一种牙髓间充质干细胞的制备、培养及纯化方法与流程

本发明属于干细胞与再生医学领域，具体涉及一种牙髓间充质干细胞的制备、培养及纯化方法。
背景技术：
间充质干细胞(msc)是一类具有自我复制和多向分化能力的干细胞，在一定条件下可以分化为骨骼、软骨、神经、表皮等多种功能细胞，在再生医学领域中具有重要的应用前景。间充质干细胞存在于人体多种组织中，如常见的骨髓、脐带华通胶、脐带血、胎盘等组织，但是骨髓来源的间充质干细胞存在取材困难，对人体伤害大等问题；脐带和胎盘等组织中的间充质干细胞具有活性高、增殖能力强，取材对身体无损害的优点，但是其组织只能在分娩期间采集，错过时机将无法挽回。牙髓间充质干细胞(dentalpulpstemcells，dpscs)是gronthos于2000年提出的概念，牙髓间充质干细胞存在于牙髓腔中，是胚胎发育过程中神经嵴细胞发育而来，在体外具有和骨髓间充质干细胞极为相似的免疫表型和矿化结节能力，而且相比骨髓间充质干细胞具有更高的增殖活性。乳牙是儿童在10岁左右换牙期间脱落的牙齿，牙髓中的牙髓间充质干细胞具有很高是增殖活性和克隆形成能力，并可以分化为包括神经细胞、脂肪细胞和牙本质细胞在内的各种细胞，把体外培养的细胞移植到小鼠体内可以形成骨组织和牙本质组织。乳牙中的牙髓间充质干细胞采集方便，儿童换牙过程中有超过20次的采集机会且无痛无创。乳牙在发育方面与颌骨组织具有相同的来源，采集的乳牙牙髓间充质干细胞可以用来修复牙周炎引起的牙本质缺损或颌骨部分缺损是非常合适的选择。现阶段牙髓间充质干细胞制备方法一般都是取出牙髓组织后采用酶消化或者组织植块的方法分离其中的间充质干细胞，但是牙髓组织富含血管和神经等其他组织，通过酶消化得到的细胞纯度低，可能混合大量的内皮细胞、成纤维细胞等杂细胞，这些细胞在正常的生长过程中与间充质干细胞争夺营养，对间充质干细胞培养带来不利影响；而组织植块发细胞迁移速度慢，部分细胞残留组织块中无法全部迁移出来造成细胞损失，为后期牙髓间充质干细胞的临床应用带来不便。技术实现要素：本发明的目的是针对以上要解决的技术问题，提供能够有效制备、分离和纯化牙髓间充质干细胞的方法。为此，本发明提供了以下技术方案。一种牙髓间充质干细胞的制备方法，其包括以下步骤：(1)向牙髓组织加入组织消化液进行消化；(2)消化结束后再加入h-dmem培养液稀释消化液，滤除牙齿碎片，滤液离心去除上清液，得到沉淀；(3)用h-dmem培养液清洗所述沉淀，再次离心去上清，得到分离后的牙髓间充质干细胞。优选地，所述组织消化液包括h-dmem、基于所述h-dmem体积2mg/ml的中性蛋白酶、1mg/ml的i型胶原酶和0.5mg/ml的dna酶。优选地，所述牙髓组织来源于儿童换牙过程中自然脱落的乳牙。更优选地，将乳牙用酒精(如75％的医用酒精)消毒后，用组织清洗液清洗，压碎后剔除破碎的牙齿碎片，获得牙髓组织。组织清洗液由生理盐水添加按生理盐水体积计25μg/ml的硫酸庆大霉素和5μg/ml的两性霉素b配制。本发明还提供了一种牙髓间充质干细胞的培养及纯化方法，其包括：在得到牙髓间充质干细胞后，使用选择培养基进行细胞培养。优选地，所述选择培养基包括无血清培养基、以及基于所述无血清培养基体积15ng/ml的fgf-4、10ng/ml的hgf、终浓度为0.3mm的α-酮戊二酸。优选地，细胞培养的氧气体积浓度为10％。优选地，细胞培养的气体条件为：氧气体积浓度10％、二氧化碳体积浓度5％、氮气体积浓度85％。人体内正常生理状态下氧浓度为1-13％以内，体内间充质干细胞主要是在低氧环境中生长(低于空气中的21％浓度)，因此低氧环境更适合间充质干细胞的自然生长状态。低氧环境可以提供间充质干细胞增殖活性、迁移及粘附能力，本发明选用10％的氧浓度用于培养牙髓间充质干细胞。此外，本发明通过优化组织消化酶的配方，同时使用中性蛋白酶和i型胶原酶消化牙髓组织，最大限度的分离牙髓组织中的细胞，dna酶降解破碎组织中游离出来的dna长链，避免分散的单细胞聚集成团，提高细胞得率，解决细胞得率低的问题，尽可能多的收集原代细胞进行培养；通过优化细胞增殖选择培养基配方，采用无血清培养基及低氧环境氧浓度，使得内皮细胞、成纤维细胞等终末分化细胞生长速度受限，通过添加细胞生长因子和添加剂，使间充质干细胞获得生长优势，最大幅度的提高间充质干细胞与终末细胞的生长速度差异，从而通过几次传代培养去除内皮细胞和成纤维细胞等杂细胞，纯化目的细胞。本发明使用成分明确的无血清培养基，避免了动物血清引入带来的风险，为后期牙髓间充质干细胞临床应用提供条件。牙髓间充质干细胞是具有成纤维细胞特性的细胞，在成纤维细胞生长因子的刺激下可以快速增殖，通过扩大牙髓间充质干细胞和其他杂细胞的增殖速度来使牙髓间充质干细胞获得生长优势，经过2-3次传代培养后可以得到高纯度的牙髓间充质干细胞，相比现有的分离纯化方法更简单有效，而且对细胞活性无任何影响，有利于牙髓间充质干细胞扩增及后期临床应用。附图说明图1示出了p0代牙髓间充质干细胞贴壁状态。图2示出了p3代牙髓间充质干细胞贴壁状态。图3示出了牙髓间充质干细胞特异性标记分子的流式检测结果。具体实施方式下面结合具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的详述，但本发明并不限于以下实施例。制备、培养并纯化牙髓间充质干细胞，步骤如下：1、牙髓组织来源于儿童换牙过程中自然脱落的乳牙，口腔医院采集样本，样本采集前签署知情同意书。2、采集的乳牙放置于无菌组织保护液中，冷藏环境(4-8℃)运抵实验室，运输时间控制在48小时内，组织保护液的配方如下：h-dmem(gibco12491-015)、终浓度为25μg/ml(基于h-dmem体积)的硫酸庆大霉素、终浓度为5μg/ml(基于h-dmem体积)的两性霉素b。确保运输过程中无细菌和真菌污染。3、乳牙组织在实验室中用75％(v/v)医用消毒酒精消毒1min，预冷组织清洗液清洗3次，组织清洗液由生理盐水添加按生理盐水体积计25μg/ml的硫酸庆大霉素和5μg/ml的两性霉素b配制。4、使用无菌液压钳压碎乳牙组织，剔除掉破碎的牙齿碎片，用眼科剪剪碎牙髓组织，添加1ml组织消化液(组织消化液和牙髓组织的体积比为至少10：1，牙髓组织很少)于37℃震荡培养箱中消化牙髓组织1小时，组织消化液配方如下：h-dmem(dulbecco'smodifiedeaglemedium，杜氏改良eagle培养基)(gibco12491-015)、2mg/ml(基于h-dmem体积)中性蛋白酶、1mg/ml(基于h-dmem体积)i型胶原酶、0.5mg/ml(基于h-dmem体积)dna酶。5、消化结束后加入10mlh-dmem(gibco12491-015)培养液稀释组织消化液(h-dmem培养液与组织消化液的体积比为至少10：1)，过100μm滤网滤除牙齿碎片，滤液离心(1500r/min)5min，去除上清液；6、向沉淀加入10mlh-dmem(gibco12491-015)培养液清洗一次，离心(1500r/min)5min去上清；7、细胞沉淀用无血清选择培养基重悬，以8000/cm2的密度接种于t25培养瓶，在三气培养箱中正常培养(37℃，氧气体积浓度10％、二氧化碳体积浓度5％、氮气体积浓度85％)，第4天半量换液，其后每3天全量换液，细胞长至70-80％融合度以1：4比例传代培养(见图1)，用上述选择培养基培养。上述选择培养基的配方如下：无血清培养基(友康恒业生物科技(北京)有限公司，间充质干细胞无血清培养基，产品货号：nc0103)、15ng/ml(基于无血清培养基的体积)fgf-4(成纤维细胞生长因子-4)、10ng/ml(基于无血清培养基的体积)hgf(肝细胞生长因子)、终浓度为0.3mm(基于无血清培养基)的α-酮戊二酸。8、牙髓间充质干细胞正常培养到第3代(p3)(如图2所示)，收集细胞做流式检测，测定间充质干细胞特异性标记分子(cd73、cd90、cd105、cd34、cd45)。如图2所示，经过3次传代培养后可以得到高纯度的牙髓间充质干细胞，相比现有的分离纯化方法更简单有效，而且对细胞活性无任何影响，有利于牙髓间充质干细胞扩增及后期临床应用。如图3和以下表1所示，为流式检测以上所得牙髓间充质干细胞特异性标记分子(cd73、cd90、cd105、cd34、cd45)的结果。表1牙髓间充质干细胞特异性标记分子的流式检测结果项目cd45+cd34+cd90+cd105+cd73+阳性率(％)0.0099.9897.0599.61表1和图3的结果显示，cd73、cd90、cd105阳性率≥97％，cd34、cd45阳性率＝0％，证明间充质干细胞的干细胞纯度符合要求。当前第1页12