一种基于免疫细胞测定GO生物学效应的方法与流程

本发明涉及go生物学效应
技术领域：
，具体涉及一种基于免疫细胞测定go生物学效应的方法。
背景技术：
氧化石墨烯(go)是石墨烯经过氧化后得到的。go是一个非常有前途的纳米材料，具有广泛的生物医学应用，但是由于go会产生细胞毒性，因此具有潜在的不利影响。近几年已有研究表明，go对水生和陆生生态系统具有毒害效应。go能够通过胞外覆盖、胞内氧化胁迫或直接破坏细胞膜等方式对细胞产生危害，而且即使在低浓度无明显毒性的情况下，go也可以与其他物质形成复合物进而对生物产生毒害效应。这无不表明go对细胞已表现出明显的生物学效应。目前还没有具体的方法测定go通过免疫细胞对生物产生的影响，因此对于go引发的不利影响的分子基础尚不清楚，也无法确定生物体内go的安全使用剂量，为此我们提出一种基于免疫细胞测定go生物学效应的方法。技术实现要素：针对现有技术不足，本发明提供一种基于免疫细胞测定go生物学效应的方法，本发明通过摄有go的免疫细胞在不同时间内进行培养，从而在体外模拟go的生物安全性，根据多项数据测定出go对细胞的生物学效应，并且通过排除其他外界因素对实验结果的干扰和影响，使得测定结果准确度高，可靠性强。为实现以上目的，本发明的技术方案通过以下技术方案予以实现：一种基于免疫细胞测定go生物学效应的方法，包括以下步骤：(1)制备两个pbs溶液，将粉状mtt溶于其中一个pbs溶液中，抽滤灭菌得mtt试剂备用；(2)将go放入真空干燥箱中进行干燥，干燥后将go分散在二次水中并进行超声分散，分散后再将其进行不等量分装，再分别加入二次水得到不同浓度的go分散液备用；(3)将上述步骤(2)中的不同浓度的go分散液倒入24孔板内，然后将免疫细胞接种到24孔板中的go分散液内，再将孔板放在培养箱中开放培养不同时间后分别吸去培养液，并倒在显微镜下观察细胞的形态；(4)通过mtt溶液对免疫细胞继续进行培养，培养处理后测定每孔的吸光度值，取平均值后将吸光度值转换成细胞相对增值率，然后将各组的细胞相对增值率转换成细胞毒性级别；(5)用胰酶消化免疫细胞，吹打后得到单细胞悬液，在培养皿中制作免疫细胞爬片，再放入细胞培养箱中培养，培养并处理后加入fitc标记的鬼笔环肽稀释液进行反应，再用dapi对免疫细胞进行染色，再用抗淬灭封片剂进行封片，从而完成免疫细胞微丝骨架结构标记实验。优选的，步骤(4)中的免疫细胞处理包括吸去原培养液、pbs清洗、弃除余液和二甲基亚砜溶解结晶物等操作。优选的，步骤(4)中的细胞毒性试验采用5分制法进行细胞毒性分级，细胞相对增值率(％)＝实验组平均吸光度值×100％/对照组平均吸光度值，细胞相对增殖率与细胞毒性的分级的关系：细胞相对增值率(％)≥100％细胞毒性为0级，细胞相对增值率(％)为75％～99％，细胞毒性为1级；细胞相对增值率(％)为50％～74％，细胞毒性为2级；细胞相对增值率(％)为25％～49％，细胞毒性为3级；细胞相对增值率(％)为1％～24％，细胞毒性为4级；细胞相对增值率(％)为0％时，细胞毒性为5级，0级和1级被认为没有细胞毒性，2级为轻度细胞毒性，3级和4级为中度细胞毒性，5级为明显细胞毒性。优选的，步骤(5)中的免疫细胞处理包括pbs清洗、多聚甲醛固定、去离子水冲净甲醛、pbs漂洗、triton穿孔、pbs漂洗和bsa封闭等操作。优选的，步骤(5)中的操作在暗处进行。本发明提供一种基于免疫细胞测定go生物学效应的方法，与现有技术相比优点在于：(1)本发明通过免疫细胞摄取不同剂量的go，并在不同时间内进行培养，采用mtt比色和dapi染色的方法在体外模拟go的生物安全性，并根据细胞生长状况、增值率和细胞微丝骨架蛋白的含量等数据，测定出go对细胞的生物学效应，测定结果准确度高，可靠性强；(2)本发明通过对实验材料和工具进行多次清洗和杀菌处理，能够有效排除其他外界因素对实验结果的干扰和影响，提高了测定结果的精准度和可信度。附图说明图1为各组培养2d后细胞形态(×200)对比图；图2为鬼笔环肽作为一抗特异性标记巨噬细胞的微丝骨架对比图图3为各组细胞的微丝骨架荧光强度的灰度值柱状图。具体实施方式为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合本发明实施例对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例1：一种基于免疫细胞测定go生物学效应的方法，包括以下步骤：(1)取8gnacl，0.2gkcl，1.56gna2hpo4和0.2gkh2po4，加入100ml蒸馏水混合搅拌得到pbs溶液，以同样的方法再制备一个pbs溶液，并取0.5g粉状mtt加入其中一个pbs溶液内，并进行抽滤灭菌得到浓度为5g/l的mtt试剂；(2)先将go在真空干燥箱中干燥24h，干燥后将go分散在二次水中，超声分散1h后将其进行不等量分装加入到锥形瓶中，再分别加入二次水至10ml，得到不同浓度的go分散液(如表1)备用；表1go分散液浓度锥形瓶123456go浓度0μg/ml1μg/ml10μg/ml25μg/ml50μg/ml100μg/ml(3)将上述步骤(2)中的不同浓度的go分散液倒入24孔板内，每个浓度的go分散液各4个孔，共使用4块孔板，然后将巨噬细胞接种到24孔板(每孔3×105个细胞)中的go分散液内，再将这些孔板放入37℃、5％的co2培养箱中开放培养1、3、5、7d后，分别吸去培养液，并倒在显微镜下观察细胞的形态；(4)向培养巨噬细胞的孔内加入0.1ml的mtt溶液，继续在37℃的条件下培养4h，吸弃原培养液，每孔加入2ml的pbs溶液小心清洗2次，弃除余液，并立即在各孔中加入1ml的二甲基亚砜，室温放置并轻微振荡20min使结晶物充分溶解，然后用酶联免疫检测仪(波长为490nm)测定其吸光度值(od值)并取平均值，再将吸光度值(od值)转换成细胞相对增值率(rgr)，然后将各组的rgr转换成细胞毒性级别，细胞毒性试验采用5分制法进行细胞毒性分级。rgr(％)＝实验组平均od值×100％/对照组平均od值，细胞相对增殖率与细胞毒性的分级的关系：rgr(％)≥100％的细胞毒性为0级，rgr(％)为75％～99％的细胞毒性为1级，rgr(％)为50％～74％的细胞毒性为2级，rgr(％)为25％～49％的细胞毒性为3级，rgr(％)为1％～24％的细胞毒性为4级，rgr(％)为0％的细胞毒性为5级，0级和1级被认为没有细胞毒性，2级为轻度细胞毒性，3级和4级为中度细胞毒性，5级为明显细胞毒性；(5)将盖玻片、培养皿和镊子先用洗衣粉洗干净，用水冲净烤干，然后泡酸过夜，捞酸后流水洗净，置于器皿中高压灭菌，然后在56℃烤箱中烘烤8h左右，烤干备用，用胰酶消化好巨噬细胞，充分吹打，得到单细胞悬液，向培养皿内加入少量培养基，使得盖玻片与培养皿紧密接触，将盖玻片小心放入摆放其中，然后将巨噬细胞悬液一滴一滴的滴到盖玻片上，再盖上培养皿置于37℃、5％的co2的暖箱中培养，根据巨噬细胞生长状况，24小时后取出包含爬片的培养皿，再将培养皿置于37℃的pbs溶液中洗三次，每次3到5秒钟，然后在4％多聚甲醛中固定15min，再用37℃去离子水将甲醛冲干净，注意手法轻柔，否则掉片很厉害，然后用pbs溶液漂洗5min，0.5％的triton穿孔15min(丙酮固定法不用透化处理)，再用pbs溶液漂洗2次，每次5min，1％的bsa封闭30min，然后加入去离子水稀释的fitc标记的鬼笔环肽稀释液，于37℃的条件下避光反应40min，再用pbs溶液漂洗2次，每次5min，5ug/ml的dapi染色2min，然后用抗淬灭封片剂(2.5％dabco(w/v)：50mmol/ltris(ph8.0)：90％甘油)封片，从而完成巨噬细胞微丝骨架结构标记实验。实施例2：一种基于免疫细胞测定go生物学效应的方法，根据实施例1所得实验材料测定不同浓度的go基于巨噬细胞产生的生物学效应，具体结果如下：(1)细胞形态观察光学显微镜照片可见处理组细胞形态异常，圆形细胞较多，即为漂浮的细胞，也就是不能很好的贴壁生长，对照组细胞生长良好(细胞为长梭形或卵圆形，细胞折光性强)，表明氧化石墨烯浓度≥1μg/ml时表现出明显细胞毒性，见图1；(2)各组细胞的od值、细胞增殖率及细胞毒性各组细胞的od值、细胞增殖率及细胞毒性用分光光度计来测定，如表2(注：*表示与对照组有显著性差异)：表2各组细胞吸光度、细胞增殖率及细胞毒性由表2可以看出，随着go浓度的增加细胞增殖率在不断降低，细胞毒性显著增加，各组差异有统计学意义(p﹤0.05),随着测量天数的增加，细胞增殖率在不断减小，细胞毒性有增加趋势(表2中go的浓度为50μg/ml的那一组在第7天时，相对增值率降到41.89％，按照毒性分级已经跃升到3级)，各组差异均具有统计学意义(p<0.05)。(3)各组细胞微丝骨架及细胞毒性为了进一步探索go对细胞损伤的作用可能的机制，本实验采用fitc标记的鬼笔环肽作为一抗特异性标记巨噬细胞的微丝骨架，结果如图2显示，对照组(a)的荧光强度显著高于处理组(b、c、d、e、f)荧光强度，六个go分散液的不同剂量组细胞的荧光强度的灰度值如图3显示，与对照组相比，免疫阳性反应灰度值逐渐减小，且具有剂量依赖效应，详细数据见表3：表3各组细胞微丝骨架免疫反应灰度值分析实施例3：本实验通过比较巨噬细胞在go浓度为0、1、10、25、50、100μg/ml的不同时间段的增殖率来测定go的细胞毒性。结果显示，细胞毒性与go的浓度呈正相关，且具有剂量依赖效应关系；随着测量天数的增加，细胞毒性并没有明显减小。本研究还发现，各组在1、3、5、7d差异均具有统计学意义，且各组细胞毒性总体趋势有微弱的增强趋势，其原因为随着时间的延长，细胞活性降低导致细胞增值率下降。通过表2可知，除go浓度为100μg/ml时在1、3、5d细胞毒性为3外，其余各组细胞毒性为1、2，而浓度为50μg/ml时在7d细胞毒性增加为3(见表2)，此结果表明，本实验所使用的go剂量均对巨噬细胞造成损伤，而且go浓度为50、100μg/ml组在第7天，细胞毒性有增强现象。只有浓度为1.0μg/ml的go有轻度细胞毒性。通过光学显微镜观察发现，与对照组相比，go暴露处理组细胞形态均有不同程度的异常现象，贴壁细胞减少，漂浮细胞增多，圆形细胞比例增加。需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。当前第1页12