一种小干扰RNA分子在抗肿大细胞病毒中的应用的制作方法

本发明涉及分子生物学领域，具体的说是一种小干扰rna分子在抗肿大细胞病毒(megalocytivirus)中的应用。

背景技术

小干扰rna(smallinterferingrna，sirna)是由正义和反义链组成的长度为21～23nt的短双链rna，它具有很强的关闭基因的功能，可以引起同源的mrna发生降解而导致基因表达沉默的现象。rna干扰(rnai)是由sirna介导的一种强有力的基因表达抑制途径，是植物、线虫、真菌、昆虫、原生生物以及动物等大多数真核细胞进化过程中抑制外源基因表达的一种保护性措施,在生物体的发生、发育及防御系统的构成等方面具有十分重要的作用。随着对sirna介导的rna干扰机制的不断深入研究，sirna抵御病毒感染方面的研究已经取得了初步进展，大量研究表明sirna在抗病毒治疗方面非常有效。目前，多是通过直接合成特异的sirna以降解病毒rna或mrna，也有通过rnai抑制参与病毒复制过程的宿主细胞的某些基因表达而发挥抗病毒作用。rnai技术在病毒感染性疾病防治方面具有很大的潜力，为临床病毒感染性疾病的防治提供了新的途径，sirna介导的抗病毒途径已经成为国内外研究的热点，具有广阔的应用前景。

技术实现要素：

本发明目的在于提供一种小干扰rna分子及其在抗肿大细胞病毒中的应用。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种小干扰rna分子，小干扰rna分子具有下列序列：

正义链:5’-ccucaucgugucaacucuutt-3’；

反义链:5’-aagaguugacacgaugaggtt-3’。

一种小干扰rna分子的应用，所述小干扰rna分子在抗肿大细胞病毒中的应用。

所述小干扰rna分子在制备抑制病毒感染相关基因psmg2的表达或抑制病毒复制的制剂中的应用。

所述病毒为肿大细胞病毒。

本发明具有如下优点：本发明的小干扰rna分子注射半滑舌鳎后能够显著抑制psmg2蛋白的表达和抑制肿大细胞病毒的复制。

附图说明

图1为本发明实施例提供的小干扰rna分子sipsmg2抑制半滑舌鳎肿大细胞病毒感染相关基因psmg2的表达(**p<0.01)。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明。实施例旨在对本发明进行举例描述，而非以任何形式对本发明进行限制。

实施例1

小干扰rna分子sipsmg2抑制病毒感染相关基因psmg2的表达

步骤1)小干扰rna分子稀释液制备

本发明的小干扰rna分子sipsmg2的序列为正义链:5’-ccucaucgugucaacucuutt-3’；反义链:5’-aagaguugacacgaugaggtt-3’。小干扰rna分子sipsmg2由上海genepharma公司合成，对照小干扰rna分子sicr序列为正义链:5’-uucuccgaacgugucacgutt-3’；反义链:5’-acgugacacguucggagaatt-3’。sipsmg2和sicr在pbs中稀释至1μg/μl，即分别为小干扰rna分子稀释液和对照小干扰rna稀释液。

所述pbs组成成分按重量百分比计：0.8％nacl,0.02％kcl,0.358％na2hpo4.12h2o,0.024％nah2po4，余量为水。

步骤2)小干扰rna分子混合液和对照混合液的制备

体内转染试剂entranster^tm-invivo购自北京英格恩生物科技有限公司，将体内转染试剂用pbs稀释4倍，将上述步骤1的小干扰rna分子稀释液与稀释后的体内转染试剂等体积混合，即为小干扰rna分子混合液；将上述步骤1的对照小干扰rna分子稀释液与体内转染试剂稀释液等体积混合，即为对照混合液。

步骤3)注射鱼类

将10条半滑舌鳎(重约11.8g)随机分为2组，每组5条。将这2组分别命名为a和b。将a组的每条鱼分别注射100μl步骤3)的小干扰rna分子混合液，将b组(对照组)的每条鱼分别注射100ul步骤3)的对照混合液。

步骤5)基因表达检测

在上述步骤4)注射后第3天，取鱼脾脏组织。利用eznatotalrna试剂盒(购于omegabio-tek,doraville,美国)提取总rna，用于cdna制备和荧光定量pcr(qrt-pcr)检测病毒感染相关基因psmg2的表达。具体参见文献zhengwj,sunl.evaluationofhousekeepinggenesasreferencesforquantitativerealtimert-pcranalysisofgeneexpressioninjapaneseflounder(paralichthysolivaceus).fishshellfishimmunol.2011；30:638–45。结果表明，a组鱼的psmg2基因表达水平显著(p<0.01)低于对照组(见图1)。这些结果表明，小干扰rna分子sipsmg2能显著抑制病毒感染相关基因psmg2的表达。

实施例2

小干扰rna分子sipsmg2抗肿大细胞病毒作用

步骤1)小干扰rna分子混合液和对照混合液的制备

将上述实施例1步骤1的小干扰rna分子稀释液与上述实施例1步骤3中4倍稀释的体内转染试剂等体积混合，即为小干扰rna分子混合液；将对照小干扰rna分子稀释液与上述实施例1步骤3中4倍稀释的体内转染试剂等体积混合，即为对照混合液。

步骤2)病毒悬液制备

将肿大细胞病毒rbiv-c1(具体制备方法见zhangm,xiaoz,huy,sunl.characterizationofamegalocytivirusfromculturedrockbream,oplegnathusfasciatus(temminck&schlege),inchina.aquacres.2012；43:556–64)于pbs中稀释至10⁶copies/ml，即为病毒悬液。

步骤3)注射鱼类

将10条半滑舌鳎(重约11.8g)随机分为2组，每组5条。将这2组分别命名为a和b。将a组的每条鱼分别注射100ul步骤3)的小干扰rna分子混合液，将b组(对照组)的每条鱼分别注射100ul对照混合液，1天后每条鱼再注射100μl上述步骤2)中的病毒悬液。

步骤4)病毒复制检测

在上述步骤4病毒注射后第3天，取鱼脾脏组织。利用dna提取试剂盒(购于天根生化科技(北京)有限公司”)从组织中提取dna，用绝对定量pcr法检测组织中病毒含量。具体方法见参考文献zhangm,xiaoz,huy,sunl.characterizationofamegalocytivirusfromculturedrockbream,oplegnathusfasciatus(temminck&schlege),inchina.aquacres.2012；43:556–64。结果表明，a组鱼脾脏的病毒数(3.5x10³)显著(p<0.01)低于b组鱼脾脏的病毒数(1.0x10⁴)。这些结果表明，小干扰rna分子sipsmg2能够显著抑制病毒复制。