一种FLNB基因突变的ATDC5细胞模型的差异蛋白体系、筛选方法及应用与流程

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种flnb基因突变的atdc5细胞模型的差异蛋白体系、筛选方法及应用。

背景技术：

细丝蛋白b(filaminb，flnb)是一个大分子量二聚体的肌动蛋白(actin)结合蛋白，在细胞内起到骨架并和多种分子作用起到信号传导作用。

非随机性分布的细丝蛋白b基因(filaminb，flnb)错义突变位点可导致一组常染色体显性遗传、继发于骨发育不良(bonehypoplasia)的骨骼畸形疾病，包括larsen综合征(larsensyndrome，ls,omim150250)、骨发育不全症(atelosteogenesis，ao，ao-i,omim108720；ao-iii,omim108721)、回飞镖样骨发育不全症(boomerangdysplasia，bd,omim112310)。ls最主要的特征是腕骨或跗骨骨化中心增多，远端指骨变窄，大关节的脱位，脊柱畸形，以及诸如前额突起、眼距增宽和鼻梁塌陷等面部特征性畸形。bd是一种致死性骨发育不良疾病，其特征为肢体长骨、椎体及髋臼的发育不良，甚至是上述骨结构的缺损或完全缺失。几乎所有的bd患者在胎儿期或新生儿期死亡，因此给研究flnb基因突变在bd疾病中的分子生物学机制的研究增加了难度。ao-i和ao-iii两种疾病表现为ls及bd相叠加的表型。与上述这些flnb基因错义突变引起的常染色体显性遗传疾病相比，flnb基因的无义突变则可引起另外一种隐形遗传的骨骼畸形疾病，即脊柱-腕-跗骨融合症(spondylocarpotarsalsynostosissyndrome,sct,omim272460)，其典型表现为腕骨或跗骨的提前融合、及由椎体间融合导致的脊柱生长不平衡而进而引起的脊柱侧凸畸形。

据目前已有报道，flnb基因突变仅见于骨骼畸形疾病。这个事实表明flnb基因突变的致病性对骨组织有高度特异性。已有的研究表明flnb基因突变对骨骼畸形的致病性机理包括以下几点，即长骨生长板骨化延迟，软骨细胞的迁移能力下降以及软骨细胞的增殖、分化及凋亡过程的紊乱。然而，这些研究中大部分都集中在flnb基因无义突变导致的sct上，flnb基因的错义突变和flnb蛋白在骨骼畸形中的致病机理目前研究相对较少。

现针对flnb蛋白的研究主要集中在flnb基因变异导致其蛋白自身结构的改变及继发的分子生物学特性的改变，而对flnb和其他蛋白的相互作用，以及flnb基因的错义突变后，对各信号传导通路中相关蛋白的表达量的影响，则极少有研究。这为flnb基因的功能及其突变在相关疾病中的致病机理研究造成一定的困难。该领域的研究，迫切需要从整体上对flnb基因突变后，对细胞中其他蛋白的表达差异及信号传导通道的富集情况进行综合把握，进一步，为深入研究骨骼畸形疾病的致病机理以及筛选能够高分辨、高灵敏地确定生物标志物，具有良好的前景。

近年出现的全理论肽段序贯窗口获得技术，(swath，sequentialwindowacquisitionofalltheoreticalfragmentions)在数据提取方法上具有一定的先进性，是真正高通量、全景式的质谱技术。swath技术通过非指定目标数据分析(untargetedanalysis)，将整个质谱分为若干窗口并依次全部扫描并采集信息，实现基于自身样本肽段密集度(intensity)创建的谱图库进行蛋白定性确证、定量筛选及数据回溯。swath技术被许多学者运用于蛋白质组学研究，不仅能寻找目标蛋白的差异表达量，还可用于建立蛋白质间的相互作用关系(protein-proteininteractions,ppis)。此外，swath技术还被用于血、尿、分泌物及细胞组织等临床样本中的蛋白质测定，发挥了诊断意义。总体上看，swath技术对于大规模蛋白质筛选定量研究中能够高分辨、高灵敏地确定生物标志物，具有良好的前景。

技术实现要素：

为了解决上述问题，本发明的目的在于提供一种flnb基因突变的atdc5细胞模型的差异蛋白以及差异蛋白筛选方法及其应用。

本发明首先提供一种flnb基因突变的atdc5细胞模型的差异蛋白，所述蛋白为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶(nadhdehydrogenase)-1α亚基13，uniprot蛋白编号为：q9ers2；所述flnb基因突变的位点为c.512t>g(p.leu171arg)突变位点；所述flnb基因的c.512t>g(p.leu171arg)突变位点与bd疾病相关；所述蛋白与bd疾病相关。

优选的，所述烟酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶(nadhdehydrogenase)-1α亚基13在与bd疾病相关flnb基因突变的atdc5细胞中表达下调，所述flnb基因突变的位点为c.512t>g(p.leu171arg)突变位点。

进一步地，本发明提供所述烟酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶(nadhdehydrogenase)-1α亚基13及表达该蛋白的基因在制备检测bd疾病试剂盒或试剂中的应用。

优选的，所述试剂用于检测生物学样品中上述蛋白或基因的表达情况。

优选的，所述试剂盒包括检测蛋白或其基因表达情况的试剂盒。

进一步地，本发明还提供了一种flnb基因突变的atdc5细胞模型的差异蛋白筛选方法，包括以下步骤：

(1)将野生型flnb、含有突变位点c.512t>g(p.leu171arg)的flnb质粒分别转染至atdc5细胞中；建立flnb^wt组和flnb^l171r组；

(2)提取细胞样本蛋白，测定蛋白浓度；

(3)接着对纯化蛋白进行还原打开蛋白二硫键，并使用胰蛋白酶将蛋白酶切成多肽片段；

(4)多肽混合溶液经过lc-ms色谱质谱串联分析技术，对多肽片段进行分离和swath质谱分析；

(5)在获得所有肽段的全谱swath数据后，使用proteinpilot、peakview软件对质谱数据进行分析，筛选flnb^wt组和flnb^l171r组之间差异蛋白；

(6)经过生物信息学分析鉴定差异性蛋白并阐述差异性蛋白的生物学功能；

(7)最终筛选到与细胞凋亡信号通路相关的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶-1α亚基13。

优选的，所述步骤(5)中筛选差异蛋白的条件为选取2组样本间变化值超过2倍的蛋白，且成组t检验p值≤0.05的蛋白作为候选差异蛋白。

优选的，所述步骤(6)中生物信息学分析包括差异蛋白go富集分析和kegg信号通路富集分析。

国际标准化的基因功能分类体系geneontology(go)，包含三部分，分别描述相应基因的分子功能(molecμlarfunction，mf)、所处细胞器位置(cellμlarcomponent，cc)及生物学过程(biologicalprocess，bp)。go体系通过ncbi和geneontology数据库的信息，按照mf、cc和bp对蛋白进行分类和注释。通过对差异蛋白的go条目富集度进行统计学分析，并计算出p值，进而整体把握差异蛋白的功能。

kegg是有关蛋白质信号传导通路的主要公共数据库。通过对差异蛋白kegg信号传导通路的富集度进行统计学分析，并计算出p值，进而整体把握差异蛋白参与的最主要生化代谢途径和信号转导途径。

更进一步，本发明提供所述差异蛋白或所述的差异蛋白筛选方法在bd疾病的致病机理研究、药物筛选、以及防治产品中的应用。

优选的，所述产品包括试剂、试剂盒、药物及保健品。

本发明的有益效果：

本发明通过构建与bd疾病相关flnb基因突变(c.512t>g(p.leu171arg)的atdc5细胞模型，运用swath技术筛选分析flnb基因突变(与bd疾病相关的)的atdc5细胞和野生型flnb基因的atdc5细胞之间的差异表达蛋白，寻找早期诊断bd疾病的生物标记物及可能治疗的靶点，进一步为bd等骨骼畸形疾病的机制研究、药物筛选、预及治疗研究奠定了基础，提供的依据。

附图说明

图1各种转染质粒在细胞中的表达情况；其中，blank：未转任何质粒，只加转染试剂；wt：转染包含野生型flnb基因的质粒(pcr-flnb^wt-egfp质粒)；mut1：与bd疾病相关，转染包含c.512t>g(p.leu171arg)突变位点flnb基因的质粒，(pcr-flnb^l171r-egfp质粒)；mut2：转染包含c.4756g>a(p.gly1586arg)突变位点flnb基因的质粒，(pcr-flnbg1586r-egfp质粒)；

图2使用免疫荧光共聚焦显微镜观察atdc5细胞中flnb蛋白和肌动蛋白在胞浆中分布的情况。细胞核用hoechst染色进行标记。在flnb^wt质粒转染的细胞中，增强绿色荧光蛋白(egfp)标记的flnb蛋白均匀地分布在细胞浆中，其分布情况和肌动蛋白细胞骨架(使用鬼笔环肽标记)一致。在bd相关的flnb^l171r突变质粒转染的atdc5细胞中，可以观察到flnb突变蛋白和肌动蛋白在胞浆中的同一部位出现球形聚集现象。在ls相关的flnb^g1586r突变质粒转染的atdc5细胞中，并未发现明显的flnb蛋白和肌动蛋白的聚集现象。

图3通过流式细胞仪进行分析atdc5细胞的凋亡率。使用hoechst染色标记早期细胞凋亡，使用碘化丙啶(propidiumiodide，pi)染色标记晚期凋亡。表达flnb^l171r突变蛋白(与bd相关)的atdc5细胞，与表达空载体(a)、flnb^wt(b)和flnb^g1586r突变蛋白(与ls相关)(d)的atdc5细胞相比，表现为显著增高的凋亡率(c)。(e)不同细胞体系中的凋亡比例直方图。重复三次实验，用t-检验进行统计学分析。所有数值和空载质粒(emptyvector)组相比。ns:无统计学差异(notsignificant)；***：p值<0.001；**：p值<0.01；*：p值<0.05。误差线(errorbars)代表标准差(standarddeviation，sd)。wt：wildtype，野生型；bd：boomerangdysplasia，回飞镖样骨发育不良；ls：larsensyndrome，larsen综合征。

图4使用transwell实验检测分别转染空载体、flnb^wt、flnb^l171r和flnb^g1586r质粒的atdc5细胞迁移能力。通过小室间半透膜的细胞附着在下室侧的表面，使用4％多聚甲醛进行固定，并使用dapi染色标记细胞核。为了实现定量研究，对随机选取的四个视野进行细胞计数。与表达空载体(a)、flnb^wt(b)和flnb^l171r(与bd相关)的atdc5细胞相比，表达flnb^g1586r突变蛋白(与ls相关)的atdc5细胞表现为细胞迁移能力的明显下降(d)。(e)不同细胞体系中的细胞迁移能力直方图。重复三次实验，用t-检验进行统计学分析。所有数值和空载质粒(emptyvector)组相比。ns:无统计学差异(notsignificant)；***：p值<0.001；**：p值<0.01；*：p值<0.05。误差线(errorbars)代表标准差(standarddeviation，sd)。

图5使用westernblotting技术，研究分别表达空载体、flnb^wt、flnb^l171r(与bd相关)及flnb^g1586r(与ls相关)的atdc5细胞中，不同分子标志物的表达情况。不同蛋白的表达水平以gapdh作为内参。重复三次实验，用t-检验进行统计学分析。所有数值和空载质粒(emptyvector)组相比。ns:无统计学差异(notsignificant)；***：p值<0.001；**：p值<0.01；*：p值<0.05。误差线(errorbars)代表标准差(standarddeviation，sd)。

图6在atdc5细胞中，mut1vs.wt富集到的go功能条目的情况；

图7atdc5细胞中，mut1组和wt组对比，富集到的kegg信号传导通路条目。其中所列的9条信号传导通路，富集程度的p值均小于0.05。然而，所涉及的信号通路和本研究无直接相关性；

图8westernblotting检测flnb^wt、与bd相关flnb^l171r的atdc5细胞中ndufa13表达情况；重复三次实验，用t-检验进行统计学分析。p值<0.05。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用的试剂可以商业购买得到。

本发明首先检测了ls和bd相关的flnb突变基因是否在细胞层面及分子生物学水平存在差异。选择c.4756g>a(p.gly1586arg)突变为ls疾病相关的目标研究基因，除了本研究报道之外，前人也报道过此位点，也研究过具有相同突变位点的ls病例；选择c.512t>g(p.leu171arg)突变为bd疾病相关的目标研究基因，这是目前被研究最多的bd相关flnb基因突变。通过构建上述两个突变位点的flnb质粒转染的atdc5细胞系，发明人模拟软骨内成骨，并比较两种疾病相关的突变位点对细胞形态、胞浆中蛋白分布、细胞迁移、凋亡及runx2与smad3等相关分子标志物表达的影响。本研究中的分子层面及细胞层面的实验结果，为解释ls和bd两种疾病间的表型差异提供了合理的证据链。

进一步，使用swath技术对flnb基因突变(与bd相关c.512t>g(p.leu171arg)突变)和野生型flnb转染的atdc5细胞内蛋白质组学的研究，找出和细胞行为相关的蛋白富集的差异度，为这种突变在相关疾病的致病性挖掘新的研究方向。

本发明实施例中，术语为以下含义：

术语wt：wildtype，野生型；

术语ls：larsensyndrome，larsen综合征；

术语bd：boomerangdysplasia，回飞镖样骨发育不良。

本发明烟酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶(nadhdehydrogenase)-1α亚基13，uniprot蛋白编号为：q9ers2，所述表达该蛋白的基因为ndufa13。

实施例1构建ls和bd两种疾病相关的flnb基因突变的细胞模型

本实施例中主要实验材料如下：

atdc5细胞：atcc；dmem培养基、链霉素/青霉素双抗溶液：usa,gibocompany；胎牛血清(fcs)：usa,invitrogencompany；0.25％胰酶+0.02％edta：usa,sigmacompany；top10高效率感受态细胞、无缝克隆mix：海创科业自制；pcr引物：擎科公司；去内毒素质粒中提试剂盒、dna凝胶回收试剂盒：天根；bca蛋白定量试剂盒、ripa裂解液：china,beijingsolarbio；anti-flnb：uk,abcam；抗-鼠igg(1:1000；catno.14079,cst)。

1.1质粒构建

在flnb全长dna(参考序列号：nm_001457.3)的5’端组装增强绿色荧光蛋白(enhancedgreenfluorescenceprotein,egfp)并在pcr3.1(-)载体(invitrogen,carlsbad,ca)上表达，所述构建方法参照《danielpb,morgant,alanayy,etal.disease-associatedmutationsintheactin-bindingdomainoffilaminbcausecytoplasmicfocalaccumulationscorrelatingwithdiseaseseverity[j].humanmutation,2012,33(4):665–673.》。对ls相关的突变位点c.4756g>a(p.gly1586arg)和bd相关的突变位点c.512t>g(p.leu171arg),通过正向及反向引物，实现pcr突变形成(mutagenesis)以实现单核苷酸突变。形成的突变产物通过sanger测序法进行验证，所述sanger测序由北京华大基因公司完成。

具体突变方法如下：

(1)采用同源重组方法分别设计突变引物

flnb-g4756a-f:acaagactaggcgctatatgattggagtcacc,seqidno:1；

flnb-g4756a-r:atagcgcctagtcttgtcggggatgtaggtga,seqidno:2；

flnb-t512g-f:aagacggcaaagcccggggagccctggtagacagct,seqidno:3；

flnb-t512g-r:ccgggctttgccgtcttgccagttctggttaa,seqidno:4；

(2)pcr扩增

分别用2对引物扩增flnb野生型质粒，扩增体系与条件均一样。

用东洋纺公司kod-neo-plus扩增试剂盒扩增，体系条件如下：

pcr反应体系：

pcr反应条件：

1％琼脂糖凝胶分别回收上述pcr产物。

(3)重组反应并转化

(3.1)重组体系如下:

混匀后55℃连续反应30min。反应结束后立即将重组反应液冰浴5min。

(3.2)转化

在重组好的产物中加入50μltop10感受态细胞，混匀42℃热激60s，冰水浴120s，将转化好的混合物均匀地涂在含有氨苄抗性的lb平板中37℃过夜培养。

(3.3)阳性克隆筛选与鉴定

挑取单克隆进行pcr鉴定反应：

鉴定引物:

flnb-cx-2f:gctggggacactattcctaaga，seqidno:5；

flnb-cx-2r:ccctgttttccagcccattgag，seqidno:6；

(3.4)将阳性克隆送至北京擎科公司测序显示flnb野生型质粒突变成功。

1.2转染

atdc5细胞在含有10％胎牛血清的(fetalbovineserum,fbs)dmem培养液中培养，环境为37℃，5％co2。在转染之前，将培养液更换为无抗生素的培养液。

使用jetprime转染试剂(polyplus),并按照试剂说明将空载体、野生型flnb、含有突变位点c.4756g>a(p.gly1586arg)的flnb及含有突变位点c.512t>g(p.leu171arg)的flnb分别转染至atdc5细胞中；培养48小时后收集细胞。

1.3westernblot细胞内相关蛋白表达情况

取上述部分细胞，提取总蛋白进行westernblot验证细胞内相关蛋白表达情况；所述westernblot实验具体步骤：消化细胞并制备单细胞悬液，离心后，弃除上清液，用pbs液重新吹散。在磷酸化酶抑制剂及蛋白酶抑制剂的保护下，使用ripa缓冲液分解细胞，4℃维持30min后用8,000rpm转速离心15min。使用蛋白定量试剂盒(bca)对裂解的蛋白质进行定量，等量的蛋白(12μg)在12％凝胶(sds-page)中进行电泳分离，并转至聚偏二氟乙烯(polyvinylidenefluoride，pvdf)膜(milliporecorporation)上。在tbst(tris-bufferedsaline-tween)中，使用5％牛奶对pvdf膜进行封闭1小时,随后在bsa/tbst稀释的3％一抗中轻柔摇晃孵化，维持4℃过夜。次日用pbs液清洗三次，在室温中用二抗对pvdf膜孵化1h，随后用增强化学荧光(enhancedchemiluminescence，ecl)试剂盒(millipore)及自动化学荧光曝光系统(tanon4200)对目标蛋白进行检测。

结果：从图1中可以看出各种转染质粒在细胞中的表达情况；其中，blank：未转任何质粒，只加转染试剂；wt：转染包含野生型flnb基因的质粒(pcr-flnb^wt-egfp质粒)；mut1：转染包含flnb基因c.512t>g(p.leu171arg)突变位点的质粒，(pcr-flnb^l171r-egfp质粒)；mut2：转染包含c.4756g>a(p.gly1586arg)突变位点flnb基因的质粒，(pcr-flnb^g1586r-egfp质粒)；marker：neb-proteinladder(p7711s)。

实施例2检测ls和bd疾病相关的flnb基因突变对细胞功能的影响

本实施例中主要试剂如下：

倒置荧光显微镜：japan,nikoneclipse；transwell小室：usa,corningcompany；流式细胞仪：beckmancoμlter(cytomicsfc500)；hoechst：germany,agcompany；鬼笔环肽(phalloidin)：usa,invitrogencompany；碘化丙啶：china,best-reagentcompany。

1.免疫荧光检测

使用4％的多聚甲醛固定上述转染后的细胞5min，随后使用pbs液清洗，并使用0.5μg/ml的hoechst试剂对细胞核进行染色30min，使用鬼笔环肽(phalloidin)对肌动蛋白(actin)细胞骨架进行染色；使用倒置荧光显微镜(nikon)观察细胞。使用20ms的uv路径对hoechst染色曝光，使用波长488nm、时长100ms的激光对egfp进行曝光，使用波长590nm、时长1s的激光对鬼笔环肽进行曝光。

2.细胞凋亡

转染48小时后，涡旋振荡5s，制备单细胞悬液，加入1mg/ml的hoechst，维持37℃水浴7min，进行细胞核染色。随后冰上冷却单细胞悬液，并离心，弃除上清液后用pbs液将细胞沉淀重新吹散。将单细胞悬液配置于5mg/ml碘化丙啶(propidiumiodide，pi)，维持37℃水浴7min，继续进行细胞核染色。随后冰上冷却单细胞悬液，并离心，弃除上清液后用pbs液将细胞沉淀重新吹散，在流式细胞仪上，捕获波长在400-500nm之间的蓝色荧光和波长为630nm的红色荧光。hoechst染色的细胞核代表早期凋亡的细胞，pi染色的细胞核代表晚期凋亡的细胞。

3.细胞迁移

转染48小时后，消化细胞并制备单细胞悬液，离心后，弃除上清液，用pbs液重新吹散，选取其中40,000个(100μl)细胞添加到transwell的上室，添加600μl含有10％胎牛血清的dmem培养液到下室。37℃，5％co2环境下静置24小时候，用4％多聚甲醛固定细胞，并轻柔刮除上室细胞，对下室细胞进行dapi染色。荧光显微镜下，使用20x光镜对每个小室随机选取5个视野。使用计数软件对每个视野进行细胞计数，每个小室重复三次实验，并用t-检验进行组间比较。

4.westernblot

使用westernblotting技术检测骨化过程中的标志性分子runx2、psmad3、smad3表达情况。所述westernblotting检测方法同实施例1。使用image-j软件对蛋白条带强度灰度值进行定量。一抗：anti-runx2(1:1000；catno.ab23981,abcam),anti-psmad3(磷酸化位点t179)(1:500；catno.ab193297,abcam),anti-psmad3(磷酸化位点：s423+s425)(1:1000；catno.ab52903,abcam),anti-smad3(1:3000；catno.ab75512,abcam),andanti-gapdh(1:1000；catno.sc-25778,santacruz)。二抗：抗-兔igg(1:1000；catno.14708,cst)或抗-鼠igg(1:1000；catno.14079,cst)。重复三次实验，并用t-检验进行组间比较。

5.结果

发明人通过免疫荧光学检测，发现在flnb^g1586r突变质粒转染的细胞中，并未发现明显的flnb蛋白和肌动蛋白的聚集现象，细胞形态表现为细胞变圆、变小，且细胞的伪足更少；在flnb^l171r突变质粒转染的细胞中，可以观察到flnb突变蛋白和肌动蛋白在胞浆中的同一部位出现球形聚集现象，细胞体积的显著缩小，细胞的板状足(lamellipodia)更为减少(图2)。

通过细胞凋亡实验检测，发现flnb^l171r突变质粒转染的细胞凋亡率显著增高，无论是早期凋亡率还是晚期凋亡率都显高于flnb^wt和flnb^g1586r转染的细胞(图3)。

通过细胞迁移实验，发现flnb^g1586r与flnb^wt及flnb^l171r突变质粒转染的细胞相比，表现为显著降低的细胞迁移能力(图4)；

使用westernblotting技术检测骨化过程中的标志性分子。发现骨化过程中runx2的表达量在转染flnb^l171r和flnb^g1586r突变质粒的atdc5细胞中都明显上升；此外，磷酸化的smad3(磷酸化位点:t179和s423/s425)在转染flnb^l171r和flnb^g1586r突变质粒的atdc5中都显著增高，而smad3的总体表达量并无改变(图5)。

与表达flnb^wt蛋白的atdc5细胞相比，表达flnb^l171r和flnb^g1586r蛋白的atdc5细胞表现为明显的细胞形态改变。表达flnb^l171r蛋白的atdc5细胞表现为细胞体积的明显缩小，板状足(lamellipodia)消失，这可能归因于flnb^l171r与肌动蛋白的球形凝聚导致的肌动蛋白骨架的损坏。flnb蛋白第171位点的氨基酸处于肌动蛋白结合区域(abd)。前人通过在体内(invivo)及体外(invitro)实验，研究表明首次发现flnb蛋白abd区域的错义突变导致flnb对肌动蛋白的结合力增强。肌动蛋白骨架蛋白对细胞结构提供机械性支撑，在维持细胞形态过程中起重要作用，对多数细胞的存活起着决定性作用。表达flnb^g1586r蛋白的atdc5细胞在细胞形态上出现变化，但未出现显著变化，说明其胞浆内的肌动蛋白结构改变不大。flnb蛋白第1586位点的氨基酸靠近hinge-1区域。细丝蛋白的hinge-1区域是一个具有一定柔韧性的结构域，连接细丝蛋白内两个重要的功能域，如果将其敲除可改变细丝蛋白的机械传感特性。表达flnb^g1586r蛋白的atdc5细胞的形态学改变可能归因于hinge-1附近结构的性状改变，而不是因为flnb^g1586r蛋白和肌动蛋白之间亲和力的改变。前人的研究显示，flna蛋白中hinge-1下游的结构域可能涉及机械力学及信号传导的改变。因此，我们提出flnb蛋白的hinge-1结构也具有类似的特性，它的改变也可能改变下游信号传导通路。总之，flnb^l171r蛋白引起的肌动蛋白骨架改变和flnb^g1586r蛋白引起的下游信号传导通路的改变，都可能是导致软骨内成骨过程中细胞形态改变的原因，它们也可能导致细胞的迁移能力及凋亡率的改变。

发明人认为ls和bd两种疾病之间的表型差异主要归因于软骨内成骨的软骨细胞的凋亡率差异。肌动蛋白骨架对细胞的存活起着决定性作用。表达flnb^l171r蛋白的atdc5细胞凋亡率显著增高，伴有肌动蛋白细胞骨架的损坏，而表达flnb^g1586r蛋白的atdc5细胞的凋亡率无明显改变，与其胞浆内的肌动蛋白细胞骨架受到的影响较小相符合。发明人认为正是过度的细胞凋亡导致了flnb^l171r引起的bd患者出现长骨的缺失。在脊椎动物中，包括长骨和脊椎骨在内的骨骼生长发育通过软骨内成骨进行，而这一过程历经间充质干细胞的聚集到软骨细胞的分化及矿化。聚集的间充质干细胞可以分化为软骨细胞。一旦细胞外基质(ecm)出现矿化以及软骨细胞进入终末肥大期，软骨细胞即出现凋亡，软骨结构也转变为骨结构。在软骨内成骨的任何一个阶段，软骨细胞的凋亡受到干扰都会影响软骨内成骨。未经诱导的atdc5细胞，在聚集之前具有间充质干细胞的特性。因此，表达flnb^l171r突变蛋白的atdc5细胞出现凋亡率显著增高的这一现象，使发明人有理由考虑bd患者出现的致死性骨骼发育低下或长骨的骨化中心缺失与软骨生长板中间充质干细胞的大量凋亡进而干扰骨化中心骨化有关。在表达flnb^g1586r突变蛋白的atdc5细胞中，发明人并未观察到显著改变的细胞凋亡率。这一实验结果和flnb^g1586r相关的ls的临床表型相吻合，即ls患者的骨骼系统发育低下的严重程度远低于bd患者。

ls疾病中的骨化中心增多与bd疾病中骨化中心减少这两种截然相反的临床表型的分子生物学机制，发明人认为可能通过软骨内成骨起始期的间充质干细胞凋亡、迁移及runx2蛋白的表达变化之间的相互制衡实现。在ls中，runx2的增高可能促进间充质干细胞的聚集，而细胞迁移能力的下降与runx2增高的促细胞聚集可一起导致骨化中心的增多。在bd中，虽然runx2的表达也出现增高，但更为显著的细胞凋亡率抑制了runx2对细胞聚集的促进作用，因此导致了骨化中心的减少甚至缺失。

runx2，曾被称为core-bindingfactor(cbf)在骨形成过程中发挥重要作用。(merrimanetal.,1995；satoetal.,1998)在zheng等人的研究中，他们发现对于正常的细胞，smad3可以和flnb蛋白相结合，进而flnb蛋白阻止了smad3蛋白的磷酸化；然而，游离性smad3蛋白可以被磷酸化，更多的磷酸化smad3蛋白可进入细胞核，和hdac4蛋白及runx2形成蛋白复合体；在这种情况下，runx2的活性被hdac4蛋白所抑制。在发明人前期的研究中，磷酸化smad3的表达量明显升高，而smad3蛋白总量维持正常水平。这表明，尽管runx2的表达量升高，其活性仍可能被增多的磷酸化smad3蛋白所抑制，进而导致软骨内成骨过程受到抑制。

基于上述，发明人提出flnb不同位点的错义突变通过其对细胞形态、凋亡、迁移及下游的信号传导通路等作用之间的相互制衡，导致彼此间互不相同的骨骼系统畸形的表型。

实施例3swath技术对转染不同flnb基因变异质粒的atdc5细胞进行蛋白质组学研究

1、实验材料

1.1实验样本

atdc5细胞样本制备同实施例1；并按照swath技术要求的条件，将实验样本按如下情况进行分组：

atdc5细胞样本信息如表1所示：将atdc5细胞样本分为无转染组、野生型flnb质粒转染组(wt)、c.512t>g(p.leu171arg)flnb突变质粒转染组(mut1)；每一组细胞又随机培养3份，作为组内对照。

表1

1.2实验试剂

尿素：usa，bio-radcompany；色谱级乙腈：usa，abicompany；tris：usa，usbcompany；二硫苏糖醇(dtt)：usa，bio-radcompany；氨水：usa，sigma-aldrichcompany；碘乙酰胺(iaa)：usa，bio-radcompany；考马斯亮蓝r-250：usa，thermofisherscientificcompany；甲酸(fa)：usa，sigma-aldrichcompany；质谱级胰蛋白酶：usa，promegacompany；多肽定量试剂盒：usa，thermofisherscientificcompany；蛋白marker：usa，thermofisherscientificcompany；去离子水：usa，miliporecompany；硫脲：usa，sigma-aldrich；盐酸：china，beijingchemistryfactory；proteaseinhibitorcocktail：usa，rochecompany；chaps：usa，bio-radcompany；

1.3实验耗材

1.5ml、2ml、50ml离心管：usa，bioradcompany；10kd超滤管：usa，miliporecompany；ziptipc18萃取柱：usa，miliporecompany；96孔酶标板：usa，corningcompany；

1.4实验仪器

移液器(可调量程)：usa，thermofisherscientificcompany；分析天平：beijing，sartoriouscompany；超低温冰箱：usa，thermofisherscientificcompany；ph计：sweden，mettlertoledocompany；超速离心机：usa，thermofisherscientificcompany；酶标仪(synogen4)：usa，thermocompany；涡旋振荡器：china,haimenkylin-belllabinstrumentcompany；电泳仪(powerpac1000)：usa，bioradcompany；电泳槽：usa，invitrogencompany；恒温水浴锅：shanghai,pudongrongfengscientificinstrumentcompany；脱色摇床：beijing，beijinginstituteofnewtechnologyapplication；高效液相色谱(rigoll-3000)：beijing,rigolcompany；真空干燥仪：usa，thermocompany；质谱仪：ab5600plus，usa，absciexcompany；

1.5试剂配制

1)裂解液

称取2m硫脲、7m尿素、0.1％chaps及蛋白酶抑制剂(proteaseinhibitorcocktail)1片，放置于50ml离心管中，使用去离子水定容至50ml。

2)1mdtt

称取0.154gdtt，加1mlnh4hco3(25mm)振荡溶解，静置于-20℃。

3)1miaa

称取0.185giaa，加1mlnh4hco3(25mm)，振荡溶解，避光，现用现配。

4)0.5μg/μl胰蛋白酶溶液

取20μg胰蛋白酶，加40μl去离子水，振荡溶解，每份10μl分装，静置于-80℃。

5)0.1％fa

取50μlfa(100％)，加50ml去离子水，振荡溶解，室温保存。

6)10％过硫酸胺

称取1g过硫酸胺，加去离子水，定容至10ml，每份1ml分装，静置保存于-20℃保。

7)10％sds

称取10gsds，加去离子水，定容至100ml，整装室温保存。

8)1.5mtris-hcl(ph8.8)

称取181.5gtris，加去离子水800ml；浓盐酸ph值调至8.8，加去离子水，定容至1l，整装室温贮存。

9)1.0mtris-hc1(ph6.8)

称取121gtris，加去离子水800ml，用浓盐酸将ph值调至6.8，加去离子水，定容至1l，整装室温贮存。

10)4×loadingbuffer

取2mltris-cl(ph6.8，1m)，称取0.8gsds，0.04g溴酚蓝，0.62gdtt，4ml甘油，加去离子水，定容至10ml，1ml分装，-20℃静置保存。

11)10×电泳缓冲液：

称取60.4gtris碱，20gsds，288.24g甘氨酸，加去离子水，定容至2l，整装室温贮存。

12)考染脱色液

475ml乙醇，160ml乙酸，加去离子水，定容至2l，整装室温保存。

13)r-250考染染液配方

称取1g考马斯亮蓝染料(r-250)，加脱色液1l，轻柔混匀，过滤后方可染色。

2、实验方法

2.1提取样本蛋白

1)按照1:10(w/v)配比，将样本加入裂解液，振荡混匀。

2)加钢珠至样本管中，置于组织研磨仪中获取匀浆，静置于冰上30min。

3)以13000rpm转速、4℃温度，离心15min，吸取上清并分装，-80℃冰箱冻存。

2.2测定蛋白浓度(bradford法)

1)用裂解液将2μg/μlbsa配制成bsa标准品溶液，浓度梯度为：0μg/μl、0.025μg/μl、0.125μg/μl、0.25μg/μl、0.5μg/μl、0.75μg/μl、1μg/μl及1.5μg/μl。

2)取96孔板，分别向每孔加入10μl不同的浓度的蛋白样品或标准品溶液，同一样品加入3个平行复孔。

3)再分别向每孔加入300μlbradford，静置反应5-10min，避光。

4)酶标仪测定波长为595nm处的吸光度。

5)依据标准品浓度及其对应的吸光度制作浓度/吸光度标准曲线，推导出依据吸光度推算蛋白浓度的公式，算出各样品蛋白的浓度。

2.3膜辅助溶液内蛋白酶切

从每一样品提取蛋白50μg，酶切后予以ida建库；随后，从每一样品提取蛋白100μg，单独酶切后作为swath样本。

1)蛋白质的还原：

将样品加入超滤管(10kd)中，按溶液总体积/dtt体积值为40:1的标准，加入1mdtt，至dtt的终浓度为25mm。振荡混匀，于37℃水浴锅中水浴1小时，室温静置冷却。

2)蛋白质烷基化：

按溶液总体积/iaa(1m)体积比为20:1的标准，将还原后的样品加入iaa(1m)，至iaa的终浓度为50mm，振荡混匀，室温静置30min，避光。

3)清洗样品：

加入teab300μl(5倍稀释)，以12,000rpm的转速离心10min，弃除收集管底部溶液，重复3次，再加入300μlteab(2倍稀释)，以12,000rpm转速离心10min。

4)膜辅助溶液内酶切蛋白：

在超滤管中加入总量为2μg的胰蛋白酶，与蛋白质的质量比为1:50，体积50μl，37℃静置反应，过夜。

5)多肽的收集：

次日，加入100μlteab(2倍稀释)，以12,000rpm转速离心10min，3次重复，收集管底部为酶解消化后的肽段。将其真空抽干，冻存于-20℃冰箱备用。

2.4高ph反相c18色谱分离

1)将用于ida建库的多肽混合样品重溶于a液(2％乙腈，98％ddh2o，氨水ph调至10.0)中。

2)经离线高效液相色谱柱(peptidebehc18,3.5μm，4.6㎜×150㎜)分离。所用的洗脱缓冲液b1液为98.0％的乙腈及2.0％的去离子水(ph10.0)，分离梯度见表2。设置1ml/min流速，分离51min。

表2高ph反相色谱梯度

3)每隔1min，收集一管分离组分，合计40个分离组分。按照1、11、21、31；2、12、22、32；3、13、23、33；4、14、24、34；……10、20、30、40的梯度顺序将样品合并为10管组分。

4)将10管组分置于干燥仪中，旋转真空干燥，冻存于-20℃冰箱备用。

2.5ziptipc18固相萃取

1)活化c18固相萃取柱：吸取10μlacn(100％)，吹打均匀，重复2次。

2)平衡c18固相萃取柱：吸取10μlacn(2％)及fa(0.1％)，清洗萃取柱中残留的acn，重复吹打2次。

3)上样：反复吸取和吹打制备好的多肽溶液，重复10次以上。

4)清洗脱盐：吸取10μlacn(2％)及fa(0.1％)，重复5次清洗样品中的盐。

5)洗脱：吸取10μlacn(2％)及fa(0.1％)，反复吹打10次，用ep管收集洗脱液。重复1遍洗脱、合并洗脱液。

6)将洗脱液置于干燥仪中，在常温条件下，旋转真空抽干后，冻存于-80℃冰箱备用。

2.6lc-ms/ms分析

1)将多肽重溶于20μlfa(0.1％)中。

2)历经eksigent425液相、碱性c18反相色谱柱(0.3×150mm,3μm)分离后，a相为2％acn0.1％fa和98％h2o和，b相为2％h2o0.1％fa和98％acn，流速为5μl/min，总洗脱时间为70min。液相条件如表3：

表3低ph反相色谱梯度

3)高灵敏度模式下，使用质谱仪(ab5600plus)分析鉴定多肽混合物，扫描时间90min。质谱耐受(masstolerance)为50mda,聚集事件(accumμlationtime)为250ms,source温度为300度，循环周期时间(periodcycletime)为1801ms，扫描范围为350-1250m/z。

2.7ida数据分析

1)使用proteinpilot软件对所得质谱数据，分别采用人源、鼠源swiss-protirt数据库进行检索。

2)计算swath窗口的大小。

2.8swath质谱检测

1)按8μg/样提取多肽，重溶于8μlfa溶液(0.1％)中，与0.4μlirt试剂混匀。

2)历经eksigent425液相、c18毛细管色谱(0.3×150mm,3μm)分离，液相条件如2.6中所述。

3)设定质谱窗口标准为：90min扫描时间，每个循环包括1次一级全扫描以及60次二级窗口扫描。

2.9swath搜库

1)使用peakview软件中的swath插件，导入ida结果，首先建立谱图库。

2)随后导入swath数据，使其与谱图库中的数据相互匹配。

3)通过高可信度的肽段图谱进行定量分析，要求肽段可信度(confidence)>95％，且假发现率(falsediscoverrate)<1.0％，二级母离子提取的质量差为75ppm，色谱时间窗口为5min。

3.质量控制

在两个方面做好质控保障：

3.1质谱总离子流图(totalionchromatogram,tic)一致性评估：从每个样本质谱采集的tic图的一致性来评估。tic图的保留时间、质谱峰形、信号强度越一致，定量越准确。

3.2平行性质控：使用swath自带软件，对蛋白样本定量强度进行归一化平行质控。归一化后的中位数应该处于一个水平线。

4.差异蛋白的筛选

根据综合变化倍数、统计学显著性等选取差异候选蛋白，其标准为，选取2组样本间变化值超过2倍的蛋白(即log2(蛋白强度)相差＞1)，且成组t检验p值≤0.05的蛋白作为候选差异蛋白。

5.pca分析

通过pca降维分析，进而检测组间差异性及组内重复性。重复性较好的实验，同组内不同样本应相对集中，且可与其他组数据聚集区域区分开。pca分析显示mut1_1、mut1_2和mut1_3所处的区域相对集中，说明mut1组的组内差异较小，实验重复性好。

6.功能分析

6.1差异蛋白go富集分析

本发明通过ncbi和geneontology数据库的信息，按照分子功能、所处细胞位置、生物学过程等对蛋白进行分类和注释。通过对差异蛋白的go条目富集度进行统计学分析，并计算出p值，进而整体把握差异蛋白的功能。

6.2差异蛋白kegg信号通路富集分析

通过对差异蛋白的kegg信号传导通路的富集度进行统计学分析，并计算出p值，进而整体把握差异蛋白所参与的信号传导通路。

7.结果

采用swath技术分析比较mut1组和wt组的差异蛋白，共鉴定出73个差异蛋白，其中上调表达的蛋白为34个，下调表达的蛋白为39个。

对mut1组vs.wt组所得的73个差异蛋白进行go注释分析可知：这些差异蛋白主要来源于线粒体等细胞成分；分子功能主要为酶活性、结合活性等(图6)；主要参与氧化还原反应(oxidationreactionprocess)、凋亡信号传导通路(apoptosissignalpathway)等生物过程(图7)。

其中，生物学过程功能条目中凋亡信号传导通路与本研究相关性较大，富集倍数为12.49，且p值小于0.05。通过检索文献，选取和本研究相关的差异蛋白：烟酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶(nadhdehydrogenase)-1α亚基13，uniprot蛋白编号为：q9ers2，所述蛋白在mut1组中表达显著下调。该蛋白亚基组成线粒体膜呼吸链，但并不涉及分解代谢，参与干扰素/全反式视黄酸(interferon/all-trans-retinoicacid，ifn/ra)诱导的细胞死亡。尽管该蛋白和flnb的具体关系尚无文献报道，但前人报道线粒体形态和相关功能在软骨内成骨过程中发挥着重要作用。因此，该蛋白在flnb基因突变引起的致病机理方面，可能值得进行更深入研究。

实施例4westernblotting验证烟酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶(nadhdehydrogenase)-1α亚基13的表达情况

使用westernblotting检测野生型flnb(flnb^wt)及与bd相关的flnb^l171r质粒转染的atdc5细胞中烟酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶(nadhdehydrogenase)-1α亚基13表达情况，所述westernblotting技术参照实施例1，以gapdh作为内参。

一抗:catno.ab134325,abcam；二抗:抗-兔igg,catno.14708,cst；

结果显示如图8所示，与flnb^wt相比，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶(nadhdehydrogenase)-1α亚基13的表达量在转染flnb^l171r突变质粒的atdc5细胞中明显下调。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110>中国医学科学院北京协和医院

<120>一种flnb基因突变的atdc5细胞模型的差异蛋白体系、筛选方法及应用

<130>p18020

<160>6

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>32

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

acaagactaggcgctatatgattggagtcacc32

<210>2

<211>32

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

atagcgcctagtcttgtcggggatgtaggtga32

<210>3

<211>36

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

aagacggcaaagcccggggagccctggtagacagct36

<210>4

<211>32

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

ccgggctttgccgtcttgccagttctggttaa32

<210>5

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>5

gctggggacactattcctaaga22

<210>6

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>6

ccctgttttccagcccattgag22