本发明涉及一种花生白绢病的抗性鉴定方法。
背景技术
花生是我国重要的油料作物之一，种植面积居全国第二，仅次于油菜，具有重要的经济价值。花生白绢病是由齐整小菌核属(sclerotiumrolfsiisacc.)引起的一种土传真菌性病害，花生各个时期均可受到白绢病菌的侵染，在我国主要花生产区均有发生，且为害逐年加重，对花生的产量及质量造成严重的影响，给种植户造成了严重的经济损失。
花生白绢病菌可以菌核或菌丝在病残体和土层中越冬，通过土壤、水流、昆虫及带菌种子传播。目前，我国花生白绢病缺乏有效的防控措施，花生白绢病及推广被认为是防治花生白绢病最经济有效且绿色环保的方法。而稳定可靠的抗性鉴定方法成为筛选抗病品种的关键。现有的花生白绢病抗性鉴定方法主要是室内鉴定，由于花生的室内生长环境与花生的实际大田生长环境并不一致，导致其抗性鉴定结果，与实际大田生长的抗性表现偏差大，不能为抗病品种的筛选和育种，提供可靠、准确的抗性鉴定依据。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种花生白绢病的大田接种抗性鉴定方法，该方法对不同品种的抗性鉴定结果具有可比性，且与实际大田生长的抗性表现偏差小，能为抗病品种的筛选和育种，提供更可靠、更准确的抗性鉴定依据。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是，1、一种花生白绢病的大田接种抗性鉴定方法，其步骤为：
a、菌种的制备、保存：
将200-220份重的马铃薯、18-22份重的葡萄糖、15-18份重的琼脂粉、1000份重的蒸馏水混匀，经121℃高温高压灭菌15-30分钟，冷却后得到马铃薯葡萄糖琼脂培养基；
将白绢病菌菌株(sclerotiumrolfsiisacc.)在马铃薯葡萄糖琼脂培养基中进行培养，得到分离纯化的花生白绢病菌株；再将花生白绢病菌株转接到马铃薯葡萄糖琼脂试管培养基中，27-29℃培养至长满，即得到花生白绢病菌种，随后将花生白绢病菌种4℃保存、待用；
b、大田花生播种：
在大田播种待鉴定抗性的品种的花生，每个待鉴定抗性的品种的花生播种25-30粒花生种仁，以条播的形式进行单粒播种，每颗种仁间隔18-23厘米；
c、接种体的制备：
播种后，不使用杀菌剂；播种后10-12天，用接种针将a步保存的花生白绢病菌种，接种到直径9厘米的马铃薯葡萄糖琼脂平板培养基中，27-29℃培养至长满培养基；再用接种刀划成0.5×0.5厘米大的菌块，然后用接种针将一块菌块接种在一个马铃薯葡萄糖琼脂平板培养基中央，在27-29℃的温度下，黑暗培养4天，获得一个花生白绢病菌接种体；
d、接种液的制备：
将20-23个c步得到的花生白绢病菌接种体置于匀浆机中，加水后高速搅拌，制成匀浆；再将匀浆倒入到容器中，加水定容到15升并搅拌均匀，获得花生白绢病的接种液；
e、大田花生幼苗的接种：
将d步得到的花生白绢病的接种液，按照45-55毫升/株的量，浇灌于花生基部；
f、抗性鉴定：
花生生长过程中，不使用杀菌剂；接种60-70天后，进行白绢病发病情况调查；得到待鉴定抗性的品种的的花生的病情指数，实现对待鉴定抗性的品种的抗性鉴定。
本发明接种用的白绢病菌菌株(sclerotiumrolfsiisacc.)为已知菌株。植保工作者均可以从已感染花生白绢病的花生病株上分离得到。如申请人即是通过这种方式得到的：
从成都青白江花生田块中采集得到花生白绢病株，收集发病部位产生的白绢菌核，置于用75％的酒精中浸泡30秒，随后转入1％的次氯酸钠溶液中浸泡1分钟，最后用无菌水冲洗3次，将表面消毒好的白绢菌核转到带有灭菌滤纸的培养皿中，置于超净台上风干，随后接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基中，28℃黑暗培养；待菌丝长满后，用药勺将培养基表面的菌丝刮下，置于研钵中，加入液氮研磨成粉末，然后用真菌dna提取试剂盒提取菌丝dna；利用真菌dnaits区间通用引物its1和its4对上述提取的基因组dna进行扩增并测序，对测序结果进行blst，鉴定得到白绢病菌株。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
一、本发明采用的花生白绢病菌种来源一致，培养、接种条件相同，接种时间相同(播种后10-12天)；接种的菌种数量相同，对不同品种的抗性鉴定结果可比性好。
二、鉴定结果更准确、可靠：与传统的温室接种方法相比，本发明的方法在实际的大田生长环境下对花生品种进行接种、生长；能更准确、真实地反应出不同花生品种对白绢病菌的抗性水平，更容易避免筛选到假抗的花生品种，能为抗病品种的筛选和育种，提供更可靠、更准确的抗性鉴定依据。
三、本发明的方法操作简单、便捷：与传统的菌丝块贴茎接种法、碎叶接种法、菌核贴茎接菌法相比，本发明的方法接种操作简单，接种后不需要额外的保温保湿，在自然条件下实现花生白绢病的抗性鉴定，对接种人员的专业技术要求不高，适应性广。
下面结合实施例对本发明进一步的详细说明。
具体实施方式
实施例1
一种花生白绢病的大田接种抗性鉴定方法，其步骤为：
a、菌种的制备、保存：
将200份重的马铃薯、20份重的葡萄糖、15份重的琼脂粉、1000份重的蒸馏水混匀，经121℃高温高压灭菌20分钟，冷却后得到马铃薯葡萄糖琼脂培养基；
将白绢病菌菌株(sclerotiumrolfsiisacc.)在马铃薯葡萄糖琼脂培养基中进行培养，得到分离纯化的花生白绢病菌株；再将花生白绢病菌株转接到马铃薯葡萄糖琼脂试管培养基中，27℃培养至长满，即得到花生白绢病菌种，随后将花生白绢病菌种4℃保存、待用；
b、大田花生播种：
在大田播种待鉴定抗性的品种的花生，每个待鉴定抗性的品种的花生播种25粒花生种仁，以条播的形式进行单粒播种，每颗种仁间隔20厘米；
c、接种体的制备：
播种后，不使用杀菌剂；播种后11天，用接种针将a步保存的花生白绢病菌种，接种到直径9厘米的马铃薯葡萄糖琼脂平板培养基中，28℃培养至长满培养基；再用接种刀划成0.5×0.5厘米大的菌块，然后用接种针将一块菌块接种在一个马铃薯葡萄糖琼脂平板培养基中央，在28℃的温度下，黑暗培养4天，获得一个花生白绢病菌接种体；
d、接种液的制备：
将20个c步得到的花生白绢病菌接种体置于匀浆机中，加水后高速搅拌，制成匀浆；再将匀浆倒入到容器中，加水定容到15升并搅拌均匀，获得花生白绢病的接种液；
e、大田花生幼苗的接种：
将d步得到的花生白绢病的接种液，按照50毫升/株的量，浇灌于花生基部；
f、抗性鉴定：
花生生长过程中，不使用杀菌剂；接种65天后，进行白绢病发病情况调查，得到待鉴定抗性的品种的的花生的病情指数；实现对待鉴定抗性的品种的抗性鉴定。
实施例2
一种花生白绢病的大田接种抗性鉴定方法，其步骤为：
a、菌种的制备、保存：
将220份重的马铃薯、22份重的葡萄糖、18份重的琼脂粉、1000份重的蒸馏水混匀，经121℃高温高压灭菌30分钟，冷却后得到马铃薯葡萄糖琼脂培养基；
将白绢病菌菌株(sclerotiumrolfsiisacc.)在马铃薯葡萄糖琼脂培养基中进行培养，得到分离纯化的花生白绢病菌株；再将花生白绢病菌株转接到马铃薯葡萄糖琼脂试管培养基中，29℃培养至长满，即得到花生白绢病菌种，随后将花生白绢病菌种4℃保存、待用；
b、大田花生播种：
在大田播种待鉴定抗性的品种的花生，每个待鉴定抗性的品种的花生播种30粒花生种仁，以条播的形式进行单粒播种，每颗种仁间隔23厘米；
c、接种体的制备：
播种后，不使用杀菌剂；播种后12天，用接种针将a步保存的花生白绢病菌种，接种到直径9厘米的马铃薯葡萄糖琼脂平板培养基中，29℃培养至长满培养基；再用接种刀划成0.5×0.5厘米大的菌块，然后用接种针将一块菌块接种在一个马铃薯葡萄糖琼脂平板培养基中央，在29℃的温度下，黑暗培养4天，获得一个花生白绢病菌接种体；
d、接种液的制备：
将23个c步得到的花生白绢病菌接种体置于匀浆机中，加水后高速搅拌，制成匀浆；再将匀浆倒入到容器中，加水定容到15升并搅拌均匀，获得花生白绢病的接种液；
e、大田花生幼苗的接种：
将d步得到的花生白绢病的接种液，按照55毫升/株的量，浇灌于花生基部；
f、抗性鉴定：
花生生长过程中，不使用杀菌剂；接种70天后，进行白绢病发病情况调查，得到待鉴定抗性的品种的的花生的病情指数；实现对待鉴定抗性的品种的抗性鉴定。
实施例3
一种花生白绢病的大田接种抗性鉴定方法，其步骤为：
a、菌种的制备、保存：
将210份重的马铃薯、18份重的葡萄糖、16份重的琼脂粉、1000份重的蒸馏水混匀，经121℃高温高压灭菌15分钟，冷却后得到马铃薯葡萄糖琼脂培养基；
将白绢病菌菌株(sclerotiumrolfsiisacc.)在马铃薯葡萄糖琼脂培养基中进行培养，得到分离纯化的花生白绢病菌株；再将花生白绢病菌株转接到马铃薯葡萄糖琼脂试管培养基中，28℃培养至长满，即得到花生白绢病菌种，随后将花生白绢病菌种4℃保存、待用；
b、大田花生播种：
在大田播种待鉴定抗性的品种的花生，每个待鉴定抗性的品种的花生播种27粒花生种仁，以条播的形式进行单粒播种，每颗种仁间隔18厘米；
c、接种体的制备：
播种后，不使用杀菌剂；播种后10天，用接种针将a步保存的花生白绢病菌种，接种到直径9厘米的马铃薯葡萄糖琼脂平板培养基中，27℃培养至长满培养基；再用接种刀划成0.5×0.5厘米大的菌块，然后用接种针将一块菌块接种在一个马铃薯葡萄糖琼脂平板培养基中央，在27℃的温度下，黑暗培养4天，获得一个花生白绢病菌接种体；
d、接种液的制备：
将21个c步得到的花生白绢病菌接种体置于匀浆机中，加水后高速搅拌，制成匀浆；再将匀浆倒入到容器中，加水定容到15升并搅拌均匀，获得花生白绢病的接种液；
e、大田花生幼苗的接种：
将d步得到的花生白绢病的接种液，按照45毫升/株的量，浇灌于花生基部；
f、抗性鉴定：
花生生长过程中，不使用杀菌剂；接种60天后，进行白绢病发病情况调查，得到待鉴定抗性的品种的的花生的病情指数；实现对待鉴定抗性的品种的抗性鉴定。