一株中度嗜盐专性嗜碱放线菌的制作方法

本发明涉及一株放线菌。
背景技术：
：放线菌因菌落呈放线状而的得名，是一个原核生物类群，在自然界中分布很广，主要以孢子繁殖，其次是断裂生殖。与一般细菌一样，多为腐生，少数寄生。放线菌在自然界分布广泛，主要以孢子或菌丝状态存在于土壤、空气和水中，尤其是含水量低、有机物丰富、呈中性或微碱性的土壤中数量最多。放线菌只是形态上的分类，属于细菌界放线菌门。土壤特有的泥腥味，主要是放线菌的代谢产物所致。随着人类认识放线菌的能力和手段不断提高，越来越多的放线菌种类被发现和描述。迄今有效描述的菌种约达2000个，其中链霉菌属的种500多个，占了很大比例。因此链霉菌也被称为常见放线菌，常规检出率占放线菌95％，而其他种类放线菌的常规检出率仅占5％左右，被成为稀有放线菌。据统计，目前分离到的自然界中的放线菌种类仅为实际种类的0.1～0.5％。技术实现要素：本发明提供了一株中度嗜盐专性嗜碱放线菌，该菌株具有优异的耐盐性和耐碱性。本发明中度嗜盐专性嗜碱放线菌为nesterenkoniazhaoyuanensisapah6-5，nesterenkoniazhaoyuanensisapah6-5，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为cgmccno.14773，保藏日期为2017年9月29日。nesterenkoniazhaoyuanensisapah6-5在ws培养基中培养菌落为浅黄色、圆形、较小，边缘光滑整齐有光泽，不透明，易挑取。nesterenkoniazhaoyuanensisapah6-5菌体呈短杆状(如图13所示)、不产芽孢，革兰氏染色阳性，不能水解淀粉。过氧化酶、碱性磷酸盐酶、白氨酸芳胺酶、缬氨酸芳胺酶、酸性磷酸酶、半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、α-葡萄糖苷酶和β-葡萄糖苷酶活性均为阳性，而类脂酶、胱氨酸芳胺酶、胰蛋白酶、α-半乳糖苷酶、n-乙酰-葡萄糖胺酶、α-甘露糖苷酶和β-岩藻糖苷酶活性均为阴性(如图14所示)。nesterenkoniazhaoyuanensisapah6-5抗生素敏感性试验：对青霉素g、氨苄青霉素、利福平、新生霉素、红霉素、氯霉素、万古霉素、林可霉素和头孢噻吩敏感，而对卡那霉素、四环素、氟哌酸、杆菌肽、多粘菌素b、庆大霉素和萘啶酸具有耐受性。采用细菌通用引物27f和1492r扩增了nesterenkoniazhaoyuanensisapah6-5的16srrna基因序列并测序，获得1432bp的目的片段。经blastn比对后发现，该序列与nesterenkonia属的成员同源性高，测定其属于涅斯捷连科氏菌属(nesterenkonia)，并根据dna-dna杂交试验结果确定为涅斯捷连科氏菌属(nesterenkonia)新种。本发明nesterenkoniazhaoyuanensisapah6-5为中度嗜盐、专性嗜碱菌，且具有溶磷性。中度嗜盐菌是在0.5～2.5mnacl浓度环境中生长最佳的微生物类群，由于其具有较宽的盐浓度耐受范围，且对营养要求简单、能利用多种有机物作为碳源能源。碱性土壤中因富含石灰质，其可溶性磷含量较低，当使用化学磷肥后大部分磷与土壤中的ca2+、fe3+、al3+等结合形成难溶性磷酸盐而被固定，不能被植物吸收利用。利用微生物的解磷作用将土壤中难于被植物吸收利用的磷转化为可吸收利用的形态，从而增加土壤中速效磷的含量，产生有机酸和活性酶类，既可释放出土壤中的迟效态氮磷钾、改善土壤的理化性质、提高土壤肥力，又能促进植物生长、增强植物抗病能力，对于盐碱土壤的生态修复具有重要的应用前景。本发明nesterenkoniazhaoyuanensisapah6-5属于稀有放线菌资源，其特殊的生境决定了其不仅是研究生物进化和系统发育的极好材料，而且该菌株在生物环保、食品、制药、工业发酵及农业生产等方面具有广泛的应用前景。nesterenkoniazhaoyuanensisapah6-5属于涅斯捷连科氏菌属(nesterenkonia)；保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，保藏地址是中国北京，北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏号为cgmccno.14773，保藏日期为2017年9月29日。附图说明图1是nesterenkoniazhaoyuanensisapah6-5在ws培养基上形成的菌落照片。图2是nesterenkoniazhaoyuanensisapah6-5近源菌株nesterenkoniahalophile在ws培养基上形成的菌落照片。图3是nesterenkoniazhaoyuanensisapah6-5近源菌株nesterenkoniahalobia在ws培养基上形成的菌落照片。图4是nesterenkoniazhaoyuanensisapah6-5基于16srrna基因构建的系统进化树。图5是在nacl不同浓度情况下nesterenkoniazhaoyuanensisapah6-5、nesterenkoniahalophila和nesterenkoniahalobia的生长曲线图。图6是在kcl不同浓度情况下nesterenkoniazhaoyuanensisapah6-5、nesterenkoniahalophila和nesterenkoniahalobia的生长曲线图。图7是在mgcl不同浓度情况下nesterenkoniazhaoyuanensisapah6-5、nesterenkoniahalophila和nesterenkoniahalobia的生长曲线图。图8是nesterenkoniazhaoyuanensisapah6-5在不同ph条件下的生长曲线图。图9是nesterenkoniahalophila在不同ph条件下的生长曲线图。图10是nesterenkoniahalobia在不同ph条件下的生长曲线图。图11是nesterenkoniazhaoyuanensisapah6-5无机磷固体培养基培养60h照片。图12是nesterenkoniazhaoyuanensisapah6-5无机磷液体培养基溶磷量及培养液ph动态变化曲线图。图13是nesterenkoniazhaoyuanensisapah6-5菌株菌体扫描电镜照片。图14是nesterenkoniazhaoyuanensisapah6-5菌株在apizym试剂盒上的显色结果图。具体实施方式本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。具体实施方式一：本实施方式中度嗜盐专性嗜碱放线菌为nesterenkoniazhaoyuanensisapah6-5，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为cgmccno.14773。nesterenkoniazhaoyuanensisapah6-5分离筛选自黑龙江省肇源县盐碱化土壤(土地未被利用)，采用传统微生物分离纯化方法(平板划线分离法)获得。分离筛选采用碱性含盐的apa固体培养基，培养基中nacl50.0g/l、k2hpo42.0g/l、mgso4·7h2o1.0g/l、protease-peptone5.0g/l、yeastextract5.0g/l、glucose1.0g/l、na2co35.0～10.0g/l(过滤除菌，使用前加入)、agar18～20g/l。采用细菌通用引物27f和1492r扩增了nesterenkoniazhaoyuanensisapah6-5的16srrna基因序列并测序，获得1432bp的目的片段。经blastn比对后发现，该序列与nesterenkonia属的成员同源性高，其中亲缘关系最近的两个种分别为nesterenkoniahalobia和nesterenkoniahalophila，同源性均为97％。基于16srrna基因构建的系统进化树表明(如图4所示)，nesterenkoniazhaoyuanensisapah6-5与目前nesterenkonia属包含的所有成员聚类在一起，与之亲缘关系最近的为nesterenkoniahalobia(相似性97.5％)和nesterenkoniahalophila(相似性97.5％)，而进化树中nesterenkoniahalobia和nesterenkoniahalophila之间的进化距离为0.002。因此，测定nesterenkoniazhaoyuanensisapah6-5为涅斯捷连科氏菌属(nesterenkonia)菌株。dna-dna杂交试验结果如表1所示。根据国际系统细菌学委员会的规定的dna同源性≥70％定义为种，因此nesterenkoniazhaoyuanensisapah6-5为不同于nesterenkoniahalobia和nesterenkoniahalophila的涅斯捷连科氏菌属(nesterenkonia)的一个新种。表1dna-dna杂交菌株第一次试验结果第二次试验结果第三次试验结果apah6-5×n.halobia29.26％32.66％34.10％apah6-5×n.halophila34.16％36.67％38.58％将nesterenkoniazhaoyuanensisapah6-5接种于ws培养基置于35℃环境培养48小时，nesterenkoniazhaoyuanensisapah6-5的菌落为浅黄色、圆形、较小，边缘光滑整齐有光泽，不透明，易挑取(如图1所示)。将同属近源对照菌株nesterenkoniahalophila和nesterenkoniahalobia也接种于ws培养基置于35℃环境培养48小时，nesterenkoniahalophile的菌落为奶油色(如图2所示)，nesterenkoniahalobia的菌落为奶油色且使培养基颜色变黄(如图3所示)。其中，ws培养基每升由7.5gcasaminoacid、10.0gyeastextract、3.0gtrisodiumcitrate、60.0gnacl、1.0gmgso4·7h2o、0.05gfeso4·7h2o和余量的蒸馏水组成，并用2g/lnahco3调节ph至9.0。nesterenkoniazhaoyuanensisapah6-5与同属近源对照菌株nesterenkoniahalophila和nesterenkoniahalobia的抗生素敏感性差异如表2所示。表2特征apah6-5n.halobian.halophila淀粉水解－+－酪素水解+－+硝酸盐还原－+－链霉素(10μg/片)耐受敏感敏感新霉素(30μg/片)耐受耐受敏感nesterenkoniazhaoyuanensisapah6-5与同属近源对照菌株nesterenkoniahalophila和nesterenkoniahalobia选用ws培养基进行耐盐性试验(检测结果如表3所示)，并绘制各自在nacl、kcl、mgcl不同浓度情况下的生长曲线(如图5～7所示)。表3nesterenkoniazhaoyuanensisapah6-5与同属近源对照菌株nesterenkoniahalophila和nesterenkoniahalobia选用ws培养基进行嗜碱性试验绘制各自在不同ph条件下的生长曲线(如图8～10所示)。nesterenkoniazhaoyuanensisapah6-5具嗜碱特性，即在中性条件下不能生长，最适生长发生在ph9.0～9.5，为专性嗜碱菌；而对照菌株nesterenkoniahalophila和nesterenkoniahalobia为耐碱性菌。溶磷能力：采用无机磷固体培养基初步判定菌株nesterenkoniazhaoyuanensisapah6-5具溶磷能力(如图11所示)，无机磷液体培养基发酵试验结果如图12所示，nesterenkoniazhaoyuanensisapah6-5培养至60h时其溶磷量达109.3mg/l，培养液ph与溶磷量呈负相关，即随着培养时间的延长培养液ph呈下降趋势，初步推断nesterenkoniazhaoyuanensisapah6-5为溶磷菌，培养时间的延长培养液ph呈下降趋势，初步推断的溶磷机制为有机酸溶磷或者质子溶磷。溶磷菌一方面可将土壤中的难溶性磷转化为被植物吸收利用的可溶性磷，为植物提供可吸收的磷元素，另一方面溶磷菌可降低其生存环境的ph。其中，无机磷液体培养基由10.0g葡萄糖、0.5g(nh4)2so4、0.3gnacl、0.3gkcl、0.3gmgso4·7h2o、0.03gfeso4·7h2o、0.03gmnso4·4h2o、5gca2(po4)2及1000ml蒸馏水，并调节ph值为7.0～7.2，120℃高压灭菌20min。当前第1页12