一种与苏淮猪腿臀围性状相关的SNP标记引物对及其应用的制作方法

本发明属于分子生物学技术领域，涉及一种与苏淮猪腿臀围性状相关的snp标记引物对及其应用。

背景技术

猪腿臀围(hamcircumference)性状指猪自左侧膝关节前缘，经肛门、绕至右侧膝关节前缘的距离。猪腿臀围是影响猪生长的一个重要指标。研究表明苏淮猪腿臀围性状与其体高、胸围、腹围性状极显著相关(p<0.01)，可见提升苏淮猪腿臀围对于苏淮猪整体的生长发育有积极地提升作用，这对生长相对较慢的苏淮猪来说具有重要的意义。并且，提升苏淮猪腿臀围性状可以有效提升苏淮猪后腿比例，对苏淮猪经济性状的育种来说也显得尤为重要。猪肉是人们餐桌上的主要肉类之一。数据显示，2016年中国年消费猪肉总量排名世界第一。人们对猪肉的喜爱程度可见一斑。80年代以来，为满足国内市场对猪肉消费量的需求，各地在普遍推广应用国外杜洛克、长白、大白等商品瘦肉型猪种的同时，也在积极进行培育猪种的选育，如苏太猪、苏淮猪等。培育猪种相比国外商品瘦肉型猪虽然具有肉质好、抗逆性强等优良特性，但生长性能相对较慢。近年来，伴随着经济增长，人们生活品质快速提升，对猪肉品质的要求也从数量转变为同时追求质量和数量，市场需求方向的转变引导着猪育种思路的改变。这对于苏淮猪等培育猪种来说，育种的重点不仅仅在于肉质等性状的提升，同时还应注重腿臀围等相关生长性能的提升。猪腿臀围性状的遗传力较低(0.2-0.4)，常规选育困难，因此鉴别影响苏淮猪腿臀围的关键基因位点，利用分子标记辅助选育技术提升苏淮猪的腿臀围性状具有重要意义。

苏淮猪是由淮安市淮阴种猪场、南京农业大学、江苏省畜牧总站和淮安市农业委员会等单位于1998年开始培育，2011年3月25日获得国家畜禽遗传资源委员会新品种授权，证书为“(农01)新品种证字第18号”。苏淮猪是在新淮猪基础上再导入大白猪血统，通过横交、多世代选育而成，含新淮猪血统50％，大白猪血统50％。近期的一些研究发现，苏淮猪腿臀围变异系数较大，且160日龄苏淮猪腿臀围平均值为(75.25±0.37)cm，这与同时段国外商品瘦肉型猪腿臀围(80cm以上)相比相对较少。由此可见，对苏淮猪腿臀围的持续选育已迫在眉睫。

根据猪qtl数据库网站(http://www.animalgenome.org/cgi-bin/qtldb/ss/index)知，有关腿臀围的qtl报道很少，且主要定位在猪3、6、13、15和17这五条染色体上，且大部分是利用微卫星标记定位的qtl，置信区间多在10-20cm，无法确定真正的主效基因及其关键变异位点，因此难以直接应用于种猪选育改良。

技术实现要素：

本发明的目的在于针对猪传统腿臀围选育耗时费力，选育效果不佳，提供与苏淮猪腿臀围相关的snp标记并将其开发为分子标记。

本发明的另一个目的在于提供用于检测上述snp标记的引物对和检测方法。

本发明的另一个目的在于提供上述snp标记的用途。

一种开发与苏淮猪腿臀围性状相关的分子标记的方法，以含有国际猪基因组11.1版本参考序列猪13号染色体rs319699771核苷酸位点的核苷酸序列为基础序列，设计引物对，以苏淮猪基因组dna为模板进行pcr扩增，使国际猪基因组11.1版本参考序列猪13号染色体rs319699771核苷酸位点转化为分子标记；rs319699771位点三种基因型之间腿臀围性状有极显著差异，其中gg型个体腿臀围显著高于aa型，gg型个体腿臀围高于ag型个体。

所述的引物对序列为上游引物：seqidno.2，下游引物：seqidno.3。

按照上述的方法得到的分子标记。

所述的分子标记序列优选如seqidno.1所示，所述的国际猪基因组11.1版本参考序列猪13号染色体rs319699771核苷酸位点在seqidno.1中位于第92位，存在a/g多态性。

一种用于检测与苏淮猪腿臀围性状相关的snp标记的引物对，上游引物为：seqidno.2，下游引物为：seqidno.3；所述的与苏淮猪腿臀围性状相关的snp标记位于猪13号染色体上的muc13基因的核苷酸序列上，所述snp标记的位点为国际猪基因组11.1版本参考序列猪13号染色体rs319699771核苷酸位点的分子标记，且具有a/g多态性，所述snp标记与160日龄苏淮猪臀腿围性状极显著相关(p<0.01)。

一种检测与所述的苏淮猪腿臀围性状相关的snp标记的方法，包含pcr扩增苏淮猪国际猪基因组11.1版本参考序列猪13号染色体rs319699771核苷酸位点的一段序列，对扩增产物进行测序，判读该位点的a/g多态性。

具体判读方法，根据权利要求6所述的方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)取苏淮猪组织样品提取总dna；

(2)用已提取的苏淮猪基因组dna为模板，使用权利要求5所述的引物对进行pcr扩增；

(3)扩增产物进行测序，分析测序结果，判读在seqidno.1第92位的a/g多态性。

本发明所述的分子标记、所述的引物对在筛选高腿臀围苏淮猪群体中的应用。

一种筛选高腿臀围苏淮猪品系的方法，包括检测苏淮猪国际猪基因组11.1版本参考序列猪13号染色体rs319699771核苷酸位点的基因型，选育rs319699771核苷酸位点的gg型个体优先作为种猪。

有益效果：

本发明提供的snp标记与苏淮猪腿臀围性状相关，基于该snp开发的分子标记及引物可用于snp的检测。因此，可以通过鉴定该snp标记来筛选高腿臀围苏淮猪品系，所得的高腿臀围苏淮猪品系具有重要的经济效益与社会价值。

附图说明

图1为苏淮猪13染色体muc13基因rs319699771位点扩增胶图

图2为苏淮猪13染色体muc13基因rs319699771位点分型图示例。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和本质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

实施例1

1试验动物来源

江苏省淮安市淮阴种猪场

2提取苏淮猪基因组dna

采集261头160日龄苏淮猪组织样1份/头，用于个体dna提取；

参考天根生物科技公司组织dna提取试剂盒说明书，提取按以下步骤顺序进行：

①先在缓冲液gd和漂洗液pw中分别加入68ml和200ml无水乙醇，充分混匀。

②采集组织样50-100mg置于2mlep管内，完全剪碎后加200μl缓冲液ga，振荡至彻底悬浮。

③加入20μl蛋白酶k溶液，混匀后放在56℃金属浴中消化过夜，直至耳样组织溶解，简短离心以去除管盖内壁的水珠。

④加入200μl缓冲液gb，充分颠倒混匀，放在70℃金属浴10min，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。

⑤加人200μl无水乙醇，充分振荡混匀15sec，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。

⑥将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱cb3中，吸附柱放入收集管中，随后以12,000rpm离心30sec，倒掉废液，将吸附柱cb3放回收集管中。

⑦向吸附柱cb3中加入500μl缓冲液gd，12,000rpm离心30sec，倒掉废液，将吸附柱cb3放入收集管中

⑧向吸附柱cb3中加入600μl漂洗液pw，以12,000rpm离心30sec，倒掉废液，将吸附柱cb3放入收集管中。

⑨重复操作步骤⑧。

⑩将吸附柱cb3放回收集管中，12,000rpm离心2min，倒掉废液。将吸附柱cb3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

将吸附柱cb3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100μl洗脱缓冲液te，室温放置2-5min，12,000rpm离心2min，将溶液收集到离心管中，将离心得到的溶液再加入吸附柱cb3中，室温放置2min，12,000rpm离心2min将溶液收集到离心管中。

经过nanodrop-100分光光度计检测质量与浓度后将浓度同一稀释到50ng/μl于-20℃下保存备用。

3、目的片段pcr扩增与测序

用已提取的dna为模板，根据所设计的引物，进行pcr扩增：取dna模板1μl、seqidno.2和seqidno.3所示的引物各0.4μl、pcrmix试剂10μl、双蒸水7.2μl；设置pcr扩增体系：

pcr产物在1.2％琼脂糖凝胶中电泳检测，扩增的目的片段大小约320bp，电泳图见图1，将剩余的扩增产物进行测序，测序结果用dnaman软件与genbank中猪的相关基因片段序列比对、分析，判读rs319699771位点的基因型，

4、统计分析

利用sas软件一般线性模型进行基因型对表型的影响效应分析。分析模型为

yijnk＝ui+gj+sn+dk+ejnk

其中：yijnk为猪的腿臀围性状；gj代表第j个snp的基因型固定效应；sn代表性别的固定效应；dk是协变量；ejnk为残差。

5结果

表1给出了rs319699771变异位点a/g在160日龄苏淮猪群体中对腿臀围性状的影响效应。由表1可知，rs319699771位点三种基因型之间腿臀围性状有极显著差异(p<0.01)，其中gg型个体腿臀围显著高于aa型(p<0.05)，gg型个体腿臀围高于ag型个体，但是差异不显著。由此可见，在苏淮猪群体中，继代选育rs319699771位点的gg型个体，均可逐步提高苏淮猪群体腿臀围性状，达到提高苏淮猪生长性能的目的。

表1猪13号染色体muc13基因rs319699771位点与160日龄苏淮猪腿臀围的关联分析

注：同行数字肩标不同字母表示表示差异显著(p<0.05)。

序列表

<110>南京农业大学

南京农业大学淮安研究院

<120>一种与苏淮猪腿臀围性状相关的snp标记引物对及其应用

<160>3

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>321

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<221>gene

<222>(92)

<223>n=a或g

<220>

<221>misc_feature

<222>(92)..(92)

<223>nisa,c,g,toru

<400>1

tcctcacacctcctgccttttctccattcacatttgcaaaggactcattttctggctcaa60

gtttccatgtacatttcagagtctgagggatntgaattttggctataggcctgtggtcct120

ggatggggcgtgggctaaggagctggtgaggaggcccatgtgctgcctcacaggggacaa180

gtcacatgcagagccatggagcgcctcattctacccagaaaaagcaatgtgaaaaaattg240

tattctgtgacatgtcattttggggttgaacgggttgaactggtcgtttctgaaaattac300

ccagaaatcgctctgttttga321

<210>2

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

tcctcacacctcctgccttttc22

<210>3

<211>25

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

tcaaaacagagcgatttctgggtaa25