一种高产乳酸的植物乳杆菌及其应用的制作方法

本发明涉及一种高产乳酸的植物乳杆菌及其应用，属于微生物学领域。

背景技术

酸浆是豆制品行业广泛使用的一种凝固剂，通常由微生物发酵而来，主要有效成分为有机酸，其中乳酸是有机酸的主要贡献者。

目前乳酸的生产方式主要有化学合成法、酶转化法和微生物发酵法；其中，微生物发酵法所产生的乳酸为l-型，光学纯度高，对人体无毒副作用，且酸度柔和、性状稳定，适合用于食品的酸味剂、防腐剂和ph调节剂等(刘金梅.传统酒曲中高产乳酸根霉菌株的选育及发酵条件优化[d].江西农业大学,2015.)。

常用作生产乳酸的微生物包括乳酸菌和根霉菌，根据yangguo等人(yangguo,qiaojuanyan,zhengqiangjiang,etal.efficientproductionoflacticacidfromsucroseandcorncobhydrolysatebyanewlyisolatedrhizopusoryzaegy18[j].jindmicrobiolbiotechnol,2010,37:1137-1143.)研究发现，根霉菌gy18在35℃下培养24h可发酵20g/l的蔗糖溶液产生3g/l左右的l-型乳酸。sachinr等人(kadamsr,patilss,bastawdekb,etal.strainimprovementoflactobacillusdelbrueckii,ncim2365forlacticacidproduction[j].processbiochemistry,2006,41(1):120-126.)研究表明，在10％的蔗糖培养基中，经42℃发酵36h后，徳氏乳杆菌突变株uc-3可产生5.0g/l的乳酸，野生菌株ncim2365可产3.80g/l的乳酸。madsul等人(adsulm,khirej,bastawdek,etal.productionoflacticacidfromcellobioseandcellotriosebylactobacillusdelbrueckiimutantuc-3[j].applied&environmentalmicrobiology,2007,73(15):5055.)又继续进行了徳氏乳杆菌突变株uc-3利用纤维二糖和纤维三糖产l-型乳酸的乳酸菌的实验发现，在42℃、ph为6.0的2g/l的纤维三糖培养基中，徳氏乳杆菌突变株uc-3在12h内可产1.70g/l的乳酸。

综上，在产乳酸的菌株中，野生菌株和诱变菌株利用蔗糖等糖类作为碳源时的乳酸产量均不高，而豆制品中蔗糖含量丰富，同时植物乳杆菌是发酵制品中常用的一种乳酸菌，因此研究开发一种能够利用蔗糖高产乳酸的植物乳杆菌，以期作为发酵剂用于豆制品发酵，以提升豆制品的凝胶速率和质构，是本领域亟待解决的技术问题。

技术实现要素：

为了解决目前存在的问题，本发明提供了一种高产乳酸的植物乳杆菌及其应用；所述技术方案如下：

本发明的第一个目的在于提供一种高产乳酸的植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)，所述植物乳杆菌于2018年07月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：cgmccno.16112，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

本发明的第二个目的是提供一种含有上述植物乳杆菌的菌剂。

本发明的第三个目的是提供一种上述植物乳杆菌在乳酸制备中的应用。

本发明的第四个目的是提供一种上述植物乳杆菌在豆制品制备中的应用。

可选的，所述植物乳杆菌在豆制品制备中的应用包括植物乳杆菌在酸豆浆制备和豆腐制备中的应用。

可选的，所述植物乳杆菌在制备酸豆浆中的应用包括：以新鲜无菌豆浆作为原料，加入所述植物乳杆菌发酵24h的黄浆水，在37℃下保温6h，加入其它配料，均质后包装即得到酸豆浆产品。

可选的，所述植物乳杆菌在制备豆腐中的应用包括：将经活化后的植物乳杆菌洗涤后，调整植物乳杆菌细胞浓度在10⁹cfu/ml以上，冷冻干燥后制备成直投式发酵剂，取1g发酵剂菌粉接种至1000ml豆浆中，于37℃下发酵4h，加入其它配料，即得到酸豆腐产品。

本发明的第五个目的是提供一种上述植物乳杆菌在泡菜制备中的应用。

本发明的第六个目的是提供一种上述植物乳杆菌在酸奶制作中的应用。

本发明的第七个目的是提供一种含有上述植物乳杆菌的菌剂在制备乳酸中的应用。

本发明的第八个目的是提供一种含有上述植物乳杆菌的菌剂在制备豆制品中的应用。

可选的，所述豆制品包括酸豆浆中和豆腐。

本发明的第九个目的是提供一种含有上述植物乳杆菌的菌剂在泡菜制备中的应用。

本发明的第十个目的是提供一种含有上述植物乳杆菌的菌剂在酸奶制作中的应用。

本发明有益效果是：

本发明中应用的植物乳杆菌cgmccno.16112在24h内乳酸产量为8.02g/l，高于自然发酵黄浆水c1和副干酪乳杆菌组c2的乳酸产量；在12h到24h，植物乳杆菌cgmccno.16112的乳酸产出速率为0.15g/l/h，高于c1组的0.12g/l/h和c2组的0.08g/l/h，表明在发酵后期ph值较低的情况下，植物乳杆菌cgmccno.16112仍能够保持较好状态的生长，酶系活跃，积累高含量的乳酸；进一步的，植物乳杆菌cgmccno.16112对蔗糖的利用率达到96.03％，并能够利用多种糖；进一步的，植物乳杆菌cgmccno.16112在6h内发酵豆浆可产6.37g/l的乳酸，是自然发酵组c1和副干酪乳杆菌发酵组c2的1.71～1.77倍，显著加快豆浆的凝乳速率；进一步的，本发明中应用的植物乳杆菌cgmccno.16112是可用于食品的安全菌株；不用添加其他化学物质，安全健康；进一步的，植物乳杆菌cgmccno.16112能有效提高发酵制品中乳酸物质的含量，且对产品质构特性具有显著的改善作用。生物材料保藏信息：

植物乳杆菌cgmccno.16112，于2018年07月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：cgmccno.16112，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1a为植物乳杆菌cgmccno.16112在固体mrs培养基上的菌落形态图；

图1b为植物乳杆菌cgmccno.16112的细胞镜检图；

图2为植物乳杆菌cgmccno.1611224h内的生长情况；

图3为植物乳杆菌cgmccno.1611224h内发酵黄浆水的产酸情况；

图4为植物乳杆菌cgmccno.1611224h内发酵黄浆水的糖利用情况。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明实施方式作进一步地详细描述。

实施例一：植物乳杆菌的菌种分离鉴定方法

(1)获得合适的稀释梯度并培养

从云南省楚雄州牟定县羊泉腐乳公司的豆腐酸浆样品中吸取0.5ml，加入4.5ml无菌生理盐水中，重复吸取0.5ml菌液稀释于4.5ml无菌生理盐水，以此类推，使该样品浓度梯度稀释至10^-6cfu/ml，取6个稀释度分别为10～10⁶cfu/ml的菌悬液各100μl分别涂布于mrs固体培养基上，在温度37℃下倒置培养24-48h。

(2)分离纯化

挑选典型单菌落，用平板三区划线法进行纯化分离，重复这种培养挑选操作直至纯化出所有单菌落。

(3)革兰氏染色和过氧化氢酶实验

挑取单菌落于载玻片上，经过涂片、干燥、固定、初染、水洗、媒染、水洗、脱色、复染、水洗、干燥后镜检，记录革兰氏染色结果；并挑取单菌落于载玻片上，加入3％过氧化氢溶液，观察有无气泡产生，并记录过氧化氢酶接触结果，保留革兰氏阳性、过氧化氢酶阴性的菌落。

(4)菌种保藏

挑选纯化完成后的单菌落于5ml液体mrs培养基中，置于37℃下静置培养20-24h，吸取1ml菌液至保菌管中，4000rpm5min离心，去上清，加入1ml30％无菌甘油溶液，重悬，置于-80℃保存。

(5)pcr扩增16srdna

吸取1ml震荡混匀后的液体培养基，离心后弃去上清液，并用1ml无菌水吹打清洗后，离心弃去上清液，用作菌落pcr的模板。

1)pcr体系25μl，其中mix为12.5μl，27f为0.5μl，1492r为0.5μl，ddh2o为11.5μl。所用引物为27f:agagtttgatcctggcctca20(seqidno:2)和1492r:ggttaccttgttacgactt19(seqidno:3)。目标扩增片段长度1500bp。扩增片段的核苷酸序列如seqidno:1所示，长度为1435bp。

2)pcr条件：

预变性温度：105℃

第一步变性：95℃7min；95℃30s

第二步退火：55℃30s

第三步延伸：72℃90s

循环次数：95℃30s，33次循环

第四步最后延伸：72℃5min

第五步保持：12℃10min

(6)琼脂凝胶电泳(80ml)

称取0.8g琼脂糖加入锥形瓶中，加入80ml1xtae，微波间断式加热4min，至液体澄清透明，稍稍冷却，加入2‰核酸染料，摇匀，无气泡，倒入胶板槽中，冷却40min凝固后，置于电泳槽中，排气泡，依次加入pcr扩增产物，每个孔中加入4μlpcr扩增产物，120v30min跑胶结束后取出，置于凝胶电泳成像仪中拍照保存，记录pcr成功样品的编号，将成功的pcr产物置于-20℃冰箱中保藏。

(7)16srdna序列分析鉴定

将pcr成功的样品送到华大基因进行检测，根据华大基因反馈的序列结果，结合ncbi菌株序列数据库进行blast检索，选取匹配度最高的菌株信息进行结果记录。结果显示，本发明提供的菌株为植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)。

该菌株的菌落特征为：该菌株在固体mrs培养基上的形态如图1a所示，30h左右时菌落呈白色，有光泽，边缘为圆形，不透明，凸起，较小。镜检结果如图1b所示，于油镜下观察到的cgmccno.16112植物乳杆菌的菌体呈短杆状，革兰氏染色结果为紫色，即为革兰氏阳性菌。

本发明实施例中使用的样品名称和来源如表1所示，其中天然发酵酸浆模拟液由采集的豆腐酸浆按10％的比例接种至黄浆水中，在37℃下发酵6h后制得。

本发明实施例中使用的乳酸菌编号、菌株名称和来源如表2所示，其中c1代表天然混合菌株。

表1本发明使用的样品名称和来源

表2本发明使用的乳酸菌编号、菌株名称和来源

实施例二：植物乳杆菌在mrs中24h内的生长曲线

从-80℃下保藏的菌株按2％的接种量接种到5ml液体mrs培养基中，37℃下培养16-18h，活化三代培养，取菌液按2％的接种量接种至mrs液体培养基中培养24h，从0h开始每隔2h取菌液1ml，振荡混匀，利用紫外分光光度计测定od600吸光度，平行三次，并按时间绘制生长曲线，结果见图1。由图1可知，植物乳杆菌cgmccno.16112在12h进入稳定期。

实施例三：植物乳杆菌在黄浆水中24h内的ph变化

从-80℃下保藏的菌株按2％的接种量接种到5ml液体mrs培养基中，37℃下培养16-18h，活化三代培养，取菌液按3％的接种量接种至无菌黄浆水液体培养基中培养24h，从0h开始每隔2h取发酵黄浆水菌液，振荡混匀，利用ph计测定ph值，平行三次并记录，结果见图2。

根据图2可知，植物乳杆菌cgmccno.16112在黄浆水中可将ph从6.25降至3.86，ph降低程度强于自然发酵组c1和副干酪发酵组c2。

实施例四：植物乳杆菌在黄浆水中24h内的乳酸生成能力

从-80℃下保藏的菌株按2％的接种量接种到5ml液体mrs培养基中，37℃下培养24h，活化至第三代时，取1ml菌液，以4000rpm/min离心5min，得菌泥，用无菌生理盐水洗2次后重悬于1ml无菌生理盐水中，按3％的接种量接种至无菌黄浆水中，在37℃下培养24h，从0h开始取样，每次取2ml发酵黄浆水样品，10000rpm离心10min，取上清，0.22μm滤膜过膜，测定其有机酸物质组成，平行三次测定。

色谱条件：仪器agilent1200；色谱柱为diamonsilc18柱(4.6mm×250mm，5μm)；流动相为甲醇∶水∶磷酸(5∶95∶0.05，体积比)；流速为0.6ml/min；柱温为30℃；检测器为紫外检测器；检测波长为210nm；进样量为5μl；洗脱时间为30min。

本发明实施例所使用的菌株在24h内发酵黄浆水产乳酸含量的结果如表3所示，由表3可知，在12h内，植物乳杆菌cgmccno.16112的乳酸产量为6.19g/l，低于自然发酵黄浆水组c1的乳酸产量，高于副干酪乳杆菌组c2的产量，植物乳杆菌的产乳酸能力较强；在24h内，植物乳杆菌cgmccno.16112的乳酸产量为8.02g/l，高于自然发酵黄浆水c1和副干酪乳杆菌组c2的乳酸产量。在12h到24h，植物乳杆菌cgmccno.16112的乳酸产出速率为0.15g/l/h，高于c1组的0.12g/l/h和c2组的0.08g/l/h，表明在发酵后期ph值较低的情况下，植物乳杆菌cgmccno.16112仍能够保持较好状态的生长，酶系活跃，积累高含量的乳酸。

表3不同时间点发酵黄浆水的乳酸产量

实施例五：植物乳杆菌在黄浆水中24h内的糖利用能力

从-80℃下保藏的菌株按2％的接种量接种到5ml液体mrs培养基中，37℃下培养24h，活化至第三代时，取1ml菌液，以4000rpm/min离心5min，得菌泥，用无菌生理盐水洗2次后重悬于1ml无菌生理盐水中，按3％的接种量接种至无菌黄浆水中，在37℃下培养24h，分别在0h和24h两个测量点取2ml发酵黄酱水样品，10000rpm离心10min，取上清，0.22μm滤膜过膜，测定其糖的组成，平行三次测定。

色谱条件：仪器waters600；色谱柱为sugar-paklc18柱(6.5mm×300mm，5μm)；流动相为超纯水；流速为0.4ml/min；柱温为85℃；检测器为示差折光检测器；进样量为10μl；洗脱时间为30min。

本发明实施例所使用的菌株在24h内发酵黄浆水糖含量的变化结果如图3所示，由图3可知，自然发酵组c1和副干酪乳杆菌发酵组c2均只可利用5种糖中的4种，植物乳杆菌cgmccno.16112可利用5种糖，其中可将蔗糖含量从5.01g/l降至0.20g/l，利用率达到96.03％，促进有机酸的形成。

实施例六：植物乳杆菌在豆浆中6h内的产酸能力

挑选子粒饱满的优质大豆，用去离子水冲洗干净，以1/3.5的豆水比于室温下浸泡10～12h使豆粒充分吸收水分至大豆豆瓣内侧基本呈平面。然后将大豆沥干水分，用去离子水冲洗两次，以1/8的豆水比(加水量＝干大豆质量×9-浸泡后大豆质量)于热破壁料理机中搅拌1min粉碎磨浆，经120目纱布过滤得豆浆。采用沸水浴对豆浆进行加热，豆浆最终温度为96℃，加热完成后置于冰水浴中冷却至室温，以发酵24h的发酵黄浆水，按10％的体积比接种至豆浆中，在37℃下发酵6h，用ph计测定ph值变化，平行三次测定。

结果如表5所示，经过6h的发酵，植物乳杆菌cgmccno.16112可将ph从6.50降至4.64，与自然发酵组c1和副干酪乳杆菌发酵组c2相比，产酸能力与自然发酵组相近，强于副干酪乳杆菌的产酸能力，表明植物乳杆菌cgmccno.16112可发酵豆浆较快产酸，使豆浆凝乳。

表5不同时间点豆浆中的ph值

实施例七：植物乳杆菌在豆浆中6h内的乳酸生成能力

以1000ml新鲜无菌豆浆作为原料，加入10ml发酵24h的黄浆水，在37℃下保温6h，称取2ml样品，10000rpm下离心10min，用0.22μm滤膜过膜，测定乳酸含量，平行三次测定。

结果如表6所示，植物乳杆菌cgmccno.16112在6h内发酵豆浆可产6.37g/l的乳酸，是自然发酵组c1和副干酪乳杆菌发酵组c2的1.71～1.77倍，显著加快豆浆的凝乳速率。

表6不同时间点豆浆中的乳酸产量

实施例八：植物乳杆菌在酸豆浆中的应用

以1000ml新鲜无菌豆浆作为原料，加入植物乳杆菌cgmccno.16112发酵24h的黄浆水，在37℃下保温6h，称取样品，测定凝胶的持水性和强度值，平行三次测定。

结果如表7所示，相较于10％的发酵黄浆添加量，7％的添加量可使豆腐形成持水率更佳、强度一般的凝胶，说明添加7％的植物乳杆菌cgmccno.16112适合开发口感嫩滑的酸豆浆产品。

表7豆腐凝胶的持水性与强度

实施例九：植物乳杆菌在豆腐制作中的应用

经活化后的植物乳杆菌cgmccno.16112洗涤后，调整菌细胞浓度在10⁹cfu/ml以上，冷冻干燥后制备成直投式发酵剂，取1g菌粉接种至1000ml豆浆中，于37℃下发酵4h，取样测定持水率，并利用ta-xtplus质构仪进行凝胶特性的测定，平行三次测定。

结果如表8所示，植物乳杆菌cgmccno.16112发酵而得的豆腐持水性好，优于自然发酵和副干酪乳杆菌发酵的豆腐，同时豆腐凝胶的硬度、弹性、内聚性、咀嚼性均与自然发酵豆腐相近，优于副干酪乳杆菌发酵的豆腐，说明植物乳杆菌cgmccno.16112的添加可以使豆腐快速凝胶，并有效改善豆腐的质地。

表8不同菌株发酵的酸豆浆的持水性及其凝胶特性

实施例十：植物乳杆菌在泡菜制作中的应用

将洗净的萝卜原料置于10％的无菌食盐水中预腌渍24h，转移萝卜至低浓度的无菌食盐水中进行成品腌渍，收集活化后的植物乳杆菌cgmccno.16112并洗涤后，接种20ml的活菌液于980ml的成品腌渍液中在28℃下腌渍48h，取样测定发酵液ph和酸度，平行三次测定。

结果如表9所示，植物乳杆菌cgmccno.16112在不同浓度的食盐水中均能生长，并可发酵泡菜液快速产酸，当成品腌渍液浓度为4％时，泡菜成熟最快，可有效提升泡菜的脆度，使泡菜质地更佳。

表9不同浓度成品腌渍液的ph与酸度值

实施例十一：植物乳杆菌在酸奶制作中的应用

以980ml新鲜脱脂乳为原料，加入4％白砂糖，经105℃巴氏杀菌10min后，接种20ml菌细胞浓度在10⁶cfu/ml的植物乳杆菌cgmccno.16112活化菌液，于42℃下保温6h，观察凝乳情况(以倾斜器皿时内容物不流动为凝乳状态)和产酸情况。

结果如表10所示，植物乳杆菌cgmccno.16112可在6h内发酵完成脱脂乳，稳定快速产酸，使脱脂乳凝乳，形成典型酸奶质地。

表10不同时间点脱脂乳凝乳情况

注：“-”表示未凝乳

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

sequencelisting

<110>江南大学

<120>一种高产乳酸的植物乳杆菌及其应用

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<213>人工合成序列

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