本发明属于医药合成领域，具体涉及一种制备利拉鲁肽的方法。
背景技术：
利拉鲁肽，英文名liraglutide，是一种胰高血糖素样肽-1(glp-1)类似物，序列为h-his-ala-glu-gly-thr-phe-thr-ser-asp-val-ser-ser-tyr-leu-glu-gly-gln-ala-ala-lys(nα-pal-γ-glu)-glu-phe-ile-ala-trp-leu-val-arg-gly-arg-gly-oh，分子式：c172h265n43o51，作为一种皮下注射制剂，能起到良好的降低血糖作用，能够通过降低2型糖尿病患者的空腹及餐后血糖而改善血糖控制，同时能够降低患者体重。
目前利拉鲁肽的合成方法如专利cn103087181、专利cn102286092、专利cn103145828、文献j.med.chem.2000，43，1664-1669、文献chin.j.org.chem.2016，36，218-221和文献chinesejournalofpharmaceuticals2013，44(2)，121-124是利用fmoc策略固相法依次连接合成利拉鲁肽主链多肽，然后脱去lys侧链保护基，修饰lys侧链氨基得到利拉鲁肽肽树脂。该方法依次合成利拉鲁肽主链时，容易产生与利拉鲁肽极性相近的残缺肽，导致纯化困难。再者，此方法在利拉鲁肽主链合成完毕再修饰lys侧链氨基，由于lys侧链的高空间位阻，容易导致反应不完全或过反应，产生缺陷肽，总收率较低，同时杂质较多，纯化困难。
专利cn102875665、专利cn104045705和专利cn103864918采用固相片段缩合的方法合成，固相片段缩合投入的每个片段都是1.5～3.5倍过量，严重浪费肽片段，合成成本很高；同时由于固相片段缩合的树脂取代值限制，物料通量降低，浪费溶剂，产生大量废液。
专利cn103275208和专利cn103304659首先合成多肽片段，再按照利拉鲁肽的氨基酸序列逐步偶联剩余氨基酸制得利拉鲁肽肽树脂，修饰lys侧链氨基是在利拉鲁肽肽树脂上进行，易导致反应不完全或过反应，产生缺陷肽，总收率较低，同时杂质较多，纯化困难，且专利cn103304659合成的多肽片段序列过长，还存在溶解困难、难以耦合的问题。
专利cn104650219采用液相片段缩合的方法合成全保护利拉鲁肽主链多肽，然后在液相反应体系中经历四步反应得到全保护利拉鲁肽粗品，后处理繁琐，不利于工业化生产，并且lys侧链氨基的修饰在全保护利拉鲁肽主链多肽上进行，空间位阻大、溶解度低、反应困难，容易产生缺陷肽，造成物料浪费。
专利cn103980358首先通过液相合成片段fmoc-lys(glu(nα-palmitoyl)-otbu)-oh，然后采用固相合成法逐个耦合氨基酸制备利拉鲁肽，无需在利拉鲁肽主链上修饰lys侧链氨基。但该方法偶联使用的fmoc-lys(glu(nα-palmitoyl)-otbu)-oh量较大，成本较高，且偶联反应时肽链较长，位阻大，难偶联；该方法第17位gln难偶联，易产生-gln多肽杂质，单一杂质含量高。
cn107880111公开了首先通过fmoc固相法将glu侧链羧基支载到羟基类型树脂上得到fmoc-glu(resin)-oall氨基酸树脂、与fmoc-lys(pg1)-oh偶联，再通过多步偶联反应至利拉鲁肽n端his，在钯催化体系下脱除保护基all后，在活化剂系统存在下与利拉鲁肽c端的10肽片段偶联得利拉鲁肽肽树脂。该方法容易使利拉鲁肽中引入钯金属，且存在片段过长难溶解、偶联效率低的问题。
其他专利公开了基因重组生产利拉鲁肽，然而基因表达有着工作量大、三废严重、技术难度大、生产成本高等缺点。
技术实现要素：
针对以上问题，本发明提供了一种制备利拉鲁肽的方法，先通过fmoc-glu-2-phenylisopropylester侧链羧酸将氨基类型树脂连接到利拉鲁肽第17个gln位置，然后依次偶联nh2-ala-ala-lys(glu(nα-palmitoyl)-otbu)-phenylisopropylester片段，nh2-glu(otbu)-phe-ile-ala-phenylisopropylester片段、nh2-trp(boc)-leu-val-arg(pbf)-gly-arg(pbf)-gly-phenylisopropylester片段制得利拉鲁肽(17-31)-phenylisopropylester肽树脂，再通过固相偶联反应制备boc-his(trt)-ala-glu(otbu)-gly-thr(tbu)-phe-thr(tbu)-ser(tbu)-asp(tbu)-val-ser(tbu)-ser(tbu)-tyr(tbu)-leu-glu(otbu)-gly-glu(resin)-ala-ala-lys(glu(nα-palmitoyl)-otbu)-glu(otbu)-phe-ile-ala-trp(boc)-leu-val-arg(pbf)-gly-arg(pbf)-gly-phenylisopropyleaster(利拉鲁肽肽树脂)。
该方法解决了常规方法中gln难耦合的问题，且将glu侧链连接到固相氨基树脂上，glu侧链相对较长，增加了肽链与树脂之间的柔性，使肽链更容易变形而降低反应位阻，该方法不需要使用钯催化体系，避免了钯金属对产物的污染，从而提高合成反应效率和利拉鲁肽产品质量。
本发明的具体方案如下：
一种制备利拉鲁肽的方法，包括以下步骤：
通过fmoc固相合成法将fmoc-glu-2-r侧链羧酸连接到氨基类型树脂a上得fmoc-glu(resin)-r氨基酸树脂i；再通过固相偶联反应合成利拉鲁肽肽树酯：boc-his(trt)-ala-glu(otbu)-gly-thr(tbu)-phe-thr(tbu)-ser(tbu)-asp(tbu)-val-ser(tbu)-ser(tbu)-tyr(tbu)-leu-glu(otbu)-gly-glu(resin)-ala-ala-lys(glu(nα-palmitoyl)-otbu)-glu(otbu)-phe-ile-ala-trp(boc)-leu-val-arg(pbf)-gly-arg(pbf)-gly-r，最后在酸性条件下裂解、色谱纯化、冷冻干燥得到高纯度利拉鲁肽。
优选地，氨基树脂a选自rinkamidembharesin和rinkamideamresin中的一种；更加优选地，氨基树脂a的替代度为0.3～0.5mmol/g。
优选地，fmoc-glu-2-r为fmoc-glu-2-phenylisopropyleaster。
优选地，fmoc-glu-2-r侧链羧酸与氨基类型树脂a连接时，耦合试剂组合选自pybop/dipea/hobt和depbt/diea中的一种。
优选地，fmoc-glu(resin)-r氨基酸树脂i进行偶联反应前须用裂解液i脱除保护基r制得fmoc-glu(resin)-oh；更加优选地，裂解液i为含体积分数1.5％～2.5％tfa的dcm溶液，酸解时间为5min，酸解次数为2～3次。
优选地，利拉鲁肽肽树脂由fmoc-glu(resin)-r氨基酸树脂i依次与多肽片段nh2-v--r、多肽片段nh2-vi-r、多肽片段nh2-vii-r、fmoc-gly-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-tyr(tbu)-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-val-oh、fmoc-asp(tbu)-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-thr(tbu)-oh、fmoc-phe-oh、fmoc-thr(tbu)-oh、fmoc-gl广oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-ala-oh、boc-his(trt)-oh耦合制得。
优选地，fmoc-glu(resin)-r氨基酸树脂i依次与多肽片段nh2-v--r、多肽片段
nh2-vi-r、多肽片段nh2-vii-r耦合时，耦合试剂组合选自pybop/dipea/hobt、hatu/dipea/hobt、hbtu/dipea/hobt和dic/hobt中的一种。
优选地，多肽片段nh2-v-r为nh2-ala-ala-lys(glu(nα-palmitoyl)-otbu)-r、多肽片段nh2-vi-r为nh2-glu(otbu)-phe-ile-ala-r、多肽片段nh2-vii-r为nh2-trp(boc)-leu-val-arg(pbf)-gly-arg(pbf)-gly-r；更加优选地，r为phenylisopropyleaster。
优选地，多肽片段nh2-v-r、多肽片段nh2-vi-r、多肽片段nh2-vii-r的制备方法包括以下步骤：
步骤1、通过fmoc固相合成法分别将fmoc-lys(glu(nα-palmitoyl)-otbu)-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-gly-oh的羧基连接到ctc树脂b上制备fmoc--lys(glu(nα-palmitoyl)-otbu)-ctcresin氨基酸树脂ii、fmoc-ala-ctcresin氨基酸树脂iii、fmoc-gly-ctcresin氨基酸树脂iv；
步骤2、分别在氨基酸树脂ii、氨基酸树脂iii、氨基酸树脂iv上通过fmoc固相合成法制备全保护多肽片段v肽树脂、全保护多肽片段vi肽树脂、全保护多肽片段vii肽树脂；
步骤3、用裂解液i分别酸解全保护多肽片段v肽树脂、全保护多肽片段vi肽树脂、全保护多肽片段vii肽树脂制得全保护多肽片段fmoc-v-oh、全保护多肽片段fmoc-vi-oh、全保护多肽片段fmoc-vii-oh；
步骤4、用羧基保护试剂分别对全保护多肽片段fmoc-v-oh、全保护多肽片段fmoc-vi-oh、全保护多肽片段fmoc-vii-oh的羧基进行保护制备全保护多肽片段fmoc-v-phenylisopropyleaster、全保护多肽片段fmoc-vi-phenylisopropyleaster、全保护多肽片段fmoc-vii-phenylisopropyleaster；
步骤5、脱除全保护多肽片段fmoc-v-phenylisopropyleaster、全保护多肽片段fmoc-vi-phenylisopropyleaster、全保护多肽片段fmoc-vii-phenylisopropyleaster上的fmoc得到多肽片段nh2-v-r、多肽片段nh2-vi-r、多肽片段nh2-vii-r。
优选地，步骤1中ctc树脂b选自2-chlorotritylchloride树脂、4-methyl-trityl-cl树脂和4-methoxy-trityl-cl树脂中的一种，更加优选地，ctc树脂b的替代度为0.5～0.9mmol/g。
优选地，步骤4中羧基保护试剂为2-苯基丙-2-基2，2，2-三氯乙酰亚氨酸酯。
优选地，羧酸与羧基保护试剂的摩尔比为1∶1.5～2.5。
与现有技术相比，本发明的优点在于：
(1)fmoc-glu-2-phenylisopropylester侧链羧酸与氨基树脂连接到利拉鲁肽第17个gln位置(此处为利拉鲁肽肽链中间位置)，增加了肽链与树脂之间的柔性，使肽链更容易变形而降低反应位阻。
(2)glu侧链羧酸与氨基树脂连接，最后经过酸解变成gln，解决了常规多肽合成中gln难偶联的问题。
(3)通过将nh2-ala-ala-lys(glu(nα-palmitoyl)-otbu)-phenylisopropyleaster偶联到fmoc-glu(resin)-oh上，避免了在全保护利拉鲁肽主链肽树脂上修饰lys侧链所产生的重金属引入、合成效率低、易产生二酰化杂质的问题。
(4)本合成方法工艺简单，困难氨基酸容易合成，利于工业化生产，利拉鲁肽精制品收率40.7％，hplc纯度99.85％。
具体实施方式
本发明公开了一种制备利拉鲁肽的方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明中一些常见缩写具有以下含义：
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
本发明提供的制备利拉鲁肽的方法中所用原料及试剂均可由市场购得，2-苯基丙-2-基2，2，2-三氯乙酰亚氨酸酯的制备方法参考wessel，h.p；iversen.t.；bundle，d.r.j.chem.sot.perkintransi，1985，2247-2250。fmoc--lys(glu(nα-palmitoyl)-otbu)-oh可通过市场购得，也可自己制备，制备方法参考iguryanov；abondesan，j.pept.sci.2016，22(7)：471-479或cn103980358。
参考实施例2-苯基丙-2-基2，2，2-三氯乙酰亚氨酸酯的制备
nah(0.5g，21mmol)加入到20ml乙醚溶液中，氮气保护下，搅拌，滴加2-苯基-2-丙醇(210mmol)的乙醚溶液(30ml)，待固体溶解后，用冰盐浴将溶液冷却到0℃，然后在15min内滴加三氯乙腈(20ml，20mmol)，滴毕，将反应混合物在60min内加热到20℃，浓缩得糖浆状液体，再加入戊烷20ml(含无水甲醇0.8ml)，剧烈震荡，过滤，用戊烷洗涤(2×20ml)，浓缩滤液得到酰亚胺酸酯透明液体，直接用于下一步反应。亚胺酸酯的己烷溶液在5℃最多可存放2个月。
实施例1fmoc-glu(rinkamidembharesin)-oh的制备
称取10.0g替代度为0.4mmol/g的rinkamidembharesin加入到固相反应柱中，用dcm溶胀60min后抽干，向反应柱中加入80ml25％哌啶/dmf溶液脱保护(5+10min)，dmf洗涤6次，将fmoc-glu-2-phenylisopropyleaster(5.9g，12.0mmol)和depbt(3.6g，12.0mmol)溶解于nmp中，加入到装有树脂的反应柱中，再加入dipea(1.2ml，7.2mmol)，反应2小时后，kaiser检测反应完全，抽干，用dmf洗涤6次，得到fmoc-glu(rinkamidembharesin)-phenylisopropyleaster，向固相反应柱中加入100ml含体积分数2.0％tfa的dcm溶液，搅拌5min，抽滤，再次向固相反应柱中加入100ml含体积分数2.0％tfa的dcm溶液，搅拌5min，抽滤，用含体积分数2.0％dipea的dmf溶液洗涤树脂6次，得到fmoc-glu(rinkamidembharesin)-oh。
实施例2fmoc-glu(rinkamideamresin)-oh的制备
称取20.0g替代度为0.5mmol/g的rinkamideamresin加入到固相反应柱中，用dcm溶胀60min后抽干，向反应柱中加入120ml25％哌啶/dmf溶液脱保护(5+10min)，dmf洗涤6次，将fmoc-glu-2-phenylisopropyleaster(14.6g，30.0mmol)和hobt(4.1g，30.0mmol)pybop(15.6g，30.0mmol)溶解于nmp中，加入到装有树脂的反应柱中，再加入dipea(9.9ml，60.0mmol)，反应2小时后，kaiser检测反应完全，抽干，用dmf洗涤6次，得到fmoc-glu(rinkamideamresin)-phenylisopropyleaster，向固相反应柱中加入200ml含体积分数1.5％tfa的dcm溶液，搅拌5min，抽滤，再次向固相反应柱中加入200ml含体积分数1.5％tfa的dcm溶液，搅拌5min，抽滤，用含体积分数1.5％dipea的dmf溶液洗涤树脂6次，得到fmoc-glu(rinkamideamresin)-oh。
实施例3fmoc-glu(rinkamidembharesin)-oh的制备
称取20.0g替代度为0.3mmol/g的rinkamidembharesin加入到固相反应柱中，用dcm溶胀60min后抽干，向反应柱中加入120ml25％哌啶/dmf溶液脱保护(5+10min)，dmf洗涤6次，将fmoc-glu-2-phenylisopropyleaster(8.8g，18.0mmol)和depbt(5.4g，18.0mmol)溶解于nmp中，加入到装有树脂的反应柱中，再加入dipea(1.8ml，10.8mmol)，反应2小时后，kaiser检测反应完全，抽干，用dmf洗涤6次，得到fmoc-glu(rinkamidembharesin)-phenylisopropyleaster。向固相反应柱中加入200ml含体积分数2.5％tfa的dcm溶液，搅拌5min，抽滤，重复两次。用含体积分数2.5％dipea的dmf溶液洗涤树脂6次，得到fmoc-glu(rinkamidembharesin)-oh。
实施例4fmoc--lys(glu(nα-palmitoyl)-otbu)-ctcresin氨基酸树脂ii的制备
称取30.0g替代度为0.7mmol/g的2-chlorotritylchloride树脂加入到固相反应柱中，依次用dmf、dcm洗涤2次，dcm溶胀60min后抽干，将fmoc--lys(glu(nα-palmitoyl)-otbu)-oh(33.3g，42.0mmol)溶解于nmp中，加入到装有树脂的反应柱中，再加入dipea(13.8ml，84.0mmol)，反应2小时后抽干，用dmf洗涤3次，加入含30mlmeoh的dcm溶液180ml封闭1小时，抽干反应液，dmf洗涤6次，得到fmoc--lys(glu(nα-palmitoyl)-otbu)-ctcresin氨基酸树脂ii。用紫外分光光度法测定计算树脂替代度为0.56mmol/g。
实施例5fmoc-ala-4-methyl-tritylresin的制备
称取30.0g替代度为0.5mmol/g的4-methyl-trityl-cl树脂加入到固相反应柱中，依次用dmf、dcm洗涤2次，dcm溶胀60min后抽干，将fmoc-ala-oh(9.3g，30.0mmol)溶解于nmp中，加入到装有树脂的反应柱中，再加入dipea(9.9ml，60.0mmol)，反应2小时后抽干，用dmf洗涤3次，加入含30mlmeoh的dcm溶液180ml封闭1小时，抽干反应液，dmf洗涤6次，得到fmoc-ala-4-methyl-tritylresin。用紫外分光光度法测定计算树脂替代度为0.43mmol/g。
实施例6fmoc-gly-4-methyl-tritylresin的制备
称取30.0g替代度为0.85mmol/g的4-methyl-trityl-c1树脂加入到固相反应柱中，依次用dmf、dcm洗涤2次，dcm溶胀60min后抽干，将fmoc-gly-oh(15.2g，51.0mmol)溶解于nmp中，加入到装有树脂的反应柱中，再加入dipea(16.8ml，102.0mmol)，反应2小时后抽干，用dmf洗涤3次，加入含30mlmeoh的dcm溶液180ml封闭1小时，抽干反应液，dmf洗涤6次，得到fmoc-gly-4-methyl-tritylresin。用紫外分光光度法测定计算树脂替代度为0.65mmol/g。
实施例7多肽片段nh2-ala-ala-lys(glu(nα-palmitoyl)-otbu)-phenylisopropyleaster的制备
向实施例4中制得的fmoc-lys(glu(nα-palmitoyl)-otbu)-ctcresin氨基酸树脂ii中加入120ml25％哌啶/dmf溶液脱保护(5+10min)，dmf洗涤6次，将fmoc-ala-oh(10.5g，33.6mmol)和hobt(4.5g，33.6mmol)溶解于dmf中，冰浴15分钟，加入dic(5.2ml，33.6mmol)活化5分钟后加入到固相反应柱中，固相反应柱拧盖置于恒温震荡器中，震荡反应3h，茚三酮检测反应完全，抽掉反应液，dmf洗涤6次，制得fmoc-ala-lys(glu(nα-palmitoyl)-otbu)-ctc树脂。重复上述步骤，制得fmoc-ala-ala-lys(glu(nα-palmitoyl)-otbu)-ctc树脂，即全保护多肽片段v肽树脂。
将全保护多肽片段v肽树脂加入到400ml1.5％tfa/dcm中搅拌10min，抽滤，收集滤液。再次将全保护多肽片段i肽树脂加入到400ml1.5％tfa/dcm中搅拌10min，抽滤，树脂用1.5％tfa/dcm淋洗2次，收集合并滤液，滤液用800ml1.5％吡啶/二氯甲烷的溶液中和。真空下浓缩至约40ml，然后加入10ml乙醇，继续浓缩至残余液约20ml。加入400ml纯化水搅拌10min，静置沉淀产物。过滤收集固体，35℃真空干燥得15.9g全保护多肽片段v。
将2-苯基丙-2-基2，2，2-三氯乙酰亚氨酸酯(9.2g，32.4mmol)的环己烷溶液33ml滴加到全保护多肽片段v(15.9g，16.2mmol)的二氯甲烷(150ml)中，滴加完毕，室温搅拌至全保护多肽片段v反应完全，减压浓缩，残余物用少量二氯甲烷溶解，过滤，收集滤液，减压浓缩得fmoc-ala-ala-lys(glu(nα-palmitoyl)-otbu)-phenylisopropyleaster，即全保护多肽片段v-phenylisopropyleaster。
将全保护多肽片段v-phenylisopropyleaster溶于150ml20％哌啶/nmp中脱除fmoc，搅拌反应1小时后，加入1000ml冷水析出沉淀，过滤收集固体，固体分别用饱和碳酸氢钠溶液、蒸馏水、正己烷洗涤，过滤干燥得nh2-ala-ala-lys(glu(nα-palmitoyl)-otbu)-phenylisopropyleaster13.3g，总收率95.1％，hplc纯度：93.7％，无需纯化直接用于下一步反应。
实施例8多肽片段nh2-glu(otbu)-phe-ile-ala-phenylisopropyleaster的制备
按照实施例7中制备多肽片段的方法制备多肽片段nh2-vi-phenylisopropyleaster，即nh2-glu(otbu)-phe-ile-ala-phenylisopropyleaster8.1g，收率96.2％，hplc纯度：95.3％，无需纯化直接用于下一步反应。
实施例9多肽片段nh2-trp(boc)-leu-val-arg(pbf)-gly-arg(pbf)-gly-phenylisopropyleaster的制备
按照实施例7中制备多肽片段的方法制备多肽片段nh2-vii-phenylisopropyleaster，即nh2-trp(boc)-leu-val-arg(pbf)-gly-arg(pbf)-gly-phenylisopropyleaster28.2g，总收率92.0％，hplc纯度：91.8％，无需纯化直接用于下一步反应。
实施例10利拉鲁肽肽树脂的制备
10.1
将多肽片段nh2-v-r即nh2-ala-ala-lys(glu(nα-palmitoyl)-otbu)-phenylisopropyleaster(10.0g，12.0mmol)、pybop(6.2g，12.0mmol)和hobt(1.7g，12.6mmol)溶于150mldcm中，冰浴降温至0～5℃，加入dipea(4.0ml，24.0mmol)，然后加入到实施例1制得fmoc-glu(rinkamidembharesin)-oh(4.0mmol)中，室温反应5小时，抽滤，依次用dmf、dcm各洗涤3次。
向上述肽树脂中加入150ml2.0％tfa/dcm裂解液，室温反应5min，抽滤，再次向树脂中加入150ml2.0％tfa/dcm裂解液，室温反应5min，抽滤，用含体积分数2.0％dipea的dmf溶液洗涤树脂6次，制得fmoc-glu(rinkamidembharesin)-ala-ala-lys(glu(nα-palmitoyl)-otbu)-oh肽树脂。
10.2多肽片段nh2-vii-r
按照10.1的方法依次耦合多肽片段nh2-vi-r即nh2-glu(otbu)-phe-ile-ala-phenylisopropyleaster、多肽片段nh2-vii-r即nh2-trp(boc)-leu-val-arg(pbf)-gly-arg(pbf)-gly-phenylisopropyleaster，多肽片段nh2-vii-r耦合完毕不需要酸解，制得：
fmoc-glu(resin)-ala-ala-lys(glu(nα-palmitoyl)-otbu)-glu(otbu)-phe-ile-ala-trp(boc)-leu-val-arg(pbf)-gly-arg(pbf)-gly-phenylisopropyleaster肽树脂。
10.3
fmoc-glu(resin)-ala-ala-lys(glu(nα-palmitoyl)-otbu)-glu(otbu)-phe-ile-ala-trp(boc)-
leu-val-arg(pbf)-gly-arg(pbf)-gly-phenylisopropyleaster肽树脂中加入100ml20％哌啶/dmf溶液脱保护(5+10min)，dmf洗涤6次。按照多肽固相合成方法依次偶联fmoc-gly-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-tyr(tbu)-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-val-oh、fmoc-asp(tbu)-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-thr(tbu)-oh、fmoc-phe-oh、fmoc-thr(tbu)-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-ala-oh、boc-his(trt)-oh，最后一个氨基酸boc-his(trt)-oh连接完毕后，抽干反应液，依次用dmf、dcm、meoh、dmf、dcm、meoh(2次)洗涤树脂，制得利拉鲁肽肽树脂28.8g。
实施例11利拉鲁肽粗品的制备
按照tfa∶tis∶h2o∶dtt＝90∶3.5∶2.5∶4(v∶v∶v∶m，ml∶ml∶ml∶g)的比例配制裂解液300ml，冰浴冷却至-5℃，边搅拌边加入实施例10制得的全保护利拉鲁肽肽树脂。反应2小时后，过滤树脂，真空浓缩滤液至约25ml，缓慢倒入3l冰乙醚中析出沉淀，过滤，滤饼用乙醚洗涤5次。真空干燥滤饼，得到利拉鲁肽粗品13.9g，收率92.7％，hplc纯度：83.9％。
实施例12利拉鲁肽的分析和制备
将实施例11制备的利拉鲁肽粗品溶于150ml10％乙酸/10％乙腈/80％水(v/v/v)溶液中，超声使样品完全溶解，用滤膜过滤，收集滤液，备用。
分析条件：色谱柱：资生堂capcellpakc18，5μm，4.6×150mm；流动相：a相：0.045％三氟乙酸-水溶液；b相0.036％三氟乙酸-乙腈溶液，检测波长为214nm；流速为1ml·min-1。
利拉鲁肽粗品的一次纯化条件为：色谱柱：c18型半制备柱，柱子直径和长度为：50mm×250mm。流动相：a相：0.1％三氟乙酸-水溶液；b相：0.1％三氟醋酸-乙腈溶液，流速：60ml/min，梯度：30％b-70％b，检测波长：215nm。进样量为1.5～2.5g。收集目标峰馏分，得到目标峰纯度大于95％的馏分，将收集到的馏分于水温低于35℃减压浓缩至馏分不再流出，得到一次纯化物料。
将一次纯化收集到的浓缩馏分进行二次除盐纯化，条件为：流动相a相：纯化水；b相：乙腈溶液，检测波长：215nm，流速为30～60ml·min-1。收集目标馏分，将收集到的馏分于水温低于35℃减压浓缩至馏分不再流出，将剩余馏分冻干，得到利拉鲁肽精制品6.1g，总收率40.7％，hplc纯度：99.85％，单杂0.08％。
对比实施例1利拉鲁肽的制备
称取9.14g(2mmol)取代度为0.10mmol/g的fmoc-gly-王树脂，加入固相反应柱中，用dmf洗涤1次，用dmf溶胀fmoc-gly-王树脂30分钟后，用dmf∶吡啶体积比为4∶1的混合溶液脱去fmoc保护，然后用dmf洗涤6次，称取6.48gfmoc-arg(pbf)-oh(10mmol)、1.36ghobt(10mmol)加入体积比为1∶1的dcm和dmf混合溶液，冰水浴下加入dic(1.6ml，10mmol)活化后，加入上述装有树脂的反应柱中，室温下反应2小时后，以茚三酮法检测判断反应终点，如果树脂无色透明，则表示反应完全；树脂显色，则表示反应不完全，需要再反应1小时，此判断标准适用于后续氨基酸偶联中以茚三酮法检测判断反应终点。重复上述脱除fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照利拉鲁肽主链肽序，依次完成fmoc-gly-oh、fmoc-arg(pbf)-oh、fmoc-val-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-trp(boc)-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-ile-oh、fmoc-phe-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-lys(glu(nα-palmitoyl)-otbu)-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-gln(trt)-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-tyr(tbu)-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-val-oh、fmoc-asp(otbu)-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-thr(tbu)-oh、fmoc-phe-oh、fmoc-thr(tbu)-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-ala-oh、boc-his(trt)-oh的偶联。其中fmoc-leu-oh和fmoc-phe-oh偶联时溶剂换为：选用体积比为1∶4的dmso和dmf混合溶液；fmoc-asp(otbu)-oh偶联时偶联试剂换为：pybop/hobt/diea；boc-his(trt)-oh偶联时偶联试剂换为：
hatu/hobt/diea，fmoc-gln(trt)-oh偶联反应2小时，以茚三酮法检测，树脂显蓝色，再反应1小时，以茚三酮法检测，树脂仍显蓝色，表示反应不完全。偶联完毕，将利拉鲁肽王树脂用dmf洗涤3次，dcm洗涤3次，meoh洗涤3次，dcm洗涤3次，meoh洗涤3次，抽干得到17.3g利拉鲁肽王树脂。
称取8.7g全保护的利拉鲁肽王树脂，加入到100ml的三口圆底烧瓶中，按tfa∶苯甲硫醚∶苯甲醚∶edt＝90∶5∶3∶2的体积比配置裂解液870ml，将裂解液加入上述树脂中，室温反应2小时，过滤，用少量tfa洗涤裂解后的树脂3次，合并滤液，浓缩，将浓缩后的液体加入到冰乙醚中沉淀1小时，离心，无水乙醚离心洗涤6次，真空干燥，得到利拉鲁肽粗肽2.7g，hplc纯度68.1％，粗肽收率71.6％。
称取2.7g利拉鲁肽粗肽用50％乙腈+50％水的混合溶液22ml溶解后，通过c18或c8柱2次纯化、转盐、冷冻干燥后得到目标产物。第一次纯化条件：流动相为：a相：0.1％tfa；b相：乙腈，检测波长220nm，收集目的峰馏分。第二次纯化条件：流动相为：a相：0.3％乙酸；b相：乙腈。检测波长220nm，收集目的峰馏分。转盐条件：流动相：a相：20mm乙酸铵-水溶液；b相：乙腈；检测波长220nm。收集目的峰馏分，旋蒸浓缩，冻干得到利拉鲁肽醋酸盐精肽0.77g，纯化收率28.5％，总收率20.5％，hplc纯度98.73％，单杂：0.92％。
对比实施例2利拉鲁肽的制备
2.1fmoc-phe-ile-ala-trp(boc)-leu-val-arg(pbf)-gly-arg(pbf)-gly-ctcresin(肽树脂v)的合成
称取0.67mmol/g的fmoc-gly-ctcresin(10g，6.7mmol)加入反应器中，用dmf溶胀后抽滤除去液体。加入适量去保护液(体积比20％哌啶/dmf)，20-30℃下反应25-30min，脱去保护基fmoc。用适量dmf洗涤6遍。另外称取fmoc-arg(pbf)-oh(13.05g，20mmol)和hobt(2.72g，20mmol)加入专用烧杯，再加入dmf适量，溶解后，加入dic(3.1ml，20mmol)，10-20℃搅拌5min后，将此活化液加入反应器。反应约2小时后，用茚三酮做氨基的定性检测来跟踪反应终点。当检测所得树脂显示无色透明时，说明反应完全。抽滤除去液体。用dmf洗涤三遍后完成arg的偶联。重复上述脱除fmoc、预活化、偶联及dmf洗涤操作，按利拉鲁肽主链从碳端到氮端次序，依次偶联fmoc-gly-oh、fmoc-arg(pbf)-oh、fmoc-val-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-trp(boc)-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-ile-oh、fmoc-phe-oh后，用适量dmf洗涤3遍。再依次用dcm和甲醇洗涤，收缩树脂得肽树脂v(23.7g)。
2.2fmoc-phe-ile-ala-trp(boc)-leu-val-arg(pbf)-gly-arg(pbf)-gly-oh(片段ii)的合成称取肽树脂v(10.0g，2.8mmol)加入到预先配制有tfa/dcm(体积比1％，200ml)的裂解液中，20～30℃搅拌1小时。过滤收集滤液。再重复用2次tfa/dcm(体积比1％，200ml)对过滤所得树脂进行裂解并过滤。合并3次裂解所得滤液，用diea调节到溶液接近中性。减压浓缩后，加入适量水。过滤，收集滤饼冻干后得片段ii(4.5g，收率94.3％，hplc纯度90.1％)。
2.3fmoc-phe-ile-ala-trp(boc)-leu-val-arg(pbf)-gly-arg(pbf)-gly-otbu(片段iii)的合成
称取片段ii(4.4g，2.6mmol)加入250ml圆底烧瓶，再加入chcl3/tfe/tbta(体积比70/20/10，100ml)，于30～35℃下搅拌反应2小时，将反应物用甲基叔丁基醚沉降、过滤冻干得片段iii(4.5g)。
2.4h-phe-ile-ala-trp(boc)-leu-val-arg(pbf)-gly-arg(pbf)-gly-otbu(片段iv)的合成
称取片段iii(4.1g，2.4mmol)加入250ml圆底烧瓶，再加入去保护液(50ml)，于20～30℃下反应30min。加入水(100ml)，充分搅拌，过滤收集沉淀，水洗。冻干得片段iv(3.4g)。
2.5
boc-his(trt)-ala-glu(tbu)-gly-thr(tbu)-phe-thr(tbu)-ser(tbu)-asp(tbu)-val-ser(tbu)-ser(tbu)-tyr(tbu)-leu-glu(tbu)-gly-gln(trt)-ala-ala-lys(dde)-glu(resin)-oall(肽树脂iii)的合成
称取0.28mmol/g的fmoc-glu(wangresin)-oall(7.14g，2mmol)加入反应器中，用dmf溶胀后抽滤除去液体。加入适量去保护液，20～30℃下反应25～30min，脱去保护基fmoc。用适量dmf洗涤6遍。另外称取fmoc-lys(dde)-oh(3.19g，6.0mmol)和hobt(0.82g，6.0mmol)加入专用烧杯，再加入dmf适量，溶解后，加入dic(0.94ml，6.0mmol)，10～20℃搅拌5min后，将此与活化液加入反应器。反应约2小时后，用茚三酮做氨基的定性检测来跟踪反应终点。当检测所得树脂显示无色透明时，说明反应完全。抽滤除去液体。用dmf洗涤三遍后完成fmoc-lys(dde)-oh偶联。重复上述脱除fmoc、预活化、偶联及dmf洗涤操作，按利拉鲁肽主链从碳端到氮端次序，依次偶联fmoc-ala-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-gln(trt)-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-glu(tbu)-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-tyr(tbu)-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-val-oh、fmoc-asp(tbu)-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-thr(tbu)-oh、fmoc-phe-oh、fmoc-thr(tbu)-oh、fmoc-gl广oh、fmoc-glu(tbu)-oh、fmoc-ala-oh、boc-his(trt)oh后，用适量dmf洗涤3遍。再依次用dcm和甲醇洗涤，收缩树脂得肽树脂iii(14.1g)。
2.6
boc-his(trt)-ala-glu(tbu)-gly-thr(tbu)-phe-thr(tbu)-ser(tbu)-asp(tbu)-val-ser(tbu)-ser(tbu)-tyr(tbu)-leu-glu(tbu)-gly-gln(trt)-ala-ala-lys(nα-pal-γ-glu-otbu)-glu(resin)-oall(肽树脂iv)的合成
称取肽树脂iii(7.25g，1mmol)加入固相反应器，加入适量dmf溶胀、抽滤后，加入适量nh2nh2·h2o/dmf(体积比2/98)，反应10分钟后，抽滤除去液体，再加入适量nh2nh2·h2o/dmf(体积比2/98)，反应10分钟后，抽滤除去液体，再加入适量nh2nh2·h2o/dmf(体积比2/98)，反应10分钟后，抽滤除去液体，再加入适量nh2nh2·h2o/dmf(体积比2/98)，反应10分钟后，抽滤除去液体。加入适量dmf洗涤6遍后抽滤除去液体。称取fmoc-glu-otbu(2.55g，6.0mmol)，hobt(0.81g，6mmol)加入烧杯，加入适量dmf溶解后，再加入和dic(1.0ml，6mmol)，于10～20℃搅拌反应5分钟，再将此混合溶液加入反应器中，控制反应温度25～30℃，反应2小时后，用茚三酮做氨基的定性检测来跟踪反应终点。用dmf洗涤三遍后，加入适量去保护液，20～30℃下反应25～30min，脱去保护基fmoc。用适量dmf洗涤6遍。称取pal-oh(1.52g，6mmol)，hobt(0.81g，6mmol)加入烧杯，加入适量dmf溶解后，再加入和dic(1.0ml，6mmol)，于10～20℃搅拌反应5分钟，再将此混合溶液加入反应器中，控制反应温度25～30℃，反应2小时后，用茚三酮做氨基的定性检测来跟踪反应终点。加入适量dmf洗涤三遍后，再依次用dcm和甲醇洗涤，收缩树脂得肽树脂iv(7.5g)。
2.7利拉鲁肽肽树脂的合成
称取肽树脂iv(7.5g，1mmol)，加入固相反应器，加入适量dmf溶胀、抽滤后，再加入dcm(40ml)和pd(ph3)4(0.12g，0.11mmol)和吗啉(0.13ml)，0～5℃反应1小时后，抽滤除去液体，并用适量dmf洗涤6遍。往反应器中加入dmf适量，再加入hatu(1.16g，3.0mmol)和diea(0.6ml，0.36mmol)，再加入片段iv(2.81g，1.5mmol)，于20～30℃反应过夜。抽滤除去液体，并用适量dmf洗涤3遍，再依次用dcm和甲醇洗涤，收缩树脂得利拉鲁肽肽树脂(9.2g)。
2.8利拉鲁肽的合成
称取利拉鲁肽肽树脂(9.2g，1mmol)，加入到tfa/edt/tis/h2o(体积比87.5/5/5/2.5，95ml)中，控制反应温度25～30℃，搅拌反应3小时。过滤，滤饼用少量tfa洗涤后合并滤液。将滤液转移到减压蒸馏系统，在30～35℃下浓缩除去大部分的tfa。将浓缩液加入到-5℃的甲基叔丁基醚中(500ml)中，搅拌沉降1小时。过滤，取出滤饼用甲基叔丁基醚中(500ml)打浆、过滤。再用相同体积的甲基叔丁基醚重复打浆、过滤4遍。最后所得滤饼干燥后的得利拉鲁肽粗品(3.2g，hplc纯度：61.8％)。
2.9利拉鲁肽的纯化、冻干
称取利拉鲁肽粗品(3.2g)用乙腈/dmso/水溶液溶解、调节ph值。通过反相制备型hplc系统，波长215nm，色谱柱为c8或c18填料进行多次纯化、转盐、冷冻干燥后得利拉鲁肽成品(0.72g，总收率：19.2％；hplc纯度：99.17％，最大单杂0.62％，ms：[m+3h]3+：1251.2，calculated：3750.6)。