设为1.0)细胞因子分泌量的比值。结果示于图7b至图7d。48小时后去除全部培养上清，在加入150ug/ml的萤火虫荧光素酶底物后使用enspire酶标仪检测生物发光信号，在连续检测6-10分钟之后使用稳定下来信号值按照公式((单独肿瘤细胞信号值-共培养测得信号值)/单独肿瘤细胞信号值)计算出肿瘤细胞的裂解率，并计算药物处理时与dmso处理时(设为1.0)肿瘤细胞裂解率的比值。结果示于图7a。

如图7a所示，在含有a2b受体激动剂bay60-6583条件下扩增得到的cd133-cart细胞的细胞裂解功能较弱，这与细胞拥有较低的分化程度相匹配。

如图7b至图7d所示，在含有a2b受体激动剂bay60-6583条件下扩增得到的cd133-cart细胞ifn-γ，gm-csf和tnf-α的分泌量较少，这与细胞拥有较低的分化程度相匹配。

以上所述仅为本发明较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

seqidno:1:引物

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seqidno:2:引物

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<110>上海科技大学

<120>一种增强免疫效应细胞功能的方法

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