一种知母多糖的提取纯化方法与流程

本发明属于生物
技术领域：
，具体涉及一种知母多糖的提取纯化方法。
背景技术：
：多糖是一类天然高分子化合物，它是由醛糖或酮糖组成的，由10个以上单糖通过苷键连接而成的多聚物，是构成生命的四大基本物质之一，在生命活动中扮演重要角色。人们对于糖类的早期研究只注意到它作为细胞的组成成分和能源物质的重要性，后来发现有些多糖可以作为细胞表面专一的识别信号，起传递信息的作用，参与了生命科学中细胞的各种活动，具有多种多样的生物学功能，例如多糖具有抗病毒、抗衰老、抗炎、抗补体、抗溃疡、降血糖、降血压以及抗血栓等作用，还有免疫调节与抗肿瘤的生物学功效，它能激活免疫受体，提高机体的免疫功能。多糖广泛存在中药草中，例如知母中。知母为百合科多年生草本植物知母(AnemarrhenaasphodeloidesBunge)的干燥根茎，始载于《神农本草经》，列为中品，性苦寒，具有滋阴降火、润肠滑燥、止渴除烦、利大小便等作用，是中医传统药物，临床用于外感热病、高热烦渴、肺热燥咳、骨蒸潮热、内热消渴和肠燥便秘等症状。知母中富含甾体皂苷、双苯吡酮类、黄酮类、木脂素类、多糖类、有机酸类及微量元素等成分。同时研究表明知母具有抗炎、抗氧化、抗辐射、抗病毒和抗肿瘤、抗血小板聚集和免疫调节作用，可以改善记忆力和老年痴呆症状、降脂、抗动脉粥样硬化、改善骨质疏松症状、降血糖和治疗糖尿病等功效。专利申请号CN201110120368.8由知母饮片提取知母多糖的方法，这个专利申请已经视为为放视弃为失效，本发明公开了一种由知母饮片提取知母多糖的方法。该方法过程包括：知母饮片乙醇提取除去小分子，残渣干燥用去离子水提取，提取液合并浓缩，用乙醇沉淀，抽滤，得到上清和滤饼两部分，滤饼洗涤得到含中性多糖N1的浸膏；上清用乙醇沉淀，抽滤，洗涤滤饼得到含中性多糖N2的浸膏；水提残渣干燥之后用碱液提取，提取液用盐酸中和至中性，浓缩之后沉淀，抽滤，得到上清和滤饼两部分，滤饼洗涤得到含酸性多糖A1的浸膏；上清用乙醇沉淀，抽滤，洗涤滤饼得到含酸性多糖A2的浸膏。本发明的优点在于利用知母残渣，在水提基础之上采用了碱提，提高了知母多糖的提取率，丰富了知母中多糖的种类及提高了多糖的含量。专利申请号CN201110087706.2一种知母多糖提取物及其制备方法和医药用途，本发明涉及一种知母多糖提取物及制备方法和医药用途。制备方法包括原料脱脂后，再经过水提取、醇沉淀得到粗多糖，粗多糖经过透析、离子交换层析脱去蛋白、色素，除去小分子化学成分，制成较高纯度的知母多糖提取物。本发明提取物中知母多糖的含量以葡萄糖计，所述多糖的含量占知母提取物重量百分比60％以上。本发明通过大量的药理学实验发现，知母多糖提取物具有免疫抑制活性，用于治疗免疫炎性损伤性疾病：肾炎、肺炎、上呼吸道感染、肝炎、扁桃体炎及糖尿病的医药用途。以上两个申请专利仅是对知母多糖进行了提取研究，缺少纯化步骤，仅能获得粗知母多糖，同时也缺少测定相应的化学指标和单糖组成的方法。技术实现要素：有鉴于此，本发明的目的在于提供一种知母多糖的提取纯化方法，包括以下步骤：1)知母的预处理，获得知母粉末；2)使用有机溶剂对知母粉末进行脱脂；3)通过水提取、醇沉淀提取获得粗知母多糖；4)粗知母多糖精制：透析膜透析去低分子量杂质，DEAE-琼脂糖凝胶柱吸附分离获得知母多糖解析液，透析膜透析制得知母多糖精制组分。优选地，本发明所述的知母多糖的提取纯化方法中，所述知母粉末为40～60目粉末。优选地，本发明所述的知母多糖的提取纯化方法中，所述有机溶剂脱脂包括使用乙醇脱脂之后，使用丙酮脱脂；更优选地，本发明所述有机溶剂脱脂包括以下步骤：(1)乙醇脱脂：将知母粉末浸入其重量为10倍、质量浓度为85％的乙醇中，在70℃加热回流搅拌2h，经冷却后室温下继续搅拌12h，去除液体；二次加入其重量10倍、质量浓度为85％的乙醇，室温下搅拌5h，去除液体；(2)丙酮脱脂：将乙醇脱脂后的知母粉加入重量5倍、质量浓度为99％的丙酮溶液，搅拌30分钟后去除液体，将该粉末在室温下自然干燥，得到脱脂知母粉末。优选地，本发明所述的知母多糖的提取纯化方法中，所述步骤3)通过水提取、醇沉淀提取获得粗知母多糖包括以下步骤：将步骤2)获得的脱脂知母粉末加入重量15-20倍的水，在90℃下加热回流搅拌2h，冷却后离心得到提取液，残渣继续用同样的方式再提取一次，合并两次得到的提取液，在50℃条件下浓缩至原体积的1/3；在所述浓缩液中加入乙醇，乙醇浓度不低于75％，调整温度至4℃、静置12h、有多糖絮状物析出，滤除液体，在室温下自然干燥；先后用所述多糖絮状物重量5倍的无水乙醇和5倍的丙酮分别洗涤，取沉淀物自然干燥，制得粗知母多糖。优选地，本发明所述的知母多糖的提取纯化方法中，所述粗知母多糖精制包括以下步骤：a.去除所述粗知母多糖的低分子量杂质：将步骤3)制得的粗知母多糖加入重量10倍的水，用3500Da透析膜透析分离，获得分子量大于3500Da的透析液，冻干制得除杂质知母多糖；b.吸附分离：将步骤a制得的除杂质知母多糖加入重量为0.04倍的水溶解、加热至60℃溶解，用DEAE-琼脂糖凝胶柱色谱分离，通过洗脱液洗脱获得解析液；c.精制获得知母多糖精制组分：将步骤b所得的解析液用3500Da透析膜透析，取分子量大于3500Da的透析液进行冻干即得。更优选地，本发明所述的知母多糖的提取纯化方法中，所述步骤c中使用洗脱液洗脱为先使用蒸馏水洗脱获得初段解析液，再以NaCl洗脱获得次段解析液。更优选地，本发明所述的知母多糖的提取纯化方法中，所述步骤c中使用洗脱液洗脱为先用蒸馏水控制流速1.5mL/min冲洗1h后、收集解析液4h，获得初段解析液；再用0.5MNaCl以同样流速继续冲洗2h后、收集解析液3h；提高解析剂NaCl浓度为1.0M，继续收集解析液3h，获得次段解析液。本发明还提供了上述知母多糖的提取纯化方法获得的知母多糖精制组分。本发明与现有技术相比，本发明具有以下优点：本发明首次提出了知母多糖精制组分的提取方法，通过该方法获得知母多糖精制组分与传统方法获得粗知母多糖相比，具有不同比例的化学成分和单糖组成，不同的分子量大小，而且部分精制组分表现出了对小鼠巨噬细胞RAW264.7更高的激活能力，以及对促进iNOS和相关细胞因子mRNA的表达更强的激活效果。附图说明图1为本发明的一个实施例中的粗知母多糖、精制组分的RI和UV图谱图；图2为本发明的一个实施例中的粗知母多糖、精制组分对巨噬细胞增殖影响图；图3为本发明的一个实施例中的粗知母多糖、精制组分对RAW264.7细胞NO产量和iNOS、细胞因子mRNA表达的影响；图4为本发明的一个实施例中的知母多糖精制组分2激活巨噬细胞产生细胞因子情况示意图。具体实施方式下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例1知母多糖的提取纯化方法a、预处理：将知母去除杂质后，60℃烘干，研磨至40目粉末；b、脱脂：(1)乙醇脱脂：将a步骤处理的知母粉末浸入其重量为10倍、质量浓度为85％的乙醇中，在70℃加热回流搅拌2h，经冷却后室温下继续搅拌12h，去除液体；二次加入其重量10倍、质量浓度为85％的乙醇，室温下搅拌5h，去除液体，获得乙醇脱脂后的知母粉末；(2)丙酮脱脂：将乙醇脱脂后的知母粉末加入其重量5倍、质量浓度为99％的丙酮溶液，搅拌30分钟后去除液体，将该粉末在室温下自然干燥，得到脱脂知母粉末；c、多糖提取：将b步骤制得的脱脂知母粉末加入其重量15-20倍的水，在90℃下加热回流搅拌2h，冷却后离心得到提取液，残渣继续用同样的方式再提取一次，合并两次得到的提取液，在50℃条件下浓缩至原体积的1/3止；在该浓缩液中加入乙醇，至其体系中乙醇浓度不低于75％，调整温度至4℃、静置12h、有多糖絮状物析出，滤除液体，在室温下自然干燥；先后用多糖絮状物重量5倍的无水乙醇和5倍的丙酮分别洗涤，取沉淀物自然干燥，制得粗知母多糖；d、粗知母多糖精制：(1)去低分子量杂质：将c步骤制得的粗知母多糖加入其重量10倍的水，用3500Da透析膜透析分离，取其分子量大于3500Da的透析液，将其冻干，制得除杂质知母多糖；(2)吸附分离：将(1)步骤制得的除杂质知母多糖加入其重量为0.04倍的水溶解、加热至60℃溶解；用DEAE-琼脂糖凝胶柱色谱(17-0709-01,GEHealthcareBio-ScienceAB,Uppsala,Sweden)分离，首先用蒸馏水控制流速1.5mL/min冲洗1h后、收集解析液4h，命名为解析液1；再用0.5MNaCl以同样流速继续冲洗2h后、收集解析液3h；提高解析剂NaCl浓度为1.0M，继续收集解析液3h，命名为解析液2；(3)精制：将(2)步骤所得的解析液1和解析液2分别用3500Da透析膜透析，取其分子量大于3500Da的透析液进行冻干，制得知母多糖精制组分1和精制组分2。(4)指标测定：测定粗知母多糖、精制组分1和精制组分2的得率、化学成分和单糖组成(参见表1)，分子量(参见图1和表2)，测定生物活性(参见图2)，分析了精制组分2的链接方式(参见表3)和细胞因子产量(参见图3)。表1粗知母多糖和精制组分的得率、化学成分和单糖组成a得率＝(粗知母多糖重量/知母重量)×100b得率＝(精制组分重量/注入分离柱粗知母多糖的重量)×100n.d.c表示没有检测出从知母中提取得到的粗知母多糖经纯化得到两个组分，命名为精制组分1、精制组分1，得率、化学成分和单糖组成见表1。粗知母多糖和两个组分的总糖含量为51.4％～89.7％，蛋白质含量为1.9％～14.5％，硫酸根含量为3.4％～8.1％，糖醛酸含量为1.0％～30.2％。单糖组成主要为甘露糖，还含有不同含量的葡萄糖、阿拉伯糖、半乳糖、木糖和鼠李糖。同时利用HPSEC-UV-MALLS-RI系统分析了知母多糖的分子特性，UV和RI色谱图见图1(其中，图1A、B、C分别为粗知母多糖、精制组分1、精制组分2的UV和RI色谱图)，分子量和回转半径见表2，可知粗知母多糖和精制组分1由两个峰组成(PeakⅠ和PeakⅡ)，F2由一个峰组成，分子量为130.0×103～515.5×103u，回转半径为91.2～301.2nm。表2知母多糖的平均分子量(Mw)、回转半径(Rg)实施例2知母多糖的精制组分效果试验将实施例1获得的粗知母多糖、精制组分1、精制组分2进行如下处理分析：1)激活巨噬细胞增殖情况测定细胞增殖采用WST-1(2-(4-碘苯)-3-(4-硝基苯)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四氮唑钠盐)细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒(EZ-cytox，DaeillabserviceCO.,LTD，Korea)，具体方法如下：100μLRAW264.7细胞(1×106个/mL)(ATCC)加入96微孔板中，在37℃5％CO2培养箱(ExcellaECO-170，NewBrunswickScientific，Scotland)中预培养24h，弃去上清液，细胞中加入200μL不同浓度的样品溶液，培养液做为空白组。培养24h后弃去上清液，细胞中加入110μL体积分数10％WST-1溶液，继续在培养箱中培养1h，在450nm波长下用酶标仪(EL-800，BioTekinstruments，Winooski，VT，USA)下测定吸光值，细胞增殖率计算公式如下：如图4所示，可知实施例1获得的粗知母多糖和精制组分1、精制组分2于巨噬细胞的增殖率影响都超过100％，说明对巨噬细胞没有毒性，而且可以促进细胞增殖。2)多糖激活巨噬细胞产生一氧化氮测定与RT-PCR检测细胞因子mRNA表达A.多糖激活巨噬细胞产生一氧化氮测定样品的NO产量是利用巨噬细胞上清液进行测定的，具体方法是100μLRAW264.7细胞(1×106个/mL)加入96微孔板中，在37℃含有5％CO2的培养箱中预培养24h，倒出上清液，加入200μL不同浓度的测试样品溶液(2、5和10μg/mL)，培养液作为阴性对照，1μg/mLLPS作为阳性对照。培养24h后吸取100μL上清液加入100μLGriess试剂，室温下避光反应10min后540nm波长下用酶标仪测定吸光度，以亚硝酸钠作为标准曲线计算NO产量。B.RT-PCR检测细胞因子mRNA表达1mLRAW264.7细胞(1×106个/mL)加入到24孔板中，在含有5％CO2培养箱中37℃预培养24h，弃去上清液，细胞中分别加入1mLLPS(2μg/mL)和不同浓度的样品溶液(2、5和10μg/mL)培养18h。之后用Trizol(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)对细胞进行裂解提取总RNA，利用微量分光光度计(MS-1000，Tech&innovation，China)测定RNA浓度，调整浓度后以RNA为模板经逆转录合成cDNA，再以cDNA为模板加入上下游引物。扩增的产物经过电泳后照相，得到的条带利用QuantityOne1DAnalysisSoftware进行分析，之后同β-actin进行对比得到细胞因子mRNA表达的相对浓度。结果如下：同时分析了知母多糖激活RAW264.7细胞产生NO能力，结果见图3A，粗知母多糖和两个精制组分均可刺激RAW264.7细胞产生一定浓度的NO，而且在2、5、10μg/mL的浓度范围内表现出浓度依赖性，精制组分1、精制组分2则表现出对RAW264.7细胞最高的激活能力。粗知母多糖和两个精制组分都能促进iNOS和相关细胞因子mRNA的表达(图3B和3C)，同其他组分相比，精制组分1、精制组分2处理组表现出最强的激活效果(参见图4，其中A为各个处理对RAW264.7细胞的TNF-α，COX-2，IL-1细胞因子表达的电泳图；B为各个处理对RAW264.7细胞的TNF-αmRNA表达相对浓度；C为各个处理对RAW264.7细胞的COX-2mRNA表达相对浓度；D为各个处理对RAW264.7细胞的IL-6mRNA表达相对浓度)。由上可知，精制组分2表现出最强的生物活性，所以对其链接方式进行分析，结果见表3。可知其主链是由1→4链接甘露糖残基构成的，同时含有少量的其它残基。表3知母多糖精制组分2甲基化分析结果出峰编号糖苷键类型峰面积(％)1Araf-(1→12.62Xylf-(1→2.73→4)-Ara-(1→5.64Glu-(1→1.65Gal/-(1→3.86→2)-Gal/-(1→2.37→4)-Glu-(1→0.48→4)-Man/(1→51.29→3)Gal-(1→4.610→3)-Gal/-(1→2.811→6)-Gal/-(1→1.512→3,4)-Gal/-(1→0.713→2,6)-Gal/-(1→0.414→3,6)-Glu-(1→6.4以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
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的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。当前第1页1 2 3