一种食管癌的分子标志物及其用途的制作方法

本发明涉及肿瘤分子生物学领域，具体涉及一种食管癌的分子标志物、用途，用于诊断食管癌的引物组，fxr1基因的表达抑制剂和稳定敲减fxr1基因的细胞株。
背景技术：
食管癌(esophagealcarcinoma，ec)是人类最常见的恶性肿瘤之一，全世界每年大约有40多万人死于食管癌。中国是食管癌的高发国家，也是死亡率最高的国家之一，食管癌死亡人数几乎占据了世界食管癌死亡总人数的一半。据最新癌症流行病学的数据显示，我国男性食管癌发病率居各类恶性肿瘤的第三位，女性居第五位，而死亡率男女均居第四位。由于东西方人种不同以及食管癌发病的病因学、组织学及发病机制等方面的差异，与欧美等低发地区以食管胸下段、腺癌为主要病理学类型的食管癌不同，我国食管癌病理学类型以胸中段、鳞状细胞癌为主，其中食管鳞状细胞癌(esophagealsquamouscellcarcinoma,escc)占比高达90％以上。尽管目前各国医疗科研机构对食管癌的诊断、治疗的研究都有所进展，但多数食管癌患者就诊时已经进入了食管癌中晚期，此时往往已经错过了治疗的最佳时间，导致患者的5年生存率不高，仅为20％～40％左右。然而据文献报道，食管癌早期手术治疗的5年以及10年生存率可以达到85.9％和55.6％。因此，早发现、早治疗对提高食管癌患者的生存率至关重要。目前，食管癌早期诊断的主要手段包括造影、食管脱落细胞检查、内镜检查、影像学和肿瘤标志物检查。在造影方面，x线钡餐造影是目前临床上最常用、最基本的显示食管癌病变的影像学方法，可以确定肿瘤的上、下范围，然而该法在早期食管癌检查极易出现漏诊现象。食管拉网法检测脱落细胞，简单实用、准确性高，是我国食管癌高发地区普查的首要方法，然而此法患者较为痛苦，难以普遍开展。内镜检查可以直接观察到癌肿，较直观地发现食管黏膜改变，并能钳取组织进行病理检查，是如今食管癌的主要确诊手段，然而内镜检查容易使患者产生异物感、反胃等不良反应，而且检查时间较长，患者不易接受。在影像学方面，虽然近年来影像学的广泛使用，比如ct、eus、pet等，但是这些往往具有一定的创伤性和局限性，对于早期癌症诊断还容易存在漏诊现象，而且价格偏高，这使其应用价值大打折扣。癌症的肿瘤标志物检测由于其无创性、价格的合理性，以及肿瘤标志物检测的高敏感度和高特异性，在食管癌的早期诊断和预后评估等方面具有重要的临床应用价值。因此，发现新的食管癌相关的分子标志物，对于食管癌的早发现、早治疗，提高食管癌患者的生存率、改善患者生存质量，具有重要意义。技术实现要素：因此，本发明要解决的技术问题在于提供一种与食管癌的诊断和预后相关的新的分子标志物。为此，本发明提供如下技术方案：本发明提供了一种食管癌的分子标志物，所述分子标志物为fxr1基因和/或fxr1基因的表达产物。可选地，上述的食管癌的分子标志物，所述fxr1基因的表达产物包括fxr1mrna和/或fxr1蛋白。可选地，上述的食管癌的分子标志物，所述食管癌为食管鳞癌。本发明提供了上述的食管癌的分子标志物在如下a1-a4至少一种中的用途：a1，作为食管癌的诊断标志物，或者制备用于食管癌诊断的产品；a2，作为食管癌的预后标志物，或者制备用于食管癌预后评估的产品；a3，制备用于食管癌疗效监测的产品；a4，制备治疗食管癌的药物。可选地，上述的用途，所述食管癌诊断包括食管癌远处转移诊断。本发明提供了一种用于食管癌诊断的引物组，所述引物组包括基于上述的食管癌分子标志物设计的引物。可选地，上述引物组，所述引物组包括如下引物：fxr1-f，其核苷酸序列如seqidno.1所示；fxr1-r，其核苷酸序列如seqidno.2所示。本发明提供了一种fxr1基因的表达抑制剂，所述表达抑制剂包括sirna和/或shrna。可选地，上述的表达抑制剂，所述sirna的核苷酸序列如seqidno.5-seqidno.8任一序列所示，所述shrna的核苷酸序列如seqidno.9-seqidno.12任一序列所示。本发明提供了一种载体，所述载体包括核苷酸序列如seqidno.9-seqidno.12任一序列所示的shrna。本发明提供了包含上述的载体的重组细胞或假病毒颗粒。本发明提供了上述表达抑制剂、或者上述的载体、或者上述的重组细胞或假病毒颗粒在制备治疗食管癌的药物中的用途。本发明提供了一种稳定敲减fxr1基因的细胞株，所述细胞株是以食管癌细胞为目标细胞，通过假病毒颗粒感染，获得的稳定敲减fxr1基因的食管癌细胞。本发明提供了一种构建上述的稳定敲减fxr1基因的细胞株的方法，包括以下步骤：(1)将核苷酸序列如seqidno.9-seqidno.12任一所示序列的shrna片段连接至具有抗生素抗性的病毒载体，获得重组表达载体；(2)利用重组表达载体和病毒包装质粒共转染包装细胞株，培养转染后细胞，收集培养基上清，浓缩后获得含有假病毒颗粒的病毒液；(3)利用病毒液感染食管癌细胞，然后利用抗生素进行药物筛选，获得稳定敲减fxr1基因的细胞株。可选地，上述的构建方法，所述病毒载体为慢病毒载体phblv-u6-scramble-zsgreen-puro，所述病毒包装质粒为慢病毒包装质粒，包括pspax2和pmd2g。所述慢病毒载体具有嘌呤霉素抗性。可选地，上述的构建方法，所述包装细胞株为293t细胞，所述食管癌细胞为kyse180细胞。除非有另外说明，本发明的权利要求书和说明书的术语具有下述含义：本发明权利要求书中的产品包括：通过rt-pcr、实时定量pcr、免疫检测、原位杂交、芯片或高通量测序等检测fxr1基因表达的产品；其中rt-pcr和实时定量pcr的产品包括特异性扩增fxr1基因，检测fxr1mrna水平的引物、探针；免疫检测的产品包括与fxr1蛋白特异性结合的抗体；原位杂交的产品包括与fxr1基因的核酸序列杂交的探针；芯片包括蛋白芯片和基因芯片，其中蛋白芯片包括与fxr1蛋白特异性结合的抗体，基因芯片包括与fxr1基因的核酸序列杂交的探针。本发明权利要求书中的药物包括：抑制fxr1基因表达、诱导转录后基因沉默、抑制fxr1蛋白活性或者降解fxr1基因、mrna或蛋白的化合物、生物活性物质或基因治疗药物等。其中生物活性物质包括蛋白、多肽、脂类等等。基因治疗药物包括sirna、mirna、shrna或者包括上述小分子的载体等等。本发明技术方案，具有如下优点：1、本发明提供的一种食管癌的分子标志物，其特征在于，所述分子标志物为fxr1基因和/或fxr1基因的表达产物。脆性x染色体相关基因1(fragilex-relatedgene1，fxr1，geneid:8087)是脆性x智力迟钝相关家族中的一员，fxr1基因定位于3q26，主要分布于神经系统及肌肉组织，在肌肉组织发生发展中起重要作用。敲除fxr1基因后的小鼠及果蝇因为心肌等肌肉的缺陷在出生后不久就很快死亡。fxr1蛋白与大部分核糖体60s亚单位有关，具有在细胞核与细胞质间穿梭的生理功能。但是，目前fxr1基因在人类疾病中的作用还报道较少。本发明通过研究发现fxr1基因在食管癌组织的表达量，显著高于在食管正常组织中的表达量，说明fxr1基因的表达水平与食管癌的相关性显著，fxr1基因和/或fxr1基因的表达产物能够作为食管癌的分子标志物，为食管癌的诊断和靶向治疗提供有效信息。同时，通过cox比例风险模型分析和kaplan-meier曲线分析，发现高表达水平的fxr1基因与食管癌病人的不良预后以及食管癌的转移密切相关，fxr1基因与食管癌的发展、转移有重要关系，是影响食管癌患者总生存时间和无转移生存时间的独立因素，fxr1基因和/或fxr1基因的表达产物作为食管癌的分子标志物，能够用于诊断食管癌的远处转移，为食管癌患者的预后评估以及治疗效果的监测提供有效信息，并为其个体化治疗的选择提供依据，具有重要的临床应用价值。2、本发明提供的食管癌的分子标志物，fxr1基因的表达产物包括fxr1mrna和/或fxr1蛋白，通过检测fxr1mrna和/或fxr1蛋白，为食管癌的早期诊断、食管癌的远处转移诊断、疗效监测和预后评估提供重要的临床信息。3、本发明提供的食管癌的分子标志物，食管癌具体的为食管鳞癌，fxr1基因和/或fxr1基因的表达产物能够作为食管鳞癌诊断和治疗的分子靶点，为食管鳞癌的临床诊断、治疗提供重要信息。4、本发明提供的食管癌的分子标志物，fxr1基因和/或fxr1基因的表达产物参与食管癌的发生、发展和转移，fxr1基因和/或fxr1基因的表达产物能够作为癌症诊断、转移、分子以及预后标志物，用于制备相关的临床应用产品，以实现食管癌的早发现、早治疗，并及时对食管癌患者进行预后预测以及对食管癌的治疗效果进行监测，提高食管癌患者的生存率，改善患者生存质量。另外，fxr1基因及其表达产物还能够作为食管癌的治疗靶点，用于制备治疗食管癌的药物，辅助食管癌的临床治疗，提高癌症治疗效果。5、本发明提供的用于诊断食管癌的引物组，包括基于食管癌分子标志物设计的引物，上述的引物能够用于检测fxr1基因的表达水平，为食管癌的诊断、预后和治疗提供可靠信息。利用引物fxr1-f和fxr1-r，通过rt-pcr技术，能够实现对癌症组织、细胞中的fxr1mrna水平检测，且具有特异性、准确度高的优势。6、本发明提供的fxr1基因的表达抑制剂，包括sirna和/或shrna，sirna和/或shrna用于基因抑制时，其干扰效果好，能够有效抑制fxr1基因的表达，抑制肿瘤细胞的侵袭和转移。其中，shrna由于脱靶效应低、在细胞中稳定性高，具有重要的基因治疗的应用前景。7、本发明提供的稳定敲减fxr1基因的细胞株，通过包装连接有shrna片段的假病毒颗粒-慢病毒颗粒，并利用慢病毒颗粒感染食管癌细胞，使shrna序列插入到食管癌细胞的基因组中，转录后得到干扰rna序列，干扰rna序列通过靶向降解fxr1mrna，抑制fxr1基因表达，得到稳定敲减fxr1基因的细胞株。利用上述的细胞株，能够实现对fxr1基因功能的进一步研究，有利于揭示食管癌的发生、发展过程，为食管癌的针对性治疗提供更多的临床应用信息。附图说明为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为本发明实施例1提供的食管癌组织(tumor)和癌旁正常组织(normal)中fxr1基因表达水平的检测结果；图2a为本发明实施例2提供fxr1基因表达水平与患者总生存时间的相关性分析结果；图2b为本发明实施例2提供fxr1基因表达水平与患者无转移生存时间的相关性分析结果；图3为本发明实施例3提供的稳定敲减fxr1基因的细胞株的荧光检测结果；图4为本发明实验例1提供的稳定敲减fxr1基因的细胞株(k180-sh1)和对照组细胞株(k180-shnc)中fxr1基因的mrna表达水平的检测结果；图5为本发明实验例1提供的稳定敲减fxr1基因的细胞株(k180-sh1)和对照组细胞株(k180-shnc)中fxr1基因的蛋白表达水平的检测结果；图6为本发明实验例1提供的稳定敲减fxr1基因的细胞株(k180-sh1)与对照细胞株(k180-shnc)的细胞迁移检测结果；图7为本发明实验例1提供的稳定敲减fxr1基因的细胞株(k180-sh1)与对照细胞株(k180-shnc)的细胞侵袭检测结果；图8为本发明实验例1提供的稳定敲减fxr1基因的细胞株(k180-sh1)与对照细胞株(k180-shnc)的细胞增殖检测结果。具体实施方式以下通过具体实施例来说明本发明的实施方式，除非另外说明，本发明中所公开的实验方法均采用本
技术领域：
常规技术，所有引物合成以及测序工作由广州英骏公司完成，实施例中所用到的试剂和原料均可由市场购得。下述实施例中所有涉及的细胞均保藏于江南大学附属医院。实施例1本实施例提供一种检测食管癌组织(tumor)和癌旁组织(normal)中fxr1基因表达水平的方法，具体包括以下步骤：1、样本采集收集115例食管癌患者的食管癌组织以及食管癌旁正常组织，所有组织标本均来源于初次就诊病人，并经病理医生确诊为食管鳞状细胞癌。食管癌组织以及食管癌旁正常组织标本取自中山大学肿瘤防治中心肿瘤资源库，新鲜标本于液氮中速冻，随后保存于-80度冰箱中。2、提取组织rna(1)取肿瘤组织和肿瘤临近正常组织各50mg，分别用pbs(ph为7.4)清洗，加入1mltrizol，移入1.5mlep管中，混匀，静置5min；(2)12000rpm，4℃离心10min；(3)加入200μl氯仿，剧烈摇晃15s，静置5min；(4)12000rpm，4℃离心15min；小心将上层水相移入新的1.5mlep管中，加入等体积的异丙醇，混匀后放入-20℃下1小时；(5)12000rpm，4℃离心10min，小心弃上清；(6)加入1ml的体积浓度为75％乙醇(depc水配置)洗涤沉淀，加入乙醇后，将rna沉淀弹起漂洗；(7)12000rpm，4℃离心10min，倒出液体，剩余的少量液体短暂离心，然后用枪头吸出，注意不要吸弃沉淀；(8)室温晾干，用30μl的depc(焦碳酸二乙酯)水溶解，测浓度。2、合成cdna使用takara(codeno.rr047a)的反转录试剂盒，将步骤1中提取的rna反转录合成cdna，具体如下:(1)去除基因组dna按照表1中所示的反应体系配制反应混合液，rna样品最后加入，然后将混合体系在42℃下静置2min，去除rna中混有的基因组dna。表1去除dna的反应混合液试剂使用量5*gdnaeraserbuffer2μlgdnaeraser1μltotalrna1μgrnasefreeh2oupto10μl(2)反转录反应按照表2所示的扩增体系，在冰上配制反转录的反应液，轻柔混匀后立即进行反转录反应。在37℃的温度环境下反应60min后，提取的组织rna反转录为cdna。表2反转录扩增体系试剂使用量去除基因组dna后的反应液10.0μlprimescriptrtenzymemixi1.0μlrtprimermix1.0μl5×primescriptbuffer2(forrealtime)4.0μlrnasefreedh2o4.0μltotal20μl(3)rt-pcr检测fxr1mrna的相对表达量①以gapdh作为内参，通过rt-pcr反应检测食管癌组织(tumor)和癌旁组织(normal)中fxr1mrna的相对表达量，测定食管癌组织与正常组织中fxr1基因的表达差异。fxr1mrna的扩增引物为fxr1-f和fxr1-r，fxr1-f的核苷酸序列如seqidno.1所示，fxr1-r的核苷酸序列如seqidno.2所示；gapdhmrna的扩增引物为gapdh-f和gapdh-r，gapdh-f的核苷酸序列如seqidno.3所示，gapdh-r的核苷酸序列如seqidno.4所示；rt-pcr的反应体系如表3所示，反应条件为：预变性：95℃保持3min；变性：95℃保持30s；退火：60℃保持30s；延伸：72℃保持30s；反应进行40个循环。60℃上升至95℃，每上升0.5℃读取荧光数据一次得到pcr产物溶解曲线。表3rt-pcr的反应体系②反应结束后进行数据分析，以gapdh为内参，2-△ct法计算fxr1基因mrna的相对表达水平。食管癌组织(tumor)和癌旁正常组织(normal)中fxr1基因表达水平的检测结果如图1所示，食管癌组织中的fxr1基因的表达水平显著高于正常组织中fxr1基因的表达水平(p＜0.001)，说明fxr1基因的表达水平与食管癌的发生显著相关，fxr1基因能够作为食管癌的分子标志物，用于食管癌的诊断和靶向治疗。实施例2本实施例提供一种对食管癌患者的临床特征进行统计学分析的方法，具体包括以下内容：1、样本信息采集以实施例1中的确诊为食管鳞状细胞癌的115例患者为实验对象，患者住院时间为2004-2007年间，年龄范围从34岁至80岁，平均年龄56岁。患者的临床资料和随访资料来自于病人的住院病历资料、门诊随访记录及电话随访记录。统计115例患者的性别、年龄、肿瘤部位、局部侵犯程度(t分期)、淋巴结转移程度(n分期)、远处转移(m分期)以及病理分级信息。2、spss16.0软件(spssinc，chicago，il，usa)用于数据统计和分析。p<0.05代表统计结果有意义。采用wilcoxon检验方法和配对t检验分析患者fxr1基因表达水平的组内差异；采用卡方检验分析fxr1基因表达水平与临床病理学特征之间的相关性(表4)；kaplan-meier曲线和log-rank检验用于分析fxr1基因表达水平与患者总生存时间和无转移生存时间的相关性，分析fxr1基因的表达水平用于食管癌预后评估的价值(图2a和图2b)；采用cox回归模型进行食管癌的单因素和多因素生存分析(表5)。表4.fxr1基因表达水平与食管癌患者临床病理学特征相关性分析*p<0.05图2a表示fxr1基因的表达水平与患者生存时间的相关性，图2b表示fxr1基因的表达水平与患者无转移生存时间的相关性，由图2a和图2b可知，fxr1基因高表达的患者生存时间和无转移生存时间，明显短于fxr1基因低表达的患者，说明了fxr1基因与食管癌的发生、发展和转移密切相关，fxr1基因是一种良好的癌症预后指标。通过检测fxr1基因表达，能够用于评估食管癌患者预后、提示患者生存时间，监测癌症治疗效果，及时对癌症的临床治疗策略进行调整，有利于进一步提高临床治疗效果，改善患者生存质量。表4显示fxr1基因表达水平与食管癌患者临床病理学特征相关性分析，由表4可知，fxr1基因表达水平与食管癌患的远处转移显著相关，检测fxr1基因表达能够用于诊断食管癌患者的远处转移。表5显示食管癌的单因素和多因素cox回归模型分析结果，由表5可知，fxr1基因的表达能够作为食管癌预后的独立因素，可用于患者预后评估、生存时间预测以及疗效评估等。实施例3本实施例提供一种稳定敲减fxr1基因的细胞株的构建方法，细胞株具体的为kyse180人食管癌细胞株，构建过程中使用的载体phblv-u6-scramble-zsgreen-puro、pspax2和pmd2g均由汉恒生物公司获取，构建方法包括以下步骤：1、设计合成shrna以fxr1基因的四个转录本(nm_001013438.2、nm_001013439.2、nm_001363882.1、nm_005087.3)为分子靶标，设计能够同时靶向四个mrna的shrna序列。首先，设计sirna靶点，sirna靶点包括sirna1、sirna2、sirna3和sirna4，sirna1的核苷酸序列如seqidno.5所示，sirna2的核苷酸序列如seqidno.6所示，sirna3的核苷酸序列如seqidno.7所示，sirna4的核苷酸序列如seqidno.8所示。根据上述的sirna靶点序列得到shrna1、shrna2、shrna3和shrna4，shrna1的核苷酸序列如seqidno.9所示，shrna2的核苷酸序列如seqidno.10所示，shrna3的核苷酸序列如seqidno.11所示，shrna3的核苷酸序列如seqidno.12所示。2、构建慢病毒重组表达载体(1)根据步骤1设计的shrna序列，设计合成shrna双链片段的引物，引物序列具体如表6所示：表6shrna合成引物引物序列shrna1-f其核苷酸序列如seqidno.13所示shrna1-r其核苷酸序列如seqidno.14所示shrna2-f其核苷酸序列如seqidno.15所示shrna2-r其核苷酸序列如seqidno.16所示shrna3-f其核苷酸序列如seqidno.17所示shrna3-r其核苷酸序列如seqidno.18所示shrna4-f其核苷酸序列如seqidno.19所示shrna4-r其核苷酸序列如seqidno.20所示引物退火形成形成带粘性末端的双链片段，退火的反应体系为：10xbuffer,2μl；tris-cl(ph7.5)100mm；nacl1m；edta10mm；shrna-r/shrna-f，1/1μl；h2o，16μl。反应程序为：95℃保持10min；75℃保持10min；55℃保持10min；35℃保持10min；15℃保持10min。双链片段5’端的粘性末端为bamhi酶切位点，3’端的粘性末端为ecori酶切位点。(2)使用限制性内切酶bamhi和ecori对慢病毒载体phblv-u6-scramble-zsgreen-puro进行酶切，然后连接慢病毒载体与步骤(1)中带有粘性末端的双链shrna片段，分别得到连接有shrna1、shrna2、shrna3和shrna4的重组表达载体phblv-u6-shrna1-zsgreen-puro、phblv-u6-shrna2-zsgreen-puro、phblv-u6-shrna3-zsgreen-puro和phblv-u6-shrna4-zsgreen-puro。连接反应体系为：shrna双链片段，1μl；酶切后载体，100-200ng；ligasebuffer，2μl；t4ligase，1μl；h2o，补齐至20μl。连接条件为：16℃过夜。(3)将连接shrna片段后的载体转化dh5α感受态细菌，涂布37℃的氨苄抗性的lb平板培养基，培养过夜。次日挑取单菌落接种于含5ml，100μg/mlampicillin抗性的lb培养液中，250rpm，37℃恒温摇床培养14小时，用小量质粒抽提试剂盒抽提质粒，并用bamhi和ecori酶切鉴定，将酶切鉴定正确的重组克隆送测序验证，测序结果正确的质粒为构建成功的慢病毒重组表达载体。3、慢病毒包装(1)采用含10％胎牛血清(购自invitrogen)的dmem培养基(购自invitrogen)培养293t细胞，细胞密度生长至约50％-60％汇合率时进行病毒的共转染。共转染的质粒包括病毒包装质粒pspax2、pmd2g，以及重组表达载体(phblv-u6-shrna1-zsgreen-puro、phblv-u6-shrna2-zsgreen-puro、phblv-u6-shrna3-zsgreen-puro和phblv-u6-shrna4-zsgreen-puro中的至少一种)，转染使用lipofitertm转染试剂(购于汉恒生物)。(2)转染后更换含10％胎牛血清fbs的新鲜完全培养基，如果在当天上午进行转染，转染后6h进行换液，如果当天下午进行转染，转染后第二天早上约转染后16h进行换液。(3)转染后48h和72h分别两次收集病毒上清液(48h收集后置换新鲜完全培养基)。在48h收毒时，将100mm培养皿中的培养基倒入50ml离心管中，注意培养皿壁不要接触离心管口，以防出现细菌污染，随后补入10ml含10％胎牛血清fbs的新鲜完全培养基，平稳置于37℃，5％co2的恒温培养箱中继续培养。在72h收毒时，直接将100mm培养皿中的培养基倒入50ml离心管中，同样注意培养皿壁不要接触离心管口，以防出现细菌污染。将50ml离心管中的病毒上清，4℃，3000rpm，10min，去除细胞碎片；然后收集病毒原液上清置于超速离心管中，4℃，25000rpm，离心120分钟，获得浓缩后的病毒液。3、感染目标细胞，得到稳定敲减fxr1基因的细胞株(1)采用含10％胎牛血清的rpmi-1640培养基(购自invitrogen)培养kyse180细胞，待细胞密度生长至约60％汇合率时进行细胞感染。采用步骤2得到的病毒液感染kyse180细胞，培养72h后，荧光显微镜下进行观察，可以观测到细胞内的绿色荧光蛋白gfp(zsgreen)的表达(图3)。以未进行基因敲减的kyse180对照组细胞(k180-shnc)作为对照，其中，未进行基因敲减的kyse180细胞是在与实施例3的相同实验条件下，以未连接shrna片段的病毒载体phblv-u6-scramble-zsgreen-puro进行包装、感染得到的对照细胞株。图3结果显示慢病毒颗粒成功感染kyse180细胞，得到了稳定敲减fxr1基因的kyse180细胞株(k180-sh1)；且细胞形态正常，死亡率较低，感染率为90％。(2)用含有终浓度为1.5μg/ml嘌呤霉素的培养基传代筛选，得到能够稳定敲减fxr1基因的细胞株，-80℃冰箱冻存备用。实验例1本实验例对实施例3中构建的稳定敲减fxr1基因的细胞株的基因敲减效果进行验证，并检测fxr1基因对食管癌细胞增殖、侵袭和转移的影响，具体内容如下：1、基因敲减效果检测(1)采用实施例1提供的pt-pcr扩增方法检测稳定敲减fxr1基因的kyse180细胞株(k180-sh1)，和未进行基因敲减的kyse180对照组细胞(k180-shnc)中fxr1基因的mrna表达水平(图4)。(2)蛋白免疫印迹法检测稳定敲减fxr1基因的kyse180细胞株(k180-sh1)和未进行基因敲减的kyse180对照组细胞(k180-shnc)中fxr1基因的蛋白表达水平(图5)：a、样品裂解：ripa裂解前，用预冷的pbs清洗细胞3次以去除残留血清，按10μl/cm2细胞生长面积加入裂解液，细胞刮刮取，4℃离心后取上清，细胞裂解物使用bradford法测定浓度。b、蛋白变性：取30μl离心后上清物与5×page电泳上样缓冲液、dtt混合，于99℃中加热5min，样品加至12％聚丙烯酰胺凝胶上样孔中。c、电泳：设定恒压100v，电泳120min。d、转膜：设定恒流250ma，转膜3h，将page胶上的蛋白转印至0.45μmpvdf膜。e、封闭：5％脱脂奶粉-pbst溶液，室温摇床封闭1h。f、一抗孵育：一抗于4℃中孵育过夜。g、洗膜：用pbst洗膜3次，每次5min。h、二抗孵育：辣根过氧化物酶标记的二抗(1/5000稀释)于室温中孵育膜45min。i、洗膜：用pbst洗膜4次，每次5min。j、化学发光：按50μl/cm2膜面积加入化学发光液，x光胶片显影后冲洗得到蛋白条带。2、细胞迁移和侵袭实验a、实验前48h以2×106/皿将肿瘤细胞接种于10cm培养皿。b、胰酶消化细胞，调整细胞浓度为2×105/ml。c、4×104和8×104个细胞(分别于200μl和400μl无血清rpmi-1640)接种于24孔小室分别进行迁移和侵袭实验，该小室底部为8ul孔径的膜，用以模仿基底膜上的孔隙，侵袭实验时膜上有预先包被的matrigel胶，用以模仿细胞外基质的胶原，小室下面为0.7ml含有10％fbs的rpmi-1640。d、细胞置于常规细胞培养条件中培养48h后，用甲醇固定5min，0.5％结晶紫染色1h，用自来水清洗后，用棉签去除没有迁移和侵袭的细胞。于室温晾干后，于光学显微镜下(200x)随机选取5个视野计算迁移、侵袭细胞数。3、细胞增殖实验a、收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100ul,铺板使待测细胞调密度至1000-10000孔，(边缘孔用无菌pbs填充)。b、5％co2，37℃孵育，至细胞单层铺满孔底(96孔平底板),加入浓度梯度的药物,原则上，细胞贴壁后即可加药，或两小时，或半天时间，但在本实验例中采用在前一天下午铺板，次日上午加药。一般5-7个梯度，每孔100ul,设3-5个复孔。建议设5个，否则难以反应真实情况c、5％co2，37℃孵育16-48小时，倒置显微镜下观察。d、每孔加入20ulmtt溶液(5mg/ml，即0.5％mtt)，继续培养4h。若药物与mtt能够反应，可先离心后弃去培养液，小心用pbs冲2-3遍后，再加入含mtt的培养液。e、终止培养，小心吸去孔内培养液。f、每孔加入150ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪od490nm处测量各孔的吸光值。g、同时设置调零孔(培养基、mtt、二甲基亚砜)，对照孔(细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、mtt、二甲基亚砜)实验结果：图4显示稳定敲减fxr1基因的细胞株与对照细胞株中fxr1基因的mrna表达情况，由图4可知，与对照组细胞相比(mrna相对表达量>80％)，实施例3中构建的稳定细胞株中fxr1基因表达显著降低(mrna相对表达量<20％)，说明实施例3提供的细胞株中fxr1基因敲减成功，利用实施例3提供的构建方法，能够筛选得到fxr1基因稳定低表达的食管癌细胞。图5显示稳定敲减fxr1基因的细胞株与对照细胞株中fxr1基因的蛋白表达情况，由图5可知，在对照细胞株组中能够检测到表达量高的fxr1蛋白条带，而在稳定敲减fxr1基因的细胞株中，未检测到明显的fxr1蛋白条带，进一步验证了实施例3中的kyse180细胞株中成功敲减fxr1基因。图6显示稳定敲减fxr1基因的细胞株与对照细胞株的细胞迁移检测结果。由图6可知，食管癌细胞在敲减fxr1基因后，细胞的迁移能力显著降低，说明食管癌细胞的迁移与fxr1基因表达显著相关。图7显示稳定敲减fxr1基因的细胞株与对照细胞株的细胞侵袭检测结果。由图7可知，食管癌细胞在敲减fxr1基因后，细胞的侵袭能力显著降低，说明食管癌细胞的侵袭与fxr1基因表达显著相关。图8显示稳定敲减fxr1基因的细胞株与对照细胞株的细胞增殖检测结果。由图8可知，fxr1基因表达对食管癌细胞增加未产生明显影响。由图6-图8可知，fxr1基因参与食管癌的发生发展，有潜力作为临床预测食管癌侵袭转移潜能的指标，通过检测fxr1基因表达，实现对食管癌的预后评估、治疗效果监测，为食管癌的诊断和靶向治疗提供有效信息，以实现癌症的个体化治疗，提高患者的生存率和生存质量。显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。序列表<110>江南大学附属医院<120>一种食管癌的分子标志物及其用途<130>njha201800022<160>20<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>20<212>dna<213>人工序列(fxr1-f)<400>1tggtgtggttcgagtgagaa20<210>2<211>20<212>dna<213>人工序列(fxr1-r)<400>2ctgtcgcagctgttcatcaa20<210>3<211>20<212>dna<213>人工序列(gapdh-f)<400>3aaggtcatccctgagctgaa20<210>4<211>20<212>dna<213>人工序列(gapdh-r)<400>4tgacaaagtggtcgttgagg20<210>5<211>21<212>dna<213>人工序列(sirna1)<400>5cgccaggttccatttaatgaa21<210>6<211>21<212>dna<213>人工序列(sirna2)<400>6gcgaagtattcgtacgaagtt21<210>7<211>25<212>dna<213>人工序列(sirna3)<400>7gatggatggaatgactgaatctgat25<210>8<211>21<212>dna<213>人工序列(sirna4)<400>8ttctccgaacgtgtcacgtaa21<210>9<211>51<212>dna<213>人工序列(shrna1)<400>9cgccaggttccatttaatgaattcaagagattcattaaatggaacctggcg51<210>10<211>51<212>dna<213>人工序列(shrna2)<400>10gcgaagtattcgtacgaagttttcaagagaaacttcgtacgaatacttcgc51<210>11<211>59<212>dna<213>人工序列(shrna3)<400>11gatggatggaatgactgaatctgatttcaagagaatcagattcagtcattccatccatc59<210>12<211>51<212>dna<213>人工序列(shrna4)<400>12ttctccgaacgtgtcacgtaattcaagagattacgtgacacgttcggagaa51<210>13<211>65<212>dna<213>人工序列(shrna1-f)<400>13ggatccgcgccaggttccatttaatgaattcaagagattcattaaatggaacctggcgtt60ttttc65<210>14<211>66<212>dna<213>人工序列(shrna1-r)<400>14gaattcgaaaaaacgccaggttccatttaatgaatctcttgaattcattaaatggaacct60ggcgcg66<210>15<211>64<212>dna<213>人工序列(shrna2-f)<400>15ggatccgcgaagtattcgtacgaagttttcaagagaaacttcgtacgaatacttcgcttt60tttc64<210>16<211>65<212>dna<213>人工序列(shrna2-r)<400>16gaattcgaaaaaagcgaagtattcgtacgaagtttctcttgaaaacttcgtacgaatact60tcgcg65<210>17<211>72<212>dna<213>人工序列(shrna3-f)<400>17ggatccgatggatggaatgactgaatctgatttcaagagaatcagattcagtcattccat60ccatcttttttc72<210>18<211>73<212>dna<213>人工序列(shrna3-r)<400>18gaattcgaaaaaagatggatggaatgactgaatctgattctcttgaaatcagattcagtc60attccatccatcg73<210>19<211>65<212>dna<213>人工序列(shrna4-f)<400>19ggatccgttctccgaacgtgtcacgtaattcaagagattacgtgacacgttcggagaatt60ttttc65<210>20<211>65<212>dna<213>人工序列(shrna4-r)<400>20gaattcaaaaaattctccgaacgtgtcacgtaatctcttgaattacgtgacacgttcgga60gaacg65当前第1页12