本发明涉及微生物检测技术领域，尤其是涉及一种纺锤水蚤体表附着细菌的检测方法。
技术背景
纺锤水蚤广泛分布于海洋，是众多经济鱼类和虾蟹幼体主要的天然饵料生物。据fao估计，1999年海洋渔业产业中，0.92亿吨的渔获量是以天然桡足类饵料生物为食的鱼类。纺锤水蚤属，广泛分布与我国沿海、日本沿海、太平洋和印度洋，是舟山渔场及邻近海域夏季浮游动物的优势种之一，由于生活史短、饵料副宽等特点，适合应用于水产养殖业。纺锤水蚤的营养价值n-3高度不饱和脂肪酸(n-3hupa)是海水仔稚鱼的必需脂肪酸，它们是海水仔稚鱼正常生长所必需的，尤其是廿碳五烯酸(epa，20:5n-3)和廿二碳六烯酸(dha，22:6n-3)。epa和dha的缺乏或不足将影响鱼虾幼体的生长发育，成活率降低，活力不足，抗逆性减弱。海水鱼不能把亚麻酸(18:3n-3)自身生物合成为epa和dha，所需要的epa和dha只能从饲料中摄取。大量研究表明很多沿岸性的桡足类动物富含dha和epa(大约占到所含脂肪酸的60％)，能够满足仔稚鱼对hufa的需求。但自然海域采集的纺锤水蚤由于携带许多致病细菌，直接投喂易引起养殖病害扩散，因此急需提前测定纺锤水蚤的携带细菌情况。
目前国内外对于水中无脊椎类浮游动物体表附着细菌的检测主要是采用wolmarans.e提出的方法。该方法以蒸馏水或者生理盐水浸泡浮游动物，通过浮游动物体表附着细菌向水中的自然释放来获得体表附着细菌的样品，有时为了增加释放效率也会采用手摇或摇床振荡等辅助手段。尽管如此，此类方法的浮游动物体表附着细菌的解吸效率仍然不高，采用此类方法解吸水蚤类浮游动物体表附着细菌后，进行培养基培养检测，存在水蚤类浮游动物体表附着细菌的检测值偏低且波动性较大等弊端。现在技术如授权公告号为cn103451263b的中国发明专利，公开了一种剑水蚤类浮游动物体表附着细菌的检测方法，包括以下步骤：步骤1，取水样中的剑水蚤，将其洗涤至无细菌检出；步骤2，将步骤1所得剑水蚤放入离心管中，加入解吸剂；步骤3，将步骤2中离心管放入离心机离心处理；步骤4，取离心后的上清液，取离心后的上清液，用生活饮用水标准检验法中细菌总数的测定方法进行细菌培养，培养后的菌落进行计数。该法操作步骤简单，检测周期短，对于剑水蚤类浮游动物体表附着细菌的检测效果显著。但是该检测方法对水蚤类浮游动物体表附着细菌的解吸效果仍然不是太理想。
技术实现要素：
本发明的目的之一在于提供一种操作步骤简单、检测周期短，使得体表附着细菌脱附效率高、速度快、解吸更加彻底、解吸剂用量少，检测方法准确度高、检测结果稳定可靠的纺锤水蚤体表附着细菌的检测方法。
本发明针对背景技术中提到的问题，采取的技术方案为：
一种纺锤水蚤体表附着细菌的检测方法，包括预处理、解吸、检测，其中，解吸步骤为：将预处理所得纺锤水蚤放入装有25ml无菌水的50ml离心管中，加入0.8-1.2ml解吸剂溶液，在330-380w的超声波功率下超声处理12-15min，然后再在1800-2300rpm、20-30℃下离心处理2-5min，离心结束后取离心上清液，备用。本发明解吸步骤采用解吸剂、超声波处理和离心处理相结合的方式对纺锤水蚤体表附着细菌进行解吸，较现有技术，使得体表附着细菌脱附效率高、速度快、解吸更加彻底、解吸剂用量少，进而使得本发明检测方法准确度高、检测结果稳定可靠，且该检测法操作步骤简单、检测周期短，对于纺锤水蚤类浮游动物体表附着细菌的检测效果显著。
作为优选，解吸剂用表面活性剂包含鼠李糖脂和吐温80。纺锤水蚤体表附着细菌主要依靠微生物分泌胞外聚合物而形成的生物膜粘附于纺锤水蚤体表，而鼠李糖脂和吐温80的合理存在能够和解吸剂中的其他成分发生增益作用，能够破坏生物膜外侧的亲水膜，进而破坏生物膜的空间三维结构，促进细菌生物膜的解体，然后配合离心作用，使得生物膜脱落而解体，进而使其内部微生物能够完全散播到解脱剂中，提高本发明检测方法的精确性。
进一步优选，表面活性剂还包含d-鼠李糖，表面活性剂中鼠李糖脂、吐温80和d-鼠李糖的质量比为1:10-12:0.03-0.05。该表面活性剂中特殊比例的鼠李糖脂、吐温80和d-鼠李糖的混合结合显著降低阴离子非离子表面活性剂的沉淀/吸附损失，提高表面活性剂有效浓度，从而协同增强解吸水蚤体表附着细菌，增强纺锤水蚤体表附着细菌的解吸，显著减少解吸剂用量，同时能协同增大附着细菌在溶液中浓度，提高附着细菌的解析度。
作为优选，解吸剂中还含有d-氨基酸。d-氨基酸能够占据菌表亲疏水点位，改变细菌表面疏水性，提高有生物膜内释放出的细菌表面亲水性和zeta电位绝对值，使得纺锤水蚤体表附着细菌在解脱剂的作用下快速溶于其中，且d-氨基酸对细菌的生长活性没有明显影响，能够保证检测结果的稳定性和精确性。
进一步优选，d-氨基酸选自d-酪氨酸、d-亮氨酸、d-异亮氨酸、d-苯丙氨酸或d-甲硫氨酸。
为了优化技术方法，采取的措施还包括：解吸剂具体包括如下成分及其重量份：氯化钠0.8-1.0份、表面活性剂0.03-0.05份、磷酸氢二钠0.1-0.25份、磷酸二氢钾0.2-0.4份、d-氨基酸0.01-0.02份。该解吸剂中各有效成分间能发挥协同作用，在较少量作用的条件下即能使纺锤水蚤体表附着细菌实现解吸彻底、效率高的解吸。
作为优选，解吸剂溶液的浓度为1.14-1.72％。
作为优选，预处理的具体步骤步骤为：取目标海域收集的纺锤水蚤，置于无菌滤网上，用无菌超纯水冲洗无菌滤网上的剑水蚤，冲洗至滤网流出的冲洗水中不得检测出细菌。冲洗目标海域收集的剑水蚤是为了避免取样过程中水样中的自由细菌对剑水蚤体表附着细菌检测的影响，该预处理步骤能使使自由细菌清洗彻底，缩短清洗时间，同时又避免在清洗过程中体表细菌过多损失。
作为优选，检测的具体步骤步骤为：将解吸步骤所得离心上清液，用生活饮用水标准检验法中细菌总数的测定方法进行细菌培养，培养后的菌落进行计数。
进一步优选，预处理和检测步骤中细菌检测是根据gb/t5750.12-2006中细菌总数的测定方法进行的。
与现有技术相比，本发明的优点在于：1)本发明检测方法操作步骤简单、检测周期短，对于纺锤水蚤类浮游动物体表附着细菌的检测效果显著，准确度高、检测结果稳定可靠；2)本发明解吸步使得体表附着细菌脱附效率高、速度快、解吸更加彻底、解吸剂用量少，进而使得本发明检测方法准确度高、检测结果稳定可靠；3)本发明用解吸剂中各有效成分间能发挥协同作用，在较少量作用的条件下即能使纺锤水蚤体表附着细菌实现解吸彻底、效率高的解吸，能够保证检测结果的稳定性和精确性；4)本发明检测方法经过适当改进也可用去检测其它浮游动物体内细菌，适用范围较广，实用性较强，具有较高的可操作性，适合广泛推广与应用。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明方案作进一步说明：
实施例1：
一种纺锤水蚤体表附着细菌的检测方法，包括预处理、解吸、检测，其中，解吸步骤为：将预处理所得纺锤水蚤放入装有25ml无菌水的50ml离心管中，加入0.8ml解吸剂溶液，在330w的超声波功率下超声处理12min，然后再在1800rpm、20℃下离心处理2min，离心结束后取离心上清液，备用。该解吸步骤采用解吸剂、超声波处理和离心处理相结合的方式对纺锤水蚤体表附着细菌进行解吸，较现有技术，使得体表附着细菌脱附效率高、速度快、解吸更加彻底、解吸剂用量少，进而使得检测方法准确度高、检测结果稳定可靠，且该检测法操作步骤简单、检测周期短，对于纺锤水蚤类浮游动物体表附着细菌的检测效果显著。
上述解吸剂用表面活性剂包含鼠李糖脂和吐温80。纺锤水蚤体表附着细菌主要依靠微生物分泌胞外聚合物而形成的生物膜粘附于纺锤水蚤体表，而鼠李糖脂和吐温80的合理存在能够和解吸剂中的其他成分发生增益作用，能够破坏生物膜外侧的亲水膜，进而破坏生物膜的空间三维结构，促进细菌生物膜的解体，然后配合离心作用，使得生物膜脱落而解体，进而使其内部微生物能够完全散播到解脱剂中，提高本发明检测方法的精确性。
上述表面活性剂还包含d-鼠李糖，表面活性剂中鼠李糖脂、吐温80和d-鼠李糖的质量比为1:10:0.03。该表面活性剂中特殊比例的鼠李糖脂、吐温80和d-鼠李糖的混合结合显著降低阴离子非离子表面活性剂的沉淀/吸附损失，提高表面活性剂有效浓度，从而协同增强解吸水蚤体表附着细菌，增强纺锤水蚤体表附着细菌的解吸，显著减少解吸剂用量，同时能协同增大附着细菌在溶液中浓度，提高附着细菌的解析度。
上述解吸剂中还含有d-氨基酸。d-氨基酸能够占据菌表亲疏水点位，改变细菌表面疏水性，提高有生物膜内释放出的细菌表面亲水性和zeta电位绝对值，使得纺锤水蚤体表附着细菌在解脱剂的作用下快速溶于其中，且d-氨基酸对细菌的生长活性没有明显影响，能够保证检测结果的稳定性和精确性。
其中，d-氨基酸选自d-酪氨酸、d-亮氨酸、d-异亮氨酸、d-苯丙氨酸或d-甲硫氨酸。
解吸剂具体包括如下成分及其重量份：氯化钠0.8份、表面活性剂0.03份、磷酸氢二钠0.1份、磷酸二氢钾0.2份、d-酪氨酸0.01份。该解吸剂中各有效成分间能发挥协同作用，在较少量作用的条件下即能使纺锤水蚤体表附着细菌实现解吸彻底、效率高的解吸。
其中，解吸剂溶液的浓度为1.14％。
预处理的具体步骤步骤为：取目标海域收集的纺锤水蚤，置于无菌滤网上，用无菌超纯水冲洗无菌滤网上的剑水蚤，冲洗至滤网流出的冲洗水中不得检测出细菌。冲洗目标海域收集的剑水蚤是为了避免取样过程中水样中的自由细菌对剑水蚤体表附着细菌检测的影响，该预处理步骤能使使自由细菌清洗彻底，缩短清洗时间，同时又避免在清洗过程中体表细菌过多损失。
检测的具体步骤步骤为：将解吸步骤所得离心上清液，用生活饮用水标准检验法中细菌总数的测定方法进行细菌培养，培养后的菌落进行计数，结果如表1。
其中，预处理和检测步骤中细菌检测是根据gb/t5750.12-2006中细菌总数的测定方法进行的。
实施例2：
一种纺锤水蚤体表附着细菌的检测方法，包括预处理、解吸、检测，具体为：
1)预处理的具体步骤：取目标海域收集的纺锤水蚤，置于无菌滤网上，用无菌超纯水冲洗无菌滤网上的剑水蚤，冲洗至滤网流出的冲洗水中不得检测出细菌；
2)解吸：将预处理所得纺锤水蚤放入装有25ml无菌水的50ml离心管中，加入1.0ml浓度为1.45％的解吸剂溶液，在350w的超声波功率下超声处理14min，然后再在2000rpm、25℃下离心处理3min，离心结束后取离心上清液，备用；
3)检测的具体步骤步骤为：将解吸步骤所得离心上清液，用生活饮用水标准检验法中细菌总数的测定方法进行细菌培养，培养后的菌落进行计数，结果如表1。
其中，解吸剂具体包括如下成分及其重量份：氯化钠0.9份、表面活性剂0.04份、磷酸氢二钠0.18份、磷酸二氢钾0.3份、d-氨基酸0.015份。上述表面活性剂中鼠李糖脂、吐温80和d-鼠李糖的质量比为1:11:0.04；d-氨基酸为质量比为1:0.25的d-酪氨酸和d-亮氨酸。
其中，预处理和检测步骤中细菌检测是根据gb/t5750.12-2006中细菌总数的测定方法进行的。
实施例3：
一种纺锤水蚤体表附着细菌的检测方法，包括预处理、解吸、检测，具体为：
1)预处理的具体步骤：取目标海域收集的纺锤水蚤，置于无菌滤网上，用无菌超纯水冲洗无菌滤网上的剑水蚤，冲洗至滤网流出的冲洗水中不得检测出细菌；
2)解吸：将预处理所得纺锤水蚤放入装有25ml无菌水的50ml离心管中，加入1.2ml浓度为1.72％的解吸剂溶液，在380w的超声波功率下超声处理15min，然后再在2300rpm、30℃下离心处理5min，离心结束后取离心上清液，备用；
3)检测的具体步骤步骤为：将解吸步骤所得离心上清液，用生活饮用水标准检验法中细菌总数的测定方法进行细菌培养，培养后的菌落进行计数，结果如表1。
解吸剂具体包括如下成分及其重量份：氯化钠1.0份、表面活性剂0.05份、磷酸氢二钠0.25份、磷酸二氢钾0.4份、d-氨基酸0.02份。上述表面活性剂中鼠李糖脂、吐温80和d-鼠李糖的质量比为1:12:0.05；d-氨基酸为d-苯丙氨酸。
其中，预处理和检测步骤中细菌检测是根据gb/t5750.12-2006中细菌总数的测定方法进行的。
对比例1：
一种纺锤水蚤体表附着细菌的检测方法，其解吸步骤用解吸剂具体包括如下成分及其重量份：氯化钠0.9份、表面活性剂0.04份、磷酸氢二钠0.18份、磷酸二氢钾0.3份、d-氨基酸0.015份。上述表面活性剂中吐温80和d-鼠李糖的质量比为12:0.04；d-氨基酸为质量比为1:0.25的d-酪氨酸和d-亮氨酸。其余步骤和实施例2完全一致，检测结果如表1。
对比例2：
一种纺锤水蚤体表附着细菌的检测方法，其解吸步骤用解吸剂具体包括如下成分及其重量份：氯化钠0.9份、表面活性剂0.04份、磷酸氢二钠0.18份、磷酸二氢钾0.3份、d-氨基酸0.015份。上述表面活性剂中鼠李糖脂和d-鼠李糖的质量比为12:0.04；d-氨基酸为质量比为1:0.25的d-酪氨酸和d-亮氨酸。其余步骤和实施例2完全一致，检测结果如表1。
对比例3：
一种纺锤水蚤体表附着细菌的检测方法，其解吸步骤用解吸剂具体包括如下成分及其重量份：氯化钠0.9份、表面活性剂0.04份、磷酸氢二钠0.18份、磷酸二氢钾0.3份、d-氨基酸0.015份。上述表面活性剂中鼠李糖脂、吐温80的质量比为1:11；d-氨基酸为质量比为1:0.25的d-酪氨酸和d-亮氨酸。其余步骤和实施例2完全一致，检测结果如表1。
对比例4：
一种纺锤水蚤体表附着细菌的检测方法，其解吸步骤用解吸剂具体包括如下成分及其重量份：氯化钠0.9份、表面活性剂0.04份、磷酸氢二钠0.18份、磷酸二氢钾0.3份。上述表面活性剂中鼠李糖脂、吐温80和d-鼠李糖的质量比为1:11:0.04。其余步骤和实施例2完全一致，检测结果如表1。
表1纺锤水蚤体表附着细菌的检测结果
对比表1的数据结果，可以发现本发明的方法所测得的剑水蚤体表附着的细菌总量明显大于对比例的检测法。本发明检测结果稳定，4次平行试验所得的数据比较接近，每次检测结果都相差30cfu/只以上。同时本发明用解吸剂中各有效成分间能发挥协同作用，在较少量作用的条件下即能使纺锤水蚤体表附着细菌实现解吸彻底、效率高的解吸。
本发明操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知，在此不进行赘述。
以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。