一种植物株型生长发育相关蛋白及其编码基因与应用的制作方法

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种植物株型生长发育相关蛋白及其编码基因与应用。

背景技术

水稻是我国重要的粮食作物之一，水稻生产在我国粮食生产和国民经济中具有极其重要的作用。由于经济快速发展、人口压力增大和耕地面积减少，水稻生产面临巨大的压力。因此，培育单产潜力显著提高的水稻新品种将为缓解或解决粮食安全问题贡献重要力量。株型是与水稻产量密切相关的重要农艺性状，株型主要取决于株高、叶型、分蘖数目、分蘖角度和穗部形态等几个方面。近年来，利用分子遗传学和功能基因组学的方法，开展水稻株型功能基因研究已经成为热点，并具有重要的现实意义。

目前已发掘并鉴定的控制水稻株高性状的基因个体综合农艺性状表现较差，在生产上难以利用，sd1在生产上应用了近60年时间，单一基因的广泛利用可能会对水稻多样性分化造成影响。当今株型育种的主要问题是可应用的株高基因太少，如何突破瓶颈应用新的株高基因显得尤为关键。因此，发掘并鉴定株高新资源，深入探究调控株高的分子机制，将有助于水稻育种家在育种过程中避免对单一株高基因的依赖，同时可为分子设计育种改良水稻株叶型提供理论依据，最终实现高效育种。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种植物株型生长发育相关蛋白及其编码基因与应用。

本发明提供的蛋白质，来源于水稻(oryzasativa)，命名为ossgd2蛋白，为如下(a)或(b)或(c)或(d)：

(a)序列表的序列1所示的蛋白质；

(b)将序列1进行一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与植物株型相关的由其衍生的蛋白质；

(c)来源于水稻且与(a)具有95％以上同一性和相同功能的蛋白质；

(d)在(a)或(b)或(c)的n端或/和c端连接标签得到的融合蛋白质。

标签具体如表1所示。

表1标签的序列

蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

编码ossgd2蛋白的基因，命名为ossgd2基因，也属于本发明的保护范围。

ossgd2基因为如下(1)或(2)或(3)或(4)或(5)所述的dna分子：

(1)编码区如序列表中序列2所示的dna分子；

(2)序列表中序列3所示的dna分子；

(3)与(1)具有75％以上同一性且编码植物株型相关蛋白的dna分子；

(4)来源于水稻且与(1)或(2)具有90％以上同一性且编码植物株型相关蛋白的dna分子；

(5)在严格条件下与(1)或(2)杂交且编码植株株型相关蛋白的dna分子。

所述严格条件是在2×ssc，0.1％sds的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×ssc，0.1％sds的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min。

上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。

含有ossgd2基因的表达盒、重组载体或重组菌均属于本发明的保护范围。

可用现有的表达载体构建含有所述基因的重组表达载体。使用所述基因构建重组表达载体时，可在其转录起始核苷酸前加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用所述基因构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是atg起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物或转基因微生物进行鉴定及筛选，可对所用表达载体进行加工，如加入在植物或微生物中表达可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因等。从转基因安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以表型筛选转化植物或微生物。

所述株型具体为株高。

本发明还保护一种制备转基因植物的方法，包括如下步骤：在出发植物中导入抑制ossgd2基因表达的物质，得到与所述出发植物相比株高降低的转基因植物。所述抑制ossgd2基因表达的物质具体可为干扰载体。所述出发植物为双子叶植物或单子叶植物。所述单子叶植物可为水稻，例如水稻kitaake。

本发明还保护一种植物育种方法，包括如下步骤：降低目的植物中ossgd2蛋白的活性和/或含量，从而降低植物的株高。所述目的植物为双子叶植物或单子叶植物。所述单子叶植物可为水稻，例如水稻kitaake。

本发明还保护用于抑制ossgd2基因表达的物质的应用，为培育株高降低的转基因植物。所述抑制ossgd2基因表达的物质具体可为干扰载体。所述植物为双子叶植物或单子叶植物。所述单子叶植物可为水稻，例如水稻kitaake。

本发明还保护用于降低ossgd2蛋白的活性和/或含量的物质的应用，为降低植物的株高。所述植物为双子叶植物或单子叶植物。所述单子叶植物可为水稻，例如水稻kitaake。

本发明还保护ossgd2蛋白的应用，为如下(ⅰ)或(ⅱ)或(ⅲ)：

(ⅰ)调控植物的株型；

(ⅱ)调控植物的株高；

(ⅲ)提高植物的株高。

所述植物为双子叶植物或单子叶植物。所述单子叶植物可为水稻，例如水稻kitaake。

本发明还保护一种干扰片段，为dna分子，具有片段甲和片段乙，片段甲和片段乙反向互补，片段甲如序列表的序列2第1至531位核苷酸所示。所述干扰片段具体如序列表的序列4所示。

本发明还保护一种干扰载体。

以上任一所述干扰载体具有片段甲和片段乙，片段甲和片段乙反向互补，片段甲如序列表的序列2第1至531位核苷酸所示。以上任一所述干扰载体具有序列表的序列4所示的dna分子。

上文中，所述转基因水稻理解为不仅包含将所述基因转化受体水稻得到的第一代转基因水稻，也包括其子代。对于转基因水稻，可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述转基因水稻包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。

本发明首次鉴定了与水稻株型生长发育相关蛋白ossgd2，水稻株型生长发育相关蛋白ossgd2的编码基因在功能丧失或表达量下降的条件下会引起水稻株高矮化，证明水稻株型生长发育相关蛋白或其基因在控制水稻株高中发挥重要作用。本发明不仅为进一步阐明水稻株型的分子机理提供基础，而且为水稻育种提供新的基因资源和育种资源。本发明获得的ossgd2基因表达降低的转基因水稻，作为新的水稻种质材料，可用于研究水稻矮化的分子机理和发现更多的调控水稻株高发育的基因。本发明对于通过遗传育种和基因工程方法利用该基因资源有效地调控水稻株型具有重要的应用价值。

附图说明

图1为ossgd2基因表达水平。

图2为抽穗拔节时期的植株照片。

图3为成熟期植株的株高。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

实施例中所用的载体plhrnai为申请号为201110055864.x(公告号为cn102191262b，公告日为2013-03-20)的专利的说明书的实施例1构建的plhrnai重组载体。

n6培养基：sigma，产品目录号为c1416。

水稻kitaake(也称为野生型水稻，用wt表示)，记载在如下文献：gaoh,zhengxm,feig,chenj,jinm,reny,wuw,zhouk,shengp,zhouf,jiangl,wangj,zhangx,guox,wangjl,chengz,wuc,wangh,wanjm.ehd4encodesanovelandoryza-genus-specificregulatorofphotoperiodicfloweringinrice.plosgenet.2013，9(2):e1003281。mt植株是从极大数量的水稻kitaake植株中获得的自然发生ossgd2基因突变的突变体，作为rnai植株的对照，理论上具有与rnai植株相同的表型。

从水稻kitaake中发现一个新蛋白，命名为ossgd2蛋白，如序列表的序列1所示。将编码ossgd2蛋白的基因命名为ossgd2基因，位于cdna中的开放阅读库如序列表的序列2所示，位于基因组dna中的基因如序列表的序列3所示。

实施例1、干扰植株的获得和鉴定

一、干扰载体的构建

1、提取水稻kitaake的14天幼苗的总rna，反转录得到cdna。

2、以步骤1得到的cdna为模板，用ossgd2-sense-f和ossgd2-sense-r组成的引物进行pcr扩增，得到片段1(seq正向)。

ossgd2-sense-f：5'-ttctgcactaggtaccaggcctgatgatgggggccacttctccgt-3'；

ossgd2-sense-r：5'-ctgacgtaggggcgatagagctcgtgcggcgagagcaccgtgggc-3'。

3、以步骤1得到的cdna为模板，用ossgd2-antisense-f和ossgd2-antisense-r组成的引物进行pcr扩增，得到片段2(seq反向)。

ossgd2-antisense-f:5'-cggggatccgtcgactacgtgcggcgagagcaccgtgggc-3'；

ossgd2-antisense-r:5'-aggtggaagacgcgttacatgatgggggccacttctccgt-3'。

4、用限制性内切酶saci酶切载体plhrnai，得到线性化载体。

5、步骤2得到的片段1与步骤4得到的线性化载体采用同源重组定向克隆的方法整合，得到重组载体。

6、用限制性内切酶snabi酶切步骤5得到的重组载体，得到线性化载体。

7、步骤3得到的片段2与步骤6得到的线性化载体采用同源重组定向克隆的方法整合，得到重组质粒plhrnai-ossgd2。

重组质粒plhrnai-ossgd2进行测序，测序结果表明，重组质粒中具有序列表的序列4所示的dna分子。序列表的序列4中，具有片段甲和片段乙，片段甲和片段乙反向互补，片段甲如序列表的序列2第1至531位核苷酸所示。

二、rnai干扰植株的获得

1、将重组质粒plhrnai-ossgd2导入根癌农杆菌eha105，得到重组农杆菌。

2、用含100μm乙酰丁香酮的液体n6培养基悬浮步骤1得到的重组农杆菌，得到od600nm≈0.5的菌液，即为侵染液。

3、将水稻kitaake的成熟胚胚性愈伤组织浸入步骤2得到的侵染液中30min，然后取愈伤组织，用滤纸吸干菌液，然后将愈伤组织置于固体n6培养基上，24℃培养3天。

4、完成步骤3后，将愈伤组织置于含150mg/l潮霉素的固体n6培养基上，24℃培养16天。

5、完成步骤4后，将愈伤组织置于含200mg/l潮霉素的固体n6培养基上培养，每15天继代一次。

6、取步骤5得到的愈伤组织，置于含150mg/l潮霉素的分化培养基上，24℃培养45天(此时植株地上部分高度约为15cm)，然后打开瓶口炼苗3天，然后将植株移栽至温室栽培，即为t0代植株。

分化培养基：取6-ba2mg、naa0.2mg、n64g、水解酪蛋白1g、肌醇0.1g、蔗糖25g、山梨醇2.4g、琼脂粉7g，用去离子水溶解并定容至1l。

7、步骤6得到的t0代植株进行pcr鉴定。

提取植株幼苗的基因组dna，采用1390-f和fad2-r组成的引物对进行正向pcr鉴定,采用1390-r和fad2-f组成的引物对进行反向pcr鉴定。

1390-f：5’-tgccttcatacgctatttatttgc-3’；

fad2-r：5’-gaagcgacggacctggagat-3’。

fad2-f：5’-cctttcacaacctgatttccca-3’；

1390-r：5’-taatcatcgcaagaccggcaacagg-3’。

如果正向pcr鉴定和反向pcr鉴定均显示扩增产物，该植株为rnai干扰植株。

将得到的rnai干扰植株依次命名为rnai-1植株、rnai-2植株、……、rnai-n植株。n为自然数。

三、ossgd2基因表达水平的鉴定。

待测植株分别为：rnai-1植株、rnai-2植株、水稻kitaake植株、mt植株。

提取待测植株的总rna并反转录为cdna。以cdna为模板，采用ubiquitin基因作为内参基因，采用荧光定量pcr检测ossgd2基因的相对表达量。

用于鉴定ubiquitin基因的引物如下：

ubi-f：5’-gctccgtggcggtatcat-3’；

ubi-r：5’-cggcagttgacagccctag-3’。

用于鉴定ossgd2基因的引物如下：

ossgd2-qrt-f：5’-ggaggccttggcgatcaa-3’；

ossgd2-qrt-r:5’-actccatctccgtctgcttc-3’。

结果见图1。与水稻kitaake植株相比，rnai-1植株和rnai-2植株中ossgd2基因的表达水平显著下降。

四、转空载体植株的获得

用载体plhrnai代替重组质粒plhrnai-ossgd2，其他同步骤二，得到转空载体植株。

五、表型鉴定

待测植株分别为：rnai-1植株、rnai-2植株、转空载体植株、mt植株、水稻kitaake植株。

待测植株种植于大田，在平行条件下培养，观察整个生长期内植株的表型。

抽穗拔节时期的植株照片见图2。与水稻kitaake植株相比，rnai-1植株和rnai-2植株均出现了株高矮化的表型。转空载体植株与水稻kitaake植株的表型一致。

统计成熟期植株的株高，结果见图3。与水稻kitaake植株相比，rnai-1植株和rnai-2植株的成熟期株高极其显著的降低，下降幅度为60％以上。与水稻kitaake植株相比，转空载体植株的株高无显著差异。

结果表明，ossgd2蛋白参与控制水稻的生长发育，具体与株型相关，更具体与株高相关。

sequencelisting

<110>中国农业科学院作物科学研究所

<120>一种植物株型生长发育相关蛋白及其编码基因与应用

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