circPTPN22及其作为系统性红斑狼疮标志物的应用的制作方法

本发明属于生物技术领域，涉及circptpn22及其作为系统性红斑狼疮标志物的应用。

背景技术

circrna是一种环形闭合rna，广泛且多样的存在于各种生物细胞中。近年来，随着高通量测序的技术成熟，越来越多的circrna被发现，它的特征—稳定，特异，广泛，保守，以及功能多样化，都在提示着它可以作为一种重要的疾病标志物。系统性红斑狼疮(sle)是一种典型的自身免疫性疾病，可导致全身多种脏器、系统受累，如皮肤，肾脏，肺脏等，临床表现多样化，个体差异性大，目前仍然无法治愈，病人大多常年靠吃糖皮质激素类维持治疗。临床上，sle主要依靠临床表现结合实验室检查来确诊，另外，也常常通过检测补体和自身抗体滴度等血清生物标志物来评估sle的疾病活动性及治疗效果，但均不能理想地反映全部患者的病情进展及临床情况。因此，探索和研究新的标记物，对于更好的评估sle患者病情进展、指导患者的临床治疗及病情监测具有重要的意义。

circrna自发现以来，已经被发现在肝癌，胃癌，重度抑郁等疾病中可以作为生物标志物，作为诊断与评价预后的作用。但是，现有的circrna数据库—circbase并不完善，仍有较多未收录的circrna，所以我们利用三代测序技术—rna-seq对sle患者与正常人的外周血单个核细胞(pbmcs)进行测序，进一步寻找可能作用于疾病的特异性circrnas。并对具有较大差异性的circrna进行qrt-pcr验证，以证实其在sle中的稳定性。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种新型circrna，即circptpn22，及其作为系统性红斑狼疮标志物的应用。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

circptpn22(一种新发现的circrna的命名)，其核苷酸序列如seqidno.1所示。

circptpn22作为系统性红斑狼疮标志物的应用。

本发明的有益效果在于：

本发明首次证实了一种新型circrna，即circptpn22的存在，并在大规模病人群体研究中证实了它与sle的相关性，是被证实的首个与sle相关的circrna标志物，为circrna在sle中的深入研究奠定了基础。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：

图1a为pcr单一的溶解曲线，其中箭头标记的为circptpn22的溶解曲线，图1b为pcr产物测序的结果，其中箭头标记的为环化剪切位点；

图2为sle病人与正常人circptpn22相对表达量示意图，sle病人以疾病严重程度分为3组，纵坐标为circptpn22的相对表达量，*p<0.05**p<0.01****p<0.0001；

图3为circptpn22与sledai评分相关性示意图，以病人sledai评分为横坐标，以相对表达量为纵坐标做相关性分析，可见p<0.0001，r＝-0.5725。

具体实施方式

下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。

实施例1证明circptpn22的存在

a.在高通量测序数据中，以log2fc数值从高到低排序寻找较为稳定的circrna(log2fc≥1.0andfdr≤0.05)，通过对比，选中母基因为ptpn22的一条circrna，并获得其测序的序列信息及其环化位点，将其命名为circptpn22，circptpn22的序列如seqidno.1所示。

b.qrt-pcr

具体如下：

1、circrna与普通rna的不同之处在于环化剪切位点(接头处)，所以要特异性的证明一种新circrna的存在，就要跨环化剪切位点设计引物。通过首尾拼接法，在primer5软件中设计跨剪切位点引物：5’-ggagtccactggcgtcttc-3’(上游引物)和gctgatgatcttgaggctgttg-3’(下游引物)，如seqidno.2和seqidno.3所示，用oligo7验证引物，在跨剪切位点的情况下，尽量确保引物不产生发夹结构、二聚体等影响结果的因素出现。

2、用qiagen的试剂盒rneasyminikit抽提一组正常人rna。

3、反转录rna(takara试剂盒，大连)，反转定量为每20μl，180ngrna。条件为37℃15分钟，85℃变性5秒，4℃保存。

4、qrt-pcrqrt-pcr用gapdh作为内参基因，25μl反应体系，扩增条件为95℃预变性3分钟；95℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸30秒，共35个循环；4℃保存。溶解曲线如图1a所示，可见溶解曲线光滑无杂峰，说明引物较好，qrt-pcr产物单一，初步证明了circptpn22可能存在。

c.将qrt-pcr产物与引物送去进行测序(sanger测序，invitrogen)，sanger测序的结果如图1b所示。将sanger测序结果与rna-seq的数据用blast对比，在可信区域内完全匹配，可认为circptpn22真实存在。

实施例2circptpn22可以为sle的标志物之一

a.收集sle病人，健康体检者的外周血5ml，分离pbmcs，提取rna；

b.qrt-pcr大规模验证病人与正常人中circptpn22的表达情况；

c.用分析软件cfxmanager与spss22.0分析circptpn22与sle的相关性。

具体如下：

1、大规模收集健康人与sle病人的外周血(每人5ml)，edta真空抗凝管收集(bd公司，美国)。

2、吸取外周血，缓慢加入已加入淋巴细胞分离液(3ml，天津灏洋)的离心管中，保持液面分界线明显，2000r/min离心20分钟，缓慢取出，吸取中间白膜层至另一新的离心管中，加入pbs(biosharp)5ml，1000r/min离心5分钟，倒掉pbs，得到纯净的pbmcs细胞。

3、按照说明书，用rneasyminikit抽提rna后冻于-80℃。

4、当收集到一定数量时按照说明书进行逆转录与qrt-pcr。逆转录试剂盒(takara，大连)，每人一管，按照说明书采用40μl反转录体系，条件为37℃15分钟，85℃变性5秒，4℃保存。程序完成后拿出，放入-20℃长期冻存。qrt-pcr用gapdh作为内参，扩增条件为95℃预变性3分钟；95℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸30秒，共40个循环；4℃保存。

5、收集病人的详细信息，包括年龄性别等基本信息和本次住院前疾病活动度等特异性信息以及血常规，尿常规，自身抗体谱等检查检验数据，并对病人进行sledai评分(以sledai-2000标准进行)。

6、以sledai分数的高低进行病人的分组，0-4分为基本无活动组，5-9分为中度活动组，>10分为重度活动组。

7、以sle病人的评分分组，进行数据的归类总结，结果显示circptpn22可以作为一个疾病活动的标志物(图2，图3)。

最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

序列表

<120>circptpn22及其作为系统性红斑狼疮标志物的应用

<160>3

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1429

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

gaaactcgaactatctaccagtttcattacaagaattggccagaccatgatgtaccttca60

tctatagaccctattcttgagctcatctgggatgtacgttgttaccaagaggatgacagt120

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<210>2

<211>19

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

ggagtccactggcgtcttc19

<210>3

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

gctgatgatcttgaggctgttg22