一种用于环介导等温扩增的试剂及其试剂盒和应用的制作方法

本发明属于核酸扩增
技术领域：
，具体涉及一种用于环介导等温扩增的试剂，以及含有该试剂的试剂盒和该试剂盒的应用。
背景技术：
：环介导等温扩增(loop-mediatedisothermalamplification，lamp)是一种不同于常规pcr的体外核酸基因扩增新技术。lamp主要利用两对或三对特异性引物和具有链置换活性的bstdna聚合酶，在恒温条件下的连续快速扩增。与传统的pcr技术相比，此技术具有更高的灵敏度、特异性和扩增效率，抗抑制物能力强，对核酸模板质量要求低，因此可以大大简化核酸抽提的步骤，此技术可以在1h内扩增出109～1010倍靶序列拷贝，检测结果的观察方式灵活多样，可以是：电泳法、浊度法(直接裸眼目视或使用专业设备)、染料法(通过反应体系颜色的变化直接判断结果)、实时荧光曲线法(类似于sybr实时pcr法)，可以满足各种不同检测平台的要求，目前的应用已日益广泛，已应用于临床诊断、环境监测、食源安全等领域。在医学方面，lamp技术已应用于细菌类病原微生物的检测、病毒类病原微生物的检测、真菌类微生物的检测、急性传染病的快速现场检测、肿瘤基因检测等，该技术在即时检测(poct)方面的应用具有重要的价值。然而，当前的lamp试剂市场主要被国外公司(例如日本荣研公司)垄断，一方面原因是：lamp专利的技术垄断，另一方面不可忽视的原因是：进口lamp试剂的售价太高，售价约80元-100元/人份，成本远高于普通pcr法(3元-10元)，极大的限制了该技术在国内的推广(国产的lamp试剂盒多因质量欠佳而难以被客户所接受)。虽然目前为了打破垄断，越来越多的研究趋向于将高成本的进口试剂国产化，然而均未取得很好的成效。技术实现要素：本发明的目的在于克服现有技术中的缺陷，提供一种用于环介导等温扩增的试剂，以及含有该试剂的试剂盒和该试剂盒的应用，本发明在解决lamp试剂高成本问题的同时确保检测质量，本发明所述的试剂盒具有与进口试剂相同的检测效果，其灵敏度、特异性和稳定性均可满足临床实验需求，但检测成本可以大幅度降低。为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：本发明的第一个目的是提供一种用于环介导等温扩增的试剂，其包括纳米颗粒、二硫苏糖醇(dtt)、肽牛血清(bsa)、氯化四甲基铵(tmac)、海藻糖中的至少一种。为了进一步优化上述试剂，本发明采取的技术措施还包括：进一步地，所述试剂包括纳米颗粒；或者，所述试剂包括纳米颗粒、二硫苏糖醇(dtt)、肽牛血清(bsa)；或者，所述试剂包括纳米颗粒、二硫苏糖醇(dtt)、肽牛血清(bsa)、氯化四甲基铵(tmac)。进一步地，所述纳米颗粒的材质包括金、银、二氧化硅、聚苯乙烯或石墨烯。更优选为：金纳米颗粒。进一步地，所述纳米材颗粒的表面带正电荷或不带电荷，其直径为0-1000nm；更优选为1～200nm；更优选为2～10nm。进一步地，所述纳米材颗粒的直径为5nm，浓度为0.1mg/ml。本发明的第二个目的是提供一种含有任一上述试剂的用于环介导等温扩增的试剂盒。为了进一步优化上述试剂盒，本发明采取的技术措施还包括：进一步地，所述试剂盒还包括：10×恒温buffer、dntp混合物(dntpmix)、mgso4、bstdna聚合酶、指示剂。进一步地，在环介导等温扩增反应体系中各组分的终浓度如下：纳米颗粒0-10mg/ml；二硫苏糖醇0-10m；肽牛血清0-10g/ml；氯化四甲基铵0-100mm；海藻糖0-50mm；dntp混合物1.0-3.0mm；mgso44-10mm；bstdna聚合酶0.1-0.5u/μl。更优选为：纳米颗粒0-2mg/ml；二硫苏糖醇0-2m；肽牛血清0-2g/ml；氯化四甲基铵0-10mm；海藻糖0-10mm；dntp混合物1.0-2.0mm；mgso45-8mm；bstdna聚合酶0.2-0.4u/μl。进一步地，在环介导等温扩增反应体系中各组分的终浓度如下：dntp混合物1.5mm；mgso46mm；bstdna聚合酶0.32u/μl；纳米颗粒0.012mg/ml；二硫苏糖醇0.08m；肽牛血清0.01g/ml；氯化四甲基铵2mm；海藻糖3.2mm。进一步地，所述指示剂为显色染料或荧光指示剂，所述显色染料包括hnb、calcein、甲酚红、酚红、间甲酚紫、溴甲酚紫、中性红、萘酚酞、百里酚蓝等，所述荧光指示剂包括sybrgreen、evergreen、picogreen、syto系列等。更优选地，所述指示剂为中性红染料。进一步地，各组分的原浓度及其用量如下：dntp混合物的浓度为25mm，用量为1.5μl；mgso4的浓度为100mm，用量为1.5μl；bstdna聚合酶的浓度为8u/μl，用量为1μl；纳米颗粒的直径为5nm，浓度为0.1mg/ml，用量为3μl；二硫苏糖醇的浓度为2m，用量为1μl；肽牛血清的浓度为0.25g/ml，用量为1μl；氯化四甲基铵的浓度为50mm，用量为1μl；海藻糖的浓度为80mm，用量为1μl；其中，所述反应体系的反应体系为25μl，还含有10×恒温buffer2.5μl、指示剂1μl，以及引物组合物及核酸模板，剩余量由水补足。进一步地，环介导等温扩增反应体系的扩增条件为：60～68℃扩增20-60min。更优选为：65℃扩增60min。本发明的第三个目的是提供一种任一上述试剂盒在lamp扩增中的应用。该试剂盒是一种通用试剂盒，其可用于任一合适的lamp扩增反应，其所采用的引物根据不同需求定制合成即可。进一步地，所述应用为基于非诊断和治疗目的的用于calr-2型突变的检测，在所述应用中使用如seqidno：2～seqidno：7所示序列的引物组合物。进一步地，所述引物组合物扩增的靶序列如seqidno：1所示。进一步地，在该应用中，靶序列及引物组合物的具体序列如下：进一步地，在该应用中，在扩增反应体系中，引物组合物和核酸模板的浓度及用量如下：引物名称浓度用量(μl)反应体系中终浓度引物f3100μm0.050.2μm引物f3100μm0.050.2μm引物b3100μm0.050.2μm引物fip100μm0.41.6μm引物bip100μm0.41.6μm引物lf100μm0.20.8μm引物lb100μm0.20.8μm核酸模板-1-与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：本发明所述的lamp环介导等温扩增试剂及试剂盒，其检测结果能实现可视化检测，与市场化的进口试剂盒(日本荣研等)具有良好的可比性，在试剂成本大幅降低(检测成本可以降低为2-3元/人份)的基础上，能确保反应体系的灵敏度、特异性、稳定性和重复性，具有良好的应用前景。附图说明图1为用自制的lamp试剂对calr基因2型突变引物体系进行特异性验证的示意图；其中，b1：临床calr-1突变阳性基因组dna；b2：临床calr-2突变阳性基因组dna；b3：临床calr野生型基因组dna；b4：calr-1突变阳性质粒；b5：calr-2突变阳性质粒；b6：calr野生型质粒；b7：空白对照。图2为本发明所采用的试剂与日本荣研试剂的荧光检测结果对比图；图3为本发明所采用的试剂与日本荣研试剂的检测下限值对比图；其中；图3的上部分的两条扩增曲线所代表的样品，从左到右分别为：104copies/ml,103copies/ml，其他样品无任何扩增信号，进口的日本荣研试剂体系；图3的下部分的下面的两条扩增曲线所代表的样品，从左到右分别为：104copies/ml,103copies/ml，其他样品无任何扩增信号，自制lamp试剂体系。具体实施方式本发明提供了一种用于环介导等温扩增的试剂，其包括纳米颗粒、二硫苏糖醇、肽牛血清、氯化四甲基铵、海藻糖中的至少一种；本发明还涉及一种含有上述试剂的试剂盒和该试剂盒的应用。下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。实施例1-用于lamp环介导等温扩增的试剂本实施例所涉及的用于lamp环介导等温扩增的试剂包含如下组分：纳米颗粒(0.1mg/ml)、dtt(2m)、bsa(0.25g/ml)、tmac(50mm)、海藻糖(80mm)中的至少一种；其中，纳米颗粒的材质为金、银、二氧化硅、聚苯乙烯或石墨烯，其表面带正电荷或不带电荷，其直径为0-1000nm。实施例2-用于lamp环介导等温扩增的试剂盒本实施例所涉及的试剂盒包含如下成分：10×恒温buffer、dntpmix(25mm)、mgso4(100mm)、bstdna聚合酶(8u/μl)、中性红染料、纳米颗粒(0.1mg/ml)、dtt(2m)、bsa(0.25g/ml)、tmac(50mm)、海藻糖(80mm)；其中，纳米颗粒的材质为金、银、二氧化硅、聚苯乙烯或石墨烯，其表面带正电荷或不带电荷，其直径为0-1000nm。上述的试剂盒还可选择地包含扩增引物组合物。由该试剂盒配制的环介导等温扩增反应体系中，各成分的终浓度如下：纳米颗粒0-10mg/ml；二硫苏糖醇0-10m；肽牛血清0-10g/ml；氯化四甲基铵0-100mm；海藻糖0-50mm；dntp混合物1.0-3.0mm；mgso44-10mm；bstdna聚合酶0.1-0.5u/μl。实施例3-用于lamp环介导等温扩增的试剂盒本实施例为另一较佳形式的试剂盒，其包含如下成分：10×恒温buffer、dntpmix(25mm)、mgso4(100mm)、bstdna聚合酶(8u/μl)、中性红染料、纳米颗粒(0.1mg/ml)、dtt(2m)、bsa(0.25g/ml)；其中，纳米颗粒的材质为金纳米颗粒，其表面带正电荷或不带电荷，其直径为1～200nm。上述的试剂盒还可选择地包含扩增引物组合物。由该试剂盒配制的环介导等温扩增反应体系中，各成分的终浓度如下：金纳米颗粒0-2mg/ml；二硫苏糖醇0-2m；肽牛血清0-2g/ml；dntp混合物1.0-3.0mm；mgso44-10mm；bstdna聚合酶0.1-0.5u/μl。实施例4-用于lamp环介导等温扩增的试剂盒本实施例为又一较佳形式的试剂盒，其包含如下成分：10×恒温buffer、dntpmix(25mm)、mgso4(100mm)、bstdna聚合酶(8u/μl)、中性红染料、纳米颗粒(0.1mg/ml)、dtt(2m)、bsa(0.25g/ml)、tmac(50mm)；其中，纳米颗粒的材质为二氧化硅纳米颗粒，其表面带正电荷或不带电荷，其直径为2～10nm。上述的试剂盒还可选择地包含扩增引物组合物。由该试剂盒配制的环介导等温扩增反应体系中，各成分的终浓度如下：金纳米颗粒0-2mg/ml；二硫苏糖醇0-2m；肽牛血清0-2g/ml；氯化四甲基铵0-10mm；dntp混合物1.0-2.0mm；mgso45-8mm；bstdna聚合酶0.2-0.4u/μl。实施例5-用于lamp环介导等温扩增的试剂盒本实施例为又一较佳形式的试剂盒，其包含如下成分：10×恒温buffer、dntpmix(25mm)、mgso4(100mm)、bstdna聚合酶(8u/μl)、中性红染料、纳米颗粒(0.1mg/ml)、tmac(50mm)；其中，纳米颗粒的材质为石墨烯纳米颗粒，其表面带正电荷或不带电荷，其直径为5nm。上述的试剂盒还可选择地包含扩增引物组合物。由该试剂盒配制的环介导等温扩增反应体系中，各成分的终浓度如下：金纳米颗粒0.06mg/ml；dntp混合物1.5mm；mgso46mm；bstdna聚合酶0.32u/μl。应用实施例1—将试剂盒应用于calr基因2型突变(calr-2)的快速检测本实施例采用如实施例2所述的试剂盒进行calr-2型突变的快速检测，对该试剂盒中各组分的含量进行具体设定。该检测方法具体涉及以下步骤：1.calr-2型突变-检测体系的靶序列信息及引物设计；calr-2型突变-检测体系的靶序列如seqidno：1所示，根据该靶序列利用常规方法设计引物序列，其具体如下表所示：2.反应体系的配制；根据实施例2所述的试剂盒配置相应的反应体系，反应体系总体积为25μl，该反应体系中各组分的用量及其反应体系中的成分终浓度如下表所示：采用上述试剂盒配制的反应体系进行lamp反应，lamp反应条件为：65℃，60min；上述lamp反应所用的设备为普通pcr仪或恒温金属浴等能够稳定提供65℃恒温的设备；然后进行可视化判读来鉴定样本是否为calr基因2型突变阳性，具体为结果判断：反应结束后，反应液的颜色由原来的淡黄色变为红色(反应过程中，体系的ph在变化)，即判定为反应阳性。构建含靶序列的ta克隆质粒，制备梯度浓度的样本，具体浓度为101copies/ml，102copies/ml，103copies/ml，105copies/ml，107copies/ml，1010copies/ml，用所配置的lamp试剂进行检测，结果提示：对于浓度大于102copies/ml的样本均能被稳定的检出；对临床calr基因2型突变患者全血样本的基因组dna和构建的重组质粒能特异性的检出，对calr基因1型突变患者全血样本的基因组dna和构建的重组质粒或正常人的野生型基因组dna和构建的重组质粒均无非特异性的扩增，检测效果良好，其检测结果如图1所示。转入了calr-2型突变质粒的293t细胞、转入了野生型质粒的293t细胞，均为106个细胞，用基因组dna抽提试剂盒抽提dna，然后按比例稀释，制成梯度突变负荷浓度的样本，用所建立的lamp反应体系进行扩增，发现突变负荷检出敏感性可达到1％，与探针法实时pcr的最佳效果一致。应用实施例2—本发明试剂盒与日本荣研试剂盒检测结果对比本实施例中的试验既可以在pcr仪上用荧光染料法检测，也可以用日本进口的实时监测浊度仪(la-500)进行检测。(1)在实时pcr仪(ab7300)上，用荧光染料法进行检测；本实施例分别采用本发明所述的自制lamp试剂(如上所述的应用实施例1中的扩增体系)、进口的日本荣研试剂，同时扩增梯度浓度的含calr-2靶片段的ta克隆质粒(ab7300pcr仪，0.5min1个循环，90个循环，共耗时45min完成整个比对检测)，由如图2可知，从左向右(每两条线为1个浓度的比对)依次为：108copies/ml,107copies/ml,106copies/ml,105copies/ml,104copies/ml,103copies/ml。由图2的结果可知：本发明所要保护的lamp试剂与进口的日本荣研试剂具有高度的可比性。(2)实时监测浊度仪(la-500)上，用浊度法法进行检测比对。本实施例分别采用本发明所采用的试剂(应用实施例1的扩增体系)、进口的日本荣研试剂，同时扩增梯度浓的的含calr-2靶片段的ta克隆质粒(la-500浊度仪，60min完成整个比对检测)。如图3所示，其上部分和下部分分别表示用日本荣研试剂扩增calr-2ta克隆质粒和用本发明自制的lamp试剂扩增calr-2ta克隆质粒。本实施例实验中所用ta克隆质粒样品的四个梯度浓度为：104copies/ml，103copies/ml，102copies/ml，101copies/ml。由图3可知：日本荣研试剂和的自制的lamp试剂的检测下限均只能达到103copies/ml，而102copies/ml及以下浓度的样品均无法检出。这表明本发明所述的自制lamp试剂与进口的日本荣研试剂具有高度的可比性。由上述实施例可知，本发明所述的lamp环介导等温扩增试剂盒，检测结果能实现可视化检测，与市场化的进口试剂盒(日本荣研等)具有良好的可比性，在试剂成本大幅降低的基础上，能确保反应体系的灵敏度、特异性、稳定性和重复性。以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对该实用进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。sequencelisting<110>关明、曹国君<120>一种用于环介导等温扩增的试剂及其试剂盒和应用<130>ipi182623<160>7<170>patentinversion3.5<210>1<211>221<212>dna<213>artificialsequence<220><223>靶序列<400>1tcctggtcctgatgtcgggggcgggcagggctggcagggggcaaggccctgaggtgtgtg60ctctgcctgcaggcagcagagaaacaaatgaaggacaaacaggacgaggagcagaggctt120aaggaggaggaagaagacaagaaacgcaaagaggaggaggaggcagaggacaattgtcgg180aggatgatgaggacaaagatgaggatgaggaggatgaggag221<210>2<211>18<212>dna<213>artificialsequence<220><223>扩增引物f3<400>2tcctggtcctgatgtcgg18<210>3<211>20<212>dna<213>artificialsequence<220><223>扩增引物b3<400>3ctcctcatcctcctcatcct20<210>4<211>46<212>dna<213>artificialsequence<220><223>扩增引物fip<400>4cctcgtcctgtttgtccttcatttgtttcaaggccctgaggtgtgt46<210>5<211>49<212>dna<213>artificialsequence<220><223>扩增引物bip<400>5gaggcttaaggaggaggaagaagacactttgtcctcatcatcctccgac49<210>6<211>16<212>dna<213>artificialsequence<220><223>扩增引物lf<400>6tgcctgcaggcagagc16<210>7<211>18<212>dna<213>artificialsequence<220><223>扩增引物lb<400>7gaggaggcagaggacaat18当前第1页12