用于筛选冬瓜实时荧光定量PCR内参基因EF-1α的引物的制作方法

本发明属于生物技术领域，具体涉及用于筛选冬瓜不同组织和低温胁迫下实时荧光定量pcr内参基因ef-1α的引物。

背景技术

冬瓜（benincasahispidacogn.）属葫芦科冬瓜属一年生蔓性草本植物。冬瓜的花、叶、果皮、果肉、种子具有很好的药食兼用价值，可用于治疗咳嗽、哮喘等疾病。同时，瓜中富含氨基酸、维生素c、酚类等活性化合物，这些化合物在预防慢性疾病方面具有一定作用，并且冬瓜是瓜菜中唯一不含脂肪的瓜菜，富含丙醇二酸成分，能抑制糖类物质转化为脂肪成分。随着研究的深入，利用分子生物学技术了解冬瓜功能成分和调控机理相关基因表达成为重要的研究方向。

目前关于冬瓜不同部位和低温胁迫条件下的内参基因的研究还未见报道。本发明以分别以“黑皮冬瓜”不同组织（根、茎、叶、花）和4℃低温处理0、1、6、12、24h下2片真叶为材料，利用genorm、normfinder和bestkeeper对7个候选内参基因的表达稳定性分析评价，筛选出延伸因子-1α(elongationfactor1-alpha,ef-1α)基因作为合适的内参基因，为冬瓜后续相关基因表达研究提供参考。

技术实现要素：

本发明的目的是提供用于筛选冬瓜不同组织实时荧光定量pcr内参基因ef-1α的引物，本发明中的1对内参基因引物序列特异性扩增高，扩增效率接近，线性相关性好，可用于筛选冬瓜不同组织和低温胁迫下稳定的内参基因。

本发明是通过以下技术方案解决上述技术问题的：

以冬瓜dna为模板、以冬瓜转录组测序为基础，利用primerpremier5.0软件、并遵循实时荧光定量pcr引物设计的原则设计出7对荧光定量特异引物，最终根据数据分析，确定该对荧光定量特异引物即为所述实时荧光定量pcr引物；

且该实时荧光定量pcr引物为：

正向引物5'-accgtctatcaagcaccc-3'，

反向引物5'-ccaagtccgcagtcaag-3'。

本发明的有益效果在于：

本发明提供用于筛选冬瓜实时荧光定量pcr内参基因的引物，所设计的实时荧光定量pcr引物用于冬瓜基因表达分析时，能够提高中冬瓜基因表达分析研究的稳定性、可靠性和重复性；此外，所设计的实时荧光定量pcr引物特异性强，从而能够大大的提高了采用实时荧光定量检测冬瓜的检测效率，并提高了检测结果的可信度。

附图说明

下面参照附图结合实施例对本发明作进一步的描述。

图1是冬瓜7个候选内参基因扩增结果。

图2a28s候选内参基因qrt-pcr融解曲线。

图2bef-1α候选内参基因qrt-pcr融解曲线。

图2cgapdh候选内参基因qrt-pcr融解曲线。

图2drpii候选内参基因qrt-pcr融解曲线。

图2etua候选内参基因qrt-pcr融解曲线。

图2fubc21候选内参基因qrt-pcr融解曲线。

图2gubq候选内参基因qrt-pcr融解曲线。

图3是7个候选内参基因平均ct值分布。

图4genorm软件分析不同组织和低温胁迫下的vn/vn+1。

具体实施方式

本发明列举了以下几个代表性实施例，这些实施例仅是示例性的，且不用于限制本发明的范围，这些实施例仅用于对本发明进行说明。且各实施例中所采用的仪器与试剂如下：美国abi7500实时定量pcr仪，美国abiveriti96-well热循环仪，美国abipowersybr®greenpcrmastermix,、cdna第一链合成试剂盒（primescripttm1ststrandcdnasynthesiskit）、markerdl2000、taqdnapolymerase、dntp均为宝生物工程（大连）有限公司产品，引物合成由铂尚生物技术(上海)有限公司完成，其余生化试剂均为国产分析纯。

实施例1总rna提取和cdna的合成

供试材料“黑皮冬瓜”统一播种于福建省农科院作物所福清市东张镇蔬菜科研基地。穴盘育苗，待幼苗长至三叶一心时分别放入培养箱进行处理。第一组：正常栽培条件，取根、茎、叶、花四个部分；第二组：4℃处理0、1、6、12、24h，取2片真叶。利用bioteke公司通用植物总rna提取试剂盒提取rna，通过浓度为1％的琼脂糖凝胶电泳和uv1000分光光度计检测总rna完整性和浓度。样品利用takara公司primescript^™ii1ststrandcdnasynthesiskit试剂盒的方法合成cdna第一链，即将rna反转录为cdna；之后以所得cdna为模板、以实时荧光定量pcr引物为引物对进行pcr扩增，且pcr扩增的反应体系与反应程序如下：

pcr反应体系：反应体系的总体积为25μl，含100ng/μlcdna2μl、10μmol/l正向和反向引物各1μl、10mmol/ldntp1μl、5u/μltaqdna聚合酶0.2μl、1.5mmol/lmgcl2的10×pcr缓冲液2μl、其余成分为灭菌的超纯水。

pcr反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；最后72℃下延伸7min；于4℃下保存。

实施例2引物设计和pcr引物验证

利用课题组前期对冬瓜转录组测序所得基因序列为模板，筛选出28s、ubq、rpii、gapdh、ef-1α、ubc21、tua7个候选内参基因，根据引物设计原则，利用primerpremier5.0设计引物（表1）。将pcr扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图1所示；由图1可知，7个内参基因扩增产物条带单一，大小与目标片段相同，说明引物能特异性扩增，不存在引物二聚体，适用于qrt-pcr研究。

表1候选内参基因引物序列

实施例3实时荧光定量pcr引物验证

提取冬瓜总rna，并按照primescripttm1ststrandcdnasynthesiskit试剂盒的方法合成cdna第一链，即将rna反转录为cdna；之后以所得cdna为模板、按照powersybr®greenpcrmastermix说明书在abi7500实时定量pcr仪上进行pcr反应，pcr反应的反应体系与反应程序如下：

反应体系为：反应体系的总体积为10μl，5μlpowersybr®greenpcrmastermix，2μl模板，实施例2中实时荧光定量pcr引物的正向引物0.4μl（浓度为10μmol/l），实施例2中实时荧光定量pcr引物的反向引物0.4μl（浓度为10μmol/l），补蒸馏水至总体积10μl。

反应程序为：95℃预变性30s，pcr反应95℃5s，60℃34s，40个循环。熔解曲线程序：95℃，60℃1min，95℃15s；4℃保存；每个反应做3个重复。

反应的结果如图2a-g所示，7个候选内参基因引物特异性好，pcr融解曲线且均只有一个特异峰，表明无引物二聚体，扩增条带单一，特异性强，没有非特异性扩增出现，从而表明所设计的七对引物特异性强（即实施例2中的实时荧光定量pcr引物），扩增效率高，特异性强，能够用于冬瓜荧光定量pcr的内参引物实验。

实施例4冬瓜内参基因表达稳定性分析

分别提取冬瓜根、茎、叶、花的总rna，之后分别按照primescripttm1ststrandcdnasynthesiskit试剂盒的方法合成cdna第一链，以获得各自的cdna；利用实施例2中的实时荧光定量特异引物为引物对，以获得的cdna为模板，分别进行pcr扩增，pcr扩增体系与扩增程序如下：

pcr扩增体系：反应体系的总体积为10μl，5μlpowersybr®greenpcrmastermix，2μl模板，实施例2中实时荧光定量pcr引物的正向引物0.4μl（浓度为10μmol/l），实施例2中实时荧光定量pcr引物的反向引物0.4μl（浓度为10μmol/l），补蒸馏水至总体积10μl。

pcr扩增程序为：95℃预变性5min；95℃变性5s，60℃退火34s，40个循环；最后72℃下延伸10min；于4℃下保存。

利用genorm、normfinder和bestkeeper3个软件对7个候选内参基因在不同组织的表达稳定性分析评价，genorm软件根据图4，确定最适的基因数据，最终genorm软件分析结果（表2）可知，在冬瓜不同组织中7个内参基因m值排序为ubq=ef-1α<rpii<ubc21<28s<tua<gapdh；normfinder软件分析(表3)，候选内参基因表达稳定值s排序为ef-1α<rpii<ubq<ubc21<tua<28s<gapdh；bestkeeper软件结果(表4)排名靠前的是ef-1α和rpii，tua和gapdh的sd值小，但tua相关性差，而gapdh稳定性最差，为负值，不适合作为内参基因。综合上述三个软件分析结果可知：ef-1α在不同组织中表达稳定性最好。

利用genorm、normfinder和bestkeeper3个软件对7个候选内参基因在不同组织的表达稳定性分析评价，利用genorm软件计算7个候选内参基因表达稳定值（表4），冬瓜低温处理不同时段m值排序为rpii=ef-1α<ubc21<ubq<tua<28s<gapdh，根据normfinder软件分析结果可知（表5），在4℃低温处理条件下7个候选内参基因表达稳定值s排序为ef-1α<rpii<tua<28s<ubc21<ubq<gapdh;bestkeeper软件直接利用ct值（图3）进行数据处理分析。结果表明（表6），在低温胁迫条件下ef-1α排名第1位，说明在低温处理下ef-1α适合作为内参基因。综合上述三个软件分析结果可知：ef-1α在低温胁迫中表达稳定性最好。

表2genorm软件分析7个候选内参基因在不同组织下表达稳定性

表3normfinder软件分析7个候选内参基因在不同组织下表达稳定性

表4bestkeeper软件分析7个候选内参基因在不同组织下表达稳定性

表5genorm软件分析7个候选内参基因在低温胁迫验条件下表达稳定性

表6normfinder软件分析7个候选内参基因在低温胁迫条件下表达稳定性

表7bestkeeper软件分析7个候选内参基因在低温胁迫条件下表达稳定性

综上，本发明提供了以冬瓜内参基因为基础设计的实时荧光定量pcr引物，所设计的实时荧光定量pcr引物用于冬瓜基因表达分析时，能够提高冬瓜基因表达分析研究的稳定性、可靠性和重复性；此外，所设计的实时荧光定量pcr引物特异性强，从而能够大大的提高了采用实时荧光定量检测冬瓜时的检测效率，并提高了检测结果的可信度。

sequencelisting

<110>福建省农业科学院作物研究所

<120>用于筛选冬瓜实时荧光定量pcr内参基因ef-1α的引物

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