本发明属于从天然原料中提取功能性生物大分子物质以生产功能性保健食品领域，具体涉及一种甘薯茎蛋白的提取方法。
背景技术：
：：甘薯的茎一般称作甘薯的藤或蔓。不同品种的甘薯茎的长短有很大的差异，最短的仅有0.7米，最长则可达到7米以上。甘薯茎有增强人体免疫力、提高抗病能力的功效，同时它还具有促进新陈代谢、抗氧化等作用。甘薯茎中90％左右都是水，且富含多种维生素，可以起到镇静皮肤、抗氧化、促进新陈代谢的作用，因此经常食用甘薯茎有抗衰老的效果。甘薯茎中含有丰富的膳食纤维，能够加快肠胃蠕动，有助于人体的消化，同时，甘薯茎的热量较低，也是很好的减肥食品。另外，目前我国甘薯研究现状是“叶多茎少”，甘薯在我国种植极其广泛，其叶在南方作蔬菜食用，而在收获季节时叶子易变黄萎蔫不能食用，剩下的是大量的茎，甘薯茎富含多种营养物质，其中甘薯茎蛋白质含量高，大量丢弃造成浪费，因此开发一种高效提取甘薯茎蛋白质方的方法具有较大社会意义。技术实现要素：本发明的目的是，提供一种利用超声辅助碱提酸沉法从甘薯茎中提取蛋白的方法。本发明采用的技术方案为：一种甘薯茎蛋白的提取方法，包括如下步骤：1)将新鲜的甘薯茎烘干，粉碎过筛，得甘薯茎粉；2)按料液比1g：30-80ml，取甘薯茎粉和质量百分浓度为0.02～0.07％的亚硫酸氢钠水溶液，混合均匀，得甘薯茎粉混合溶液；3)调节甘薯茎粉混合溶液的ph为9-12后，在超声功率160-400w，超声温度30～50℃下，超声10～40min；4)将步骤3)超声后得到的溶液放入离心机中进行离心；5)将步骤4)离心后得到的上清液的ph调到等电点进行酸沉；6)搅拌后，离心；7)将步骤6)得到的沉淀物加水回溶，并将ph调回到7；8)将步骤7)得到的产物经冷冻干燥，得甘薯茎蛋白粉。进一步的，上述的一种甘薯茎蛋白的提取方法，步骤2)中，所述的料液比为1g：40ml。进一步的，上述的一种甘薯茎蛋白的提取方法，步骤2)中，所述的亚硫酸氢钠水溶液的浓度为0.05％。进一步的，上述的一种甘薯茎蛋白的提取方法，步骤3)中，调节甘薯茎粉混合溶液的ph为10。进一步的，上述的一种甘薯茎蛋白的提取方法，步骤3)中，超声功率280w，超声温度30℃，超声时间25min。进一步的，上述的一种甘薯茎蛋白的提取方法，步骤4)中，离心条件是6000转/min、离心30min。进一步的，上述的一种甘薯茎蛋白的提取方法，步骤5)中，调节上清液的ph＝4。进一步的，上述的一种甘薯茎蛋白的提取方法，步骤6)中，离心条件是6000转/min、离心30min。按照上述的方法提取的甘薯茎蛋白在制备抗氧化保健品中的应用。本发明具有以下有益效果：本发明，采用碱提酸沉的方法是利用甘薯茎中大部分的蛋白质都能溶于稀碱溶液中的性质，把甘薯茎粉用稀碱溶液浸提后，经过离心分离便可除去甘薯茎中的不溶性物质。当用酸溶液把浸出液的ph调至蛋白质的等电点处时，蛋白质会由于处于其等电点而相互凝集从而生成沉淀，经高速离心便可得到蛋白沉淀物，再经过冷冻干燥便可以得到甘薯茎蛋白，而超声波能够辅助提取蛋白质，所需的提取时间更短并且提取率高。本发明操作简单，易于实现，本发明利用了超声辅助碱提酸沉法提取甘薯茎蛋白，甘薯茎蛋白提取率较高，为48.75％(预测值为51.75％)，并测得所得蛋白质纯度为46.27％，试验结果比较理想。因此，本方法的甘薯茎蛋白提取率显著优于传统的碱提酸沉法；本方法还利用响应面法优化提取条件、以提高产品的提取率，简化提取工艺。此外，还对所得甘薯茎蛋白进行了单因素测定、响应面试验优化、回归模型方差分析与各因素交互作用的响应面分析，更系统的评价了所得甘薯茎蛋白的特点与功能。附图说明图1为本发明方法中料液比对甘薯茎蛋白提取率的影响。图2为本发明方法中碱提ph对甘薯茎蛋白提取率的影响。图3为本发明方法中超声功率对甘薯茎蛋白提取率的影响。图4为本发明方法中超声温度对甘薯茎蛋白提取率的影响。图5为本发明方法中超声时间对甘薯茎蛋白提取率的影响。图6为本发明方法中酸沉ph对甘薯茎蛋白提取率的影响。图7为本发明方法中超声时间和超声温度响应面分析图。图8为本发明方法中超声时间和超声温度响应面相应等高图。图9为本发明方法中超声温度和超声功率响应面分析图。图10为本发明方法中超声温度和超声功率响应面相应等高图。图11为不同浓度的本发明方法提取甘薯茎蛋白、抗坏血酸对羟基自由基清除率。图12为不同浓度的本发明方法提取甘薯茎蛋白、抗坏血酸对超氧阴离子清除率。图13为不同浓度的本发明方法提取甘薯茎蛋白、抗坏血酸对dpph自由基清除率。具体实施方式下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但不受实施例的限制。实施例1(一)一种甘薯茎蛋白的提取方法包括如下步骤：1)将新鲜的甘薯茎烘干，粉碎过筛，得甘薯茎粉；2)按料液比1g：30～80ml，取甘薯茎粉和质量百分浓度为0.05％的亚硫酸氢钠水溶液，混合均匀，得甘薯茎粉混合溶液；3)碱提：调节甘薯茎粉混合溶液的ph为9～12后，在超声功率160～400w，超声温度30～50℃下，超声10～40min；4)将步骤3)超声后得到的溶液放入离心机中，6000转/min、离心30min；5)酸沉：将步骤4)离心后得到的上清液的ph调到4～5，进行酸沉；6)搅拌后，于6000转/min、离心30min；7)将步骤6)得到的沉淀物加水回溶，并将ph调回到7；8)将步骤7)得到的产物经冷冻干燥，得甘薯茎蛋白粉。(二)单因素试验设计分别考察影响甘薯茎蛋白提取率的主要因素，即料液比、碱提ph、超声功率、超声温度、超声时间、酸沉ph为探索适宜的工艺参数依次做单因素实验。1、料液比对提取率的影响：方法同(一)，设定碱提ph为10，酸沉ph为4.5，超声功率200w，超声温度40℃，超声时间40min，只是改变步骤2)的料液比分别为：1:10、1:20、1:30、1:40、1:50、1:60、1:70、1:80g/ml。从图1中可以看出，甘薯茎中的蛋白质的提取率随着料液比的增加而增加，其增速先快后慢。在料液比为1:10时，蛋白质的提取率最低，为33.73％，此后随着料液比的增加，蛋白质提取率也增加，在料液比为1:40时，提取率达到43.05％，这是由于在料液比较低时，甘薯茎粉得不到充分的溶解，因此蛋白质的溶出速率也较低。随着提取液的量的增加，稀释作用变强，提取液的粘度降低，蛋白质的浓度也降低，蛋白质的溶出量增加，从而使提取率增加。当料液比大于1:40时，溶液的粘度以及蛋白质的浓度都很低，随着溶液的稀释，蛋白质的溶解增加作用不再显著，因此，蛋白质提取率的增加变得缓慢。综上所述，以及结合经济方面因素，选择1g:40ml为最佳的料液比2、碱提ph对提取率的影响：方法同(一)，设定料液比为1:30g/ml，酸沉ph为4.5，超声功率200w，超声温度40℃，超声时间40min，只是改变步骤3)的碱提ph分别为7.0、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0、11.5、12.0。从图2中可以看出，甘薯茎蛋白随着碱提ph值的增加，提取率先升高后降低。在ph为7～10时，甘薯茎的蛋白质提取率随着ph值的增加而升高，当ph＝10时提取率达到最大值，为42.15％。这是由于碱液能使细胞自身的紧密结构变得疏松，破坏蛋白质的氢键，使蛋白质分子表面带同种电荷，从而提取率升高。当ph大于10时，由于碱性过度引起了脱羧、脱氨和肽键的断裂，导致蛋白质变性和过度水解，同时提取物中的非蛋白质物质含量增加，蛋白质提取率降低。因此选取ph＝10为最佳的碱提ph。3、超声功率对提取率的影响：方法同(一)，设定料液比为1:30g/ml，碱提ph为10，酸沉ph为4.5，超声温度40℃，超声时间40min，只是改变步骤3)的超声功率分别为160、240、320、400w。由图3中可以看出，随着超声功率的增加，甘薯茎蛋白的提取率先升高后降低，而后又有小幅上升，故选择240w为最佳超声功率。4、超声温度对提取率的影响：方法同(一)，设定料液比为1:30g/ml，碱提ph为10，酸沉ph为4.5，超声功率200w，超声时间40min，只是改变步骤3)的超声温度分别为20℃、30℃、40℃、50℃。由图4可以看出，随着超声温度的升高，蛋白质质量增加，但是随温度升高蛋白质纯度先升高后降低，推测多糖等物质也因超声而沉淀析出，因此选择40℃时为最佳超声温度。5、超声时间对提取率的影响：方法同(一)，设定料液比为1:30g/ml，碱提ph为10，酸沉ph为4.5，超声功率200w，超声温度40℃，只是改变步骤3)的超声时间分别为10、20、30min。由图5可以看出，随着超声时间的增加，甘薯茎蛋白的提取率先升高后降低。当超声时间小于20min时，超声波空化作用强，使细胞破碎程度增大，加速了细胞内蛋白质的溶出，当时间超过20min时，随着时间的延长部分蛋白质变性，甘薯茎粉颗粒表面对蛋白的吸附力增强，使蛋白质溶出量下降。因此选择20min为最佳超声时间。6、酸沉ph对提取率的影响：方法同(一)，设定料液比为1:30g/ml，碱提ph为10，超声功率200w，超声温度40℃，只是改变步骤5)的酸沉ph调到3.0、3.5、4.0、4.5、5.0。由图6可以看出，随着ph的增加，甘薯茎蛋白的提取率先升高后降低，在ph等于4时，蛋白质提取率达到最大，为43.27％，这是因为蛋白质颗粒在等电点时溶液中不存在同种电荷的相互排斥作用，容易发生相互碰撞而沉淀。(三)超声协同碱提酸沉工艺的响应面优化及分析利用design-expert8.0.6软件，根据单因素试验结果，选取超声时间(a)、超声温度(b)和超声功率(c)三个对蛋白质得率影响较大的因素为变量，蛋白质得率为响应值，从而得到提取甘薯茎蛋白的最优提取条件。试验设计因素水平见表1。表1表1box-behnken试验设计因素水平table1factorsandlevelsusedinbox-behnkendesign根据单因素试验结果，选取合理的因素和水平进行响应面试验，确定最佳的提取条件。甘薯茎蛋白提取的box-benhnken试验结果见表2。(1)试验设计结果表2box-behnken试验设计结果table2box-behnkendesignwithexperimentalresults(2)回归模型方差分析表3响应面试验回归模型方差分析table3analysisofvarianceforthefittedregressionmodel注：**为差异极显著(p＜0.01)，*为差异显著(p＜0.05)。利用设计软件design-expert对数据进行多元回归拟合，获得超声时间(a)、超声温度(b)、超声功率(c)的二次回归方程为：y＝+3.29+0.11a-0.34b-0.039c-0.045ab+0.035ac-0.072bc-0.22a2-0.11b2-0.014c2从上表中可以看出，模型的p<0.0001，模型显著，失拟项p＝0.1579，失拟项不显著。由f值的大小可以看出各因素影响结果的主次顺序为b(超声温度)>a(超声时间)>c(超声功率)。模型的确定系数为r2＝0.9840，表明模型能够解释绝大多数因变量变化。综上所述，模型拟合良好，模型成立。(3)各因素交互作用分析为了对超声时间(a)、超声温度(b)以及超声功率(c)三者之间的交互作用进行更进一步的探究，并确定最优点，对得到的模型使用降维法，得到两种因素的回归模型，并通过design-expert8.0软件绘制出响应面曲线图，以便进行更直观的分析。图7-10分别显示了2组以甘薯茎蛋白提取率为响应值的趋势图，从图中可以直观地看出两变量交互作用的显著程度。图7-图10，直观的反映出了各个因素之间的交互作用对响应值的影响。从图7可知，当超声时间一定时，甘薯茎蛋白的提取率随着超声温度的增加先增加后减少，当超声温度一定时，随着超声时间的增加，提取率呈上升趋势。从图8等高线的图形和疏密程度可知，超声时间和超声温度的交互作用明显，超声温度对提取率的影响稍大于超声时间。从图9可知，当超声功率一定时，随着超声温度的增加，甘薯茎蛋白的提取率减少，由图10等高线的形状及其疏密程度可知，超声温度和超声功率的交互作用较显著，超声温度对甘薯茎蛋白的提取率的影响大于超声功率的影响。通过design-expert8.0软件对回归方程进行分析，得到甘薯茎蛋白提取的最佳工艺参数为超声时间25min、超声温度30.0℃、超声功率280w，此条件下甘薯茎蛋白的理论提取率为51.75％。综上得出，最佳甘薯茎蛋白提取工艺是：料液比1g:40ml，碱提ph为10，超声功率280w，超声温度30℃，超声时间25min，酸沉ph4.0。实施例2甘薯茎蛋白抗氧化性质的测定(一)甘薯茎蛋白制备1)将新鲜的甘薯茎烘干，进行打粉过筛，得到甘薯茎粉；2)按料液比1g：40ml，取甘薯茎粉和质量百分浓度为0.05％的亚硫酸氢钠水溶液混合均匀，得甘薯茎粉混合液；3)碱提：用1mol/l的氢氧化钠调节甘薯茎粉混合液的ph等于10后，进行超声，超声温度为30℃，超声时间25min，超声功率280w；4)将步骤3)超声后得到的溶液放入离心机中，于6000r/min，离心30min；5)酸沉：将步骤4)离心后得到的上清液的ph调到等电点进行酸沉，酸沉ph为4；6)将步骤5)酸沉后得到的溶液搅拌一段时间后，于6000r/min，离心30min；7)将步骤6)离心后得到的沉淀物加水回溶，并将ph调回到7；8)经冷冻干燥后即可得到甘薯茎蛋白粉，提取率为48.75％，纯度为46.27％。(二)抗氧化活性测定(1)羟基自由基清除率羟基自由基被认为是最有害的活性氧自由基，它们会影响细胞中的生物大分子活性。因此，清除羟基自由基对生命系统的保护非常重要。甘薯茎蛋白、抗坏血酸的羟基自由基清除效果如图11所示。由图可知甘薯茎蛋白对于羟基自由基有一定的清除能力，随着溶液浓度的升高清除率有上升趋势，但清除能力总体较低，在样品溶液浓度在0.1-2mg/ml范围内均远低于vc溶液。蛋白样品羟基自由基清除率随浓度增加的增幅较小，在浓度从0.1mg/ml增加到1.25mg/ml，清除率增加了25％左右，而vc的清除率增加了95％左右。根据实验结果，有理由认为甘薯茎蛋白在清除羟基自由基中起着一定的作用。(2)超氧阴离子清除率过度生产超氧化物阴离子自由基被认为是细胞内活性氧积累的开始，会导致氧化还原状态失衡，还会导致相关得有害生理后果。因此，清除超氧化物阴离子自由基是非常重要的。不同浓度的甘薯茎蛋白、抗坏血酸的清除效果如图12所示。由图可知，蛋白样品表现出较高的清除能力，且随着浓度的增加，清除率增加显著。在浓度从0.1mg/l增加到0.75mg/l，对超氧阴离子自由基的清除能力看，甘薯茎蛋白从13.91％增加到75.08％，清除效果较理想。据报道，清除超氧化物阴离子的机制可能o-h键的离解能有关，也就是说，大量吸附于甘薯茎蛋白的吸电子基团可能导致o-h键离解变弱。这可能是由于葡萄糖醛酸或半乳糖醛酸中存在的酮或醛导致的。(3)dpph自由基清除率清除dpph自由基是一种广泛使用的评估化合物自由基清除能力性质的模型方法。不同样品在不同浓度下清除dpph自由基的测量结果如图13所示。从图13可以看出，各组样品对dpph的清除能力与样品溶液浓度有一定相关性，随着样品浓度的增加清除能力呈上升趋势，但当浓度大于0.75mg/ml时，清除率的增幅趋于平缓。当浓度为2mg/ml时，蛋白样品和vc的清除率均达到峰值，具体清除率大小为：vc(95.49％)>蛋白样品(66.15％)。此外，dpph自由基清除的效果受很多因素的影响。据报道，当dpph自由基遇到如抗氧化剂等物质时，自由基清除效果和吸光度值将会降低。当前第1页12当前第1页12