本发明涉及一种中药的检测方法，更具体的说是涉及一种大黄粉微生物限度的检测方法。
背景技术：
大黄是一种常见的中药，主要来源于蓼科植物掌叶大黄、唐古特大黄或药用大黄的干燥根和根茎。大黄味苦，性寒，归脾、胃、大肠、肝、心包经。具有泻下攻积，清热泻火，凉血解毒，逐瘀通经，利湿退黄的功效。
药物的微生物限度检测是保证安全用药的重要指标之一，但由于供试品本身的特性，可能含有某些具有抑菌作用的组分成分，如抗生素中药中的黄连、牛黄等组分。这些组分在一定浓度下对微生物具有抑制作用，并可能对药品中污染的微生物造成不同程度的损伤。如果按常规的检测方法进行，供试品中污染的微生物在这些物质的影响下就有可能检测不出来，但这些被抑制或者损伤的微生物，并未死亡，依然能够存活较长一段时间，当微生物生存环境改变后，如抑菌成分消除或者浓度降低时，这些微生物便可以复苏并繁殖，患者使用后同样可危及人体健康，因此需要建立一种准确的微生物限度的检测方法，准确有效的检测出药品中微生物含量。但目前各种文献上，都没有记载关于大黄粉微生物限度的检查方法，从而造成临床使用大黄粉的安全性无法真正保障。
技术实现要素：
针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种大黄粉微生物限度的检测方法，该检测方法准确有效。
为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：一种大黄粉微生物限度的检测方法，包括以下步骤：
步骤一：称取供试品大黄粉，加入氯化钠-蛋白胨缓冲液，制得供试液；其中每 1mg大黄粉需加入10ml氯化钠-蛋白胨缓冲液
步骤二：配置浓度为10-4—10-6稀释级的微生物菌液，且每1ml微生物菌液中含有50-100cfu微生物；
步骤三：用薄膜过滤法对供试液中微生物进行计数；先用冲洗液润湿滤膜；再将步骤一中制得的供试液经过薄膜滤过；接着用无菌氯化钠溶液对薄膜进行冲洗，最后将微生物菌液经过薄膜滤过；
步骤四：将步骤三中的滤膜放置于培养基中，再将培养基放入培养箱中培养，然后观察计数；
步骤五：平行重复至少两次试验，将多次试验得到的数值取平均值。
作为本发明的进一步改进，所述步骤一中的缓冲液和步骤三中的冲洗液均为 PH＝7的氯化钠-蛋白胨缓冲液。
作为本发明的进一步改进，所述微生物菌液为金黄色葡萄球菌菌液、铜绿假单胞菌菌液、枯草芽孢杆菌菌液、白色念珠菌菌液和黑曲霉菌菌液中的至少一种。作为本发明的进一步改进，所述金黄色葡萄球菌菌液的浓度为10-6稀释级；所述铜绿假单胞菌菌液的浓度为10-5稀释级；所述枯草芽孢杆菌菌液的浓度为10-5稀释级；所述白色念珠菌菌液的浓度为10-6稀释级；所述黑曲霉菌菌液的浓度为10-4稀释级。
作为本发明的进一步改进，当微生物菌液为金黄色葡萄球菌菌液或铜绿假单胞菌菌液或枯草芽孢杆菌菌液时，步骤四中的培养基为胰酪大豆胨琼脂培养基。作为本发明的进一步改进，当微生物菌液为金黄色葡萄球菌菌液或铜绿假单胞菌菌液或枯草芽孢杆菌菌液时，步骤四中培养基放入培养箱中培养的具体方式为将培养基放置于温度为30-35℃的培养箱中培2-4天。
作为本发明的进一步改进，当微生物菌液为白色念珠菌菌液和黑曲霉菌菌液时，其培养基为沙氏葡萄糖琼脂培养基。
作为本发明的进一步改进，当微生物菌液为白色念珠菌菌液和黑曲霉菌菌液时，步骤四中培养基放入培养箱中培养的具体方式为将培养基放置于20-25℃的培养箱中培养1-3天。
作为本发明的进一步改进，所述无菌氯化钠溶液的浓度均为0.9％。
本发明的有益效果：先称取大黄粉供试品，配置成供试液；接着配置本发明所需要的培养基和缓冲液，然后培养微生物菌液，本发明中微生物为金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌和黑曲霉菌5种，每种微生物菌液的浓度不同；然后用薄膜过滤法进行计数，即可得到大黄粉中微生物含量，保证大黄粉的安全性；同时本发明中还检测了各种微生物的菌落回收率，每种微生物的菌落回收率均大于70％，证明该试验数据有效，同时说明了在本实验条件下大黄粉对微生物没有抑菌作用，此外还通过控制菌检查法进一步验证试验数据的准确性，使得实验数据更加可信；本方法准确有效严谨，容易操作，适合用于测量大黄粉的微生物限度检测，以保证临床使用大黄粉的安全性。
具体实施方式
一种大黄粉微生物限度的检测方法，包括以下步骤：
步骤1：用电子天平称取待测大黄粉10mg，加入pH为7.0的氯化钠-蛋白胨缓冲液至100mL制成供试液；
步骤2：配置培养基和缓冲液，按照2015版《中国药典》规定配置胰酪大豆胨液体培养基、胰酪大豆胨琼脂培养基、沙氏葡萄糖琼脂培养基、甘露醇氯化钠琼脂培养基、溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基、pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液；
步骤3：将金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌三种细菌分别放入胰酪大豆胨琼脂培养基中培养，培养方式为在33℃条件下培养18-24h，培养好后各取1个白金耳，然后分别用0.9％的无菌氯化钠溶液稀释成每1ml含50-100cfu的菌悬液；其中将金黄色葡萄球菌菌液稀释至10-6稀释级，铜绿假单胞菌菌液稀释至10-5稀释级，枯草芽孢杆菌菌液稀释至10-5稀释级；
步骤4：将白色念珠菌放入沙氏葡萄糖琼脂培养基中培养，培养方式为在 23℃条件下培养48-72h，培养好后取1个白金耳，用0.9％的无菌氯化钠溶液稀释至10-6稀释级，每1ml含50-100cfu的菌悬液；
步骤5：将黑曲霉菌放入沙氏葡萄糖琼脂培养基中培养，培养方式为在23℃条件下培养120-168h，培养好后用3ml0.9％的氯化钠溶液将孢子洗脱，再用无菌毛细吸管吸出孢子悬液至无菌试管内，用无菌氯化钠溶液稀释成10-4级且每 1mL含50～100cfu的孢子悬液；
步骤6：用薄膜过滤法计数，取标号A、B、C、D、E五个锥形瓶，每个锥形瓶中加入0.9％的无菌氯化钠溶液50mL，将制备好的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉菌的菌液各0.1mL分别置于A、 B、C、D、E五个锥形瓶中，混匀；先用氯化钠-蛋白胨缓冲液润湿滤膜，润湿后，然后取供试液1mL用薄膜过滤法滤过；接着取200mL浓度为0.9％的无菌氯化钠溶液冲洗供试品，最后分别将A、B、C、D、E五个锥形瓶内的菌悬液经过滤膜滤过；将A、B、C的滤膜菌面朝上贴于胰酪大豆胨琼脂培养基平板上，平行重复两份，放置于33℃培养箱培养3天，观察计数；将D、E的滤膜菌面朝上贴于沙氏葡萄糖琼脂培养基平板上，平行重复两份，置23℃培养箱培养2 天，观察计数；
步骤7：设置菌液组和对照组进行实验；其中菌液组取pH为7.0的氯化钠- 蛋白胨缓冲液替代供试液，其他同试验组操作；对照组取制备好的供试液1mL，不加微生物菌液，其他同试验组操作；试验组的菌落回收率(％)＝(试验组平均菌落数－对照组平均菌落数)/菌液组平均菌落数×100％；
步骤8：若步骤7中的菌落回收率小于70％，则试验结果无效，若菌落回收率大于70％，则证明试验结果有效，该方法可行；
薄膜过滤法测定大黄粉中各菌种的回收率
通过检测发现，发现5种微生物的回收率均大于70％，说明此时大黄粉对各种微生物没有抑菌作用，该实验结果有效，从而说明该检测方法的准确性。
为了进一步验证试验数据的准确性，通过用控制菌检验法对实验数据进行验证：
S1、首先取步骤5中的供试液10ml，放置于盛有100ml胰酪大豆胨液体培养基的锥形瓶中，加入50-100cfu，浓度为10-6级的金黄色葡萄球菌菌液1ml，于33℃条件下培养24h，然后将培养后的培养物用划线接种的方法接种至甘露醇氯化钠琼脂培养基平板中，于33℃条件培养3天，然后计数，平行重复两次试验，取平均值。
S2、首先取步骤5中的供试液10ml，放置于盛有100ml胰酪大豆胨液体培养基的锥形瓶中，加入50-100cfu，浓度为10-5级的铜绿假单胞菌菌液1ml，于 33℃条件下培养24h，然后将培养后的培养物用划线接种的方法接种至溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基平板中，于33℃条件培养3天，然后计数，平行重复两次试验，取平均值。
S3、首先取步骤5中的供试液10ml，放置于盛有100ml胰酪大豆胨液体培养基的锥形瓶中，加入50-100cfu，浓度为10-5级的枯草芽孢杆菌菌液菌液1ml，于33℃条件下培养24h，然后将培养后的培养物用划线接种的方法接种至溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基平板中，于33℃条件培养3天，然后计数，平行重复两次试验，取平均值。
S4、首先取步骤5中的供试液10ml，放置于盛有100ml沙氏葡萄糖液体培养基的锥形瓶中，加入50-100cfu，浓度为10-6级的白色念珠菌菌液1ml，于23℃条件下培养24h，然后将培养后的培养物用划线接种的方法接种至沙氏葡萄糖琼脂培养基培养基平板中，于23℃条件培养2天，然后计数，平行重复两次试验，取平均值。
S5、首先取步骤5中的供试液10ml，放置于盛有100ml沙氏葡萄糖液体培养基的锥形瓶中，加入50-100cfu，浓度为10-4级的黑曲霉菌菌液菌液1ml，于 23℃条件下培养24h，然后将培养后的培养物用划线接种的方法接种至沙氏葡萄糖琼脂培养基培养基平板中，于23℃条件培养2天，然后计数，平行重复两次试验，取平均值。
通过控制菌检验法得出的数据与本发明得到试验数据相比，两者基本相同，从而进一步验证得到本发明实验数据的准确性。
本发明一种大黄粉微生物限度的检测方法，用于检测外用大黄粉的微生物限度，包括有以下步骤，先用用电子天平称取供试品大黄粉10mg，然后加入pH 为7.0的氯化钠-蛋白胨缓冲液，最终配置成供试液100ml；接着制备本发明需要用到的培养基和缓冲液，根据2015年版的“中国药典”的规定说明配置好胰酪大豆胨液体培养基、胰酪大豆胨琼脂培养基、沙氏葡萄糖琼脂培养基、甘露醇氯化钠琼脂培养基、溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基、pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液；配置好培养基和缓冲液后，将金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌三种细菌分别放入胰酪大豆胨琼脂培养基中培养，培养方式为在33℃条件下培养18-24h，培养好后各取1个白金耳，其中白金耳是沟渠少量微生物的用具，通常是把0.5毫米粗，7厘米长白金丝插接在普通玻璃棒的一端，做成白金针，然后从针的一端将之弯曲成直径1—2毫米的圆环，即为白金耳，对载有一定量细菌的白金耳即为标准白金耳，然后分别用0.9％无菌氯化钠溶液稀释成每一毫升中含有50-100cfu的菌悬液，其中金黄色葡萄球菌菌液稀释至10-6稀释级，铜绿假单胞菌菌液稀释至10-5稀释级，枯草芽孢杆菌菌液稀释至10-5稀释级；将白色念珠菌放入沙氏葡萄糖琼脂培养基中培养，培养方式为在23℃条件下培养48-72h；培养好后取1个白金耳，用0.9％无菌氯化钠溶液稀释至10-6稀释级，每1ml含50-100cfu的菌悬液；黑曲霉菌放入沙氏葡萄糖琼脂培养基中培养，培养方式为在23℃条件下培养120-168h，培养好后用0.9％3mL氯化钠溶液将孢子洗脱，再用无菌毛细吸管吸出孢子悬液至无菌试管内，用0.9％无菌氯化钠溶液稀释成10-4级且每1mL含50～100cfu的孢子悬液。
本发明采用薄膜过滤法来检测微生物，薄膜过滤法方便快捷，不需要增加任何化学试剂；首先取标号A、B、C、D、E五个锥形瓶，每个锥形瓶中均加入 0.9％无菌氯化钠溶液50mL，取金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉菌的菌液各0.1mL分别置于A、B、C、D、E五个锥形瓶中，混匀；先用冲洗液润湿滤膜，再抽掉冲洗液，这里的冲洗液是用薄膜过滤时自带的溶液或者用0.9％的无菌氯化钠溶液也可，然后取供试液1ml，接着用 0.9％200ml无菌氯化钠溶液冲洗稀释，最后分别将A、B、C、D、E五个锥形瓶内的菌悬液倒入滤筒，滤过；将A，B，C的滤膜菌面朝上贴于胰酪大豆胨琼脂培养基平板上，平行两份，置33℃培养箱培养3-5天，观察计数；将D，E的滤膜菌面朝上贴于沙氏葡萄糖琼脂培养基平板上，平行两份，置23℃培养箱培养3-5 天，观察计数；菌液组取pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液替代供试液，同试验组操作；对照组取制备好的供试液1mL，不加菌液，同试验组操作；通过只加供试液，不加菌液目的是消除供试液自身带有带的细菌以及药物本身的吸光度对实验造成的影响；只加菌液的目的是知道这些微生物原本的存活量；通过用薄膜过滤法对各种菌菌落数测定，而菌落回收率则用于检验试验数据是否有效，当菌落回收率大于70％时，我们可认为该试验数据有效，若小于70％，这说明该含量下的药物对于微生物有抑制作用，会影响试验结果，试验数据无效；从表中可知，发现5种微生物的回收率均大于70％，说明此时大黄粉对各种微生物没有抑菌作用，该实验结果有效，从而说明该检测方法的准确性。
最后用控制菌检查法进行验证，经过检验进一步得到数据的准确性，从而说明该检测方法的有效性，能够对大黄粉中微生物含量进行有效的检测。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。