用于猪流行腹泻病毒疫苗株与野毒株QRT-PCR鉴别的引物对和探针及相应试剂盒的制作方法

本发明涉及用于猪流行腹泻病毒疫苗株与野毒株qrt-pcr鉴别的引物对和探针及相应试剂盒。

背景技术

猪流行腹泻是猪流行腹泻病毒(pedv)引起的一种急性、接触性传染病，临床上主要表现为严重腹泻、呕吐和脱水等症状，而且各个日龄的猪均易感染，其中以哺乳期仔猪感染发病率高，甚至可达100％，给世界养猪业造成巨大的经济损失。

20世纪70年代，英国首次报道了该病，随后在德国、日本等全球多个国家也相继报道了该病的发生。我国自20世纪80年代开始报道有pedv的发生，随后在多个地区爆发，呈地方性和季节性流行。此外pedv与猪传染性胃肠炎病毒(tgev)、猪圆环病毒(pcv)、轮状病毒(rv)、猪嵴病毒(pkv)、猪瘟病毒(csfv)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(prrsv)感染后所引起的临床症状相似，而且无法有效的分辨感染的pedv是野毒株还是疫苗株，给疾病的流行病学与防控带来巨大的困难。

技术实现要素：

为了解决现有技术中存在的问题，能够有效区分pedv与猪传染性胃肠炎病毒(tgev)、猪圆环病毒(pcv)、轮状病毒(rv)、猪嵴病毒(pkv)、猪瘟病毒(csfv)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(prrsv)等病毒，且能够有效分辨感染的pedv是野毒株还是疫苗株，

本发明通过genbank公布的38株pedv野毒株与4株疫苗株(cv777、dr13、js2008、kc189944)的全基因组序列对比，发现在pedv的复制酶基因orf1区疫苗株有24个碱基缺失(见图1)，本申请人基于这24个碱基缺失设计引物与探针，建立起pedv野毒株与疫苗株的一步法实时荧光定量qrt-pcr的鉴别诊断方法，并初步用于检测临床样品。该探针与引物具有良好的特异性，可以快速检测出pedv野毒株与疫苗株。

本发明提供一组用于猪流行腹泻病毒疫苗株与野毒株qrt-pcr鉴别的引物对和探针，所述引物对为：

上游引物：ggtggcagatgtggctaact

下游引物：aataaaggacaaagttgcggc

野毒株探针p1：5′-fam-aggatgatggtcttaatgtagctcctgaa-bhq1-3′

疫苗株探针p2：5′-rox-tgaggctgatgatgtagagtctgaagt-bhq2-3′。

本发明提供用于猪流行腹泻病毒疫苗株与野毒株qrt-pcr鉴别的试剂盒，所述试剂盒包括权利要求1所述的引物对和探针。

作为优选，所述试剂盒中还包括2×onesteprt-pcrbufferⅲ、takaraextaqhs、primescriptrtenzymemixⅱ和模板rna。

本发明提供猪流行腹泻病毒疫苗株与野毒株qrt-pcr鉴别方法，包括以下步骤：

(1)从待检样品中提取猪流行腹泻病毒rna；

(2)使用权利要求1中所述的引物对，分别使用野毒株探针p1和疫苗株探针p2对步骤(1)提取的rna进行实时荧光定量pcr扩增；

(3)若使用野毒株探针p1时获得扩增曲线并且ct值在24以内，则待检样品为猪流行腹泻病毒野毒株；若使用疫苗株探针p2时获得扩增曲线并且ct值在33以内，则待检样品为猪流行腹泻病毒疫苗株；若均无扩增曲线或者使用野毒株探针p1时获得扩增曲线的ct值大于24，则待检样品为猪流行腹泻病毒阴性样品。

作为优选，步骤(2)中所述实时荧光定量pcr扩增时，25μlqrt-pcr反应体系为：2×onesteprt-pcrbufferⅲ12.5μl；takaraextaqhs0.5μl；primescriptrtenzymemixⅱ0.5μl；上游引物0.5μl；下游引物0.5μl；探针1μl；h2o5.5μl；模板rna4μl。

作为优选，步骤(2)中所述实时荧光定量pcr扩增反应程序：42℃5min，95℃10s95℃5s，60℃30s40个循环。

本发明将pedv的野毒株与疫苗株基因序列对比，建立猪流行腹泻病毒的一步法实时荧光定量qrt-pcr检测方法，该方法具有特异性强、灵敏度高、操作简单、时间短等特点，为猪流行腹泻的病原学与流行病学提供可靠的鉴别诊断手段。

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1为pedv野毒株与4株疫苗株碱基比对。

图2为检测pedv野毒株用探针特异性。

图3为检测pedv疫苗株用探针特异性。

图4为pedv野毒株与疫苗株混合探针p1/p2扩增结果。

图5为野毒株探针p1与引物f1/r1检测结果。

图6为疫苗株探针p2与引物f1/r1检测结果。

图7为野毒株标准质粒orf1以10倍依次稀释的检测结果。

图8为野毒株标准质粒orf1的标准曲线。

图9为疫苗株标准质粒orf2以10倍依次稀释的检测结果。

图10为疫苗株标准质粒orf2的标准曲线。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市售。

实施例1

1材料与方法

1.1pedv疫苗株(cv777)与野毒株(jx、dx、ys)(本实验室保存)。

1.2引物与探针

根据pedv的野毒株与疫苗株碱基序列对比设计引物与探针，具体见表1。

表1引物和探针

1.3病毒rna的提取

本实验方法参照takaraminibestviralrna/dnaextractionkitver.5.0试剂说明书，从肠内容物提取pedv的rna。

1.4标准质粒的制备与提取

将pedv复制酶orf1区设计引物fs2/ra2与forf/rorf，分别经一步法rt-pcr扩增pedv野毒株和疫苗株，扩增出793bp与414bp大小的pcr产物，分别连接到pmd18-tvector，转入感受态细胞并进行培养。经提取质粒并鉴定，构建成pedv野毒株标准质粒orf1和pedv疫苗株标准质粒orf2。

其中，一步法rt-pcr反应体系为：2×onesteprt-pcrbufferⅲ12.5μl；takaraextaqhs(5u/μl)0.5μl；primescriptrtenzymemixⅱ0.5μl；上游引物(25μmol/l)0.5μl；下游引物(25μmol/l)0.5μl；h2o6.5μl；模板rna4μl(takara)。

反应程序为：50℃45min,94℃2min；94℃30s，55℃30s，72℃1min,34个循环；72℃10min。

rt-pcr所用引物为：

野毒株：fs2：acactatactatcccaccg

ra2：cacccaaagatcccaaga

疫苗株：forf：caccgatcctaatctgcccg

rorf：tggaccaactctaccagcac

质粒提取方法按照axyprep质粒小量制备试剂盒说明书操作。

1.5质粒qpcr与一步法实时荧光定量qrt-pcr反应体系与程序

(1)标准质粒qpcr

标准质粒qpcr反应体系：2×supertaqmanmixture12.5μl(takara)；上游引物(10μmol/l)0.5μl；下游引物(10μmol/l)0.5μl；探针(10μmol/l)1μl；h2o8.5μl；模板质粒dna2μl(康为世纪)。

标准质粒qpcr反应程序：95℃3min，95℃5s，60℃30s，40个循环。

其中，上游引物为表1中的f1，下游引物为表1中的r1，探针为表1中的p1和p2。

(2)一步法实时荧光定量qrt-pcr

qrt-pcr反应体系：2×onesteprt-pcrbufferⅲ12.5μl(takara)；takaraextaqhs(5u/μl)0.5μl；primescriptrtenzymemixⅱ0.5μl；上游引物(10μmol/l)0.5μl；下游引物(10μmol/l)0.5μl；探针(10μmol/l)1μl；h2o5.5μl；模板rna4μl(takara)。

qrt-pcr反应程序：42℃5min，95℃10s，95℃5s，60℃30s40个循环。

其中，上游引物为表1中的f1，下游引物为表1中的r1，探针为表1中的p1和p2。1.6检测探针与引物的特异性

用pedv野毒株与疫苗株分别检测野毒株与疫苗株的探针与引物，同时含有pedv野毒株与疫苗株检测野毒株与疫苗株探针与引物。

1.7特异性实验-不同肠道病毒检测探针与引物的特异性

取猪肠道病毒(猪流行腹泻病毒野毒株与疫苗株、猪传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒、猪嵴病毒、猪圆环病毒、猪瘟病毒、猪蓝耳病毒)用同样的方法提取rna，加入反应体系，并通过1.5步骤(2)中的一步法实时荧光定量qrt-pcr验证引物与探针的特异性。1.8敏感性实验

制作pedv的标准质粒orf1(2.25×10¹⁰cospie/μl)和orf2(2.25×10¹⁰cospie/μl)，分别作为野毒株与疫苗株qpcr的标准品，计算拷贝数，并以10倍的梯度稀释标准质粒，通过qpcr来验证引物与探针的敏感性。

1.9初步样品检测验证

取50份不同地区的疑似感染pedvd的猪肠内容物或粪便样品，提取rna。经过rt-pcr扩增及产物测序和采用本发明的pedv一步法实时荧光定量qrt-pcr检测技术进行检测，验证二者方法检测结果的符合率。

2结果

2.1检测探针与引物的特异性

野毒株的探针p1与引物f1/r1只能检测出pedv野毒株，而不能检测出pedv疫苗株(如图2)。疫苗株的探针p2与引物f1/r1只能检测pedv疫苗株，而不能检测出pedv野毒株(如图3)，同时含有pedv野毒株与疫苗株的病毒rna以及引物f1/r1和探针p1/p2则能同时检测出野毒株与疫苗株(如图4)。将扩增获得的片段回收测序，经genbank数据库比较证实为pedv序列。

图2为检测pedv野毒株用探针特异性；其中，1：pedv野毒株探针p1及引物与野毒株rna；2：野毒株探针p1及引物与ddh20；3：pedv野毒株探针p1及引物和疫苗株rna；4：疫苗株探针p2及引物与ddh20。

图3为检测pedv疫苗株用探针特异性；其中，1：pedv疫苗株探针p2与引物及疫苗株rna；2：疫苗株探针p2与引物及ddh20；3：pedv疫苗株探针p2与引物及野毒株rna；4：野毒株探针p1及引物与ddh20。

图4为pedv野毒株与疫苗株混合探针p1/p2扩增结果；其中，1：pedv疫苗株与野毒株混合rna和混合探针中野毒株探针p1及引物f1/r1扩增曲线；2：pedv疫苗株和野毒株混合rna和混合探针中疫苗株探针p2及引物f1/r1扩增曲线；3：ddh20和野毒株探针p1及引物；4：ddh20和疫苗株探针p2及引物。

2.2特异性实验

实验结果表明应用本发明的一步法qrt-pcr，只有ped病毒的疫苗株与野毒株有相应的荧光曲线，其他病毒均没有，表明该引物与探针有良好的特异性(如图5，图6)。

图5为野毒株探针p1与引物f1/r1检测结果；其中，1：pedv野毒株；2：猪传染性胃肠炎病毒；3：猪轮状病毒；4：猪嵴病毒；5：猪圆环病毒；6：猪瘟病毒；7：猪蓝耳病毒；8：ddh2o。

图6为疫苗株探针p2与引物f1/r1检测结果；其中，1：pedv疫苗株；2：猪传染性胃肠炎病毒；3：猪轮状病毒；4：猪嵴病毒；5：猪圆环病毒；6：猪瘟病毒；7：猪蓝耳病毒；8：ddh2o。

2.3敏感性实验

实验结果表明：将标准质粒orf1(2.25x10¹⁰copies/μl)和orf2(2.25x10¹⁰copies/μl)分别稀释10⁸倍(约2.25×10²copies/ul)后，仍能检测到荧光信号(如图7，图9)，根据扩增结果分别构建相应的标准曲线(图8，图10)，表明最低可检测到225copies/μl的pedvrna，而野毒株能检测到2250copies/μl。

图7为野毒株标准质粒orf1以10倍依次稀释的检测结果；其中，每个梯度做三次重复。

图8为野毒株标准质粒orf1的标准曲线。

图9为疫苗株标准质粒orf2以10倍依次稀释的检测结果；其中，每个梯度做三次重复。

图10为疫苗株标准质粒orf2的标准曲线。

2.4临床样品检测结果

选取疑似50份感染pedv样品，经过rt-pcr扩增及测序结果表明阳性样品有31份，采用本发明的一步法qrt-pcr检测方法，结果发现有38份阳性样品(38份中包括了rt-pcr扩增检测出的31份)，其中野毒株38份，疫苗株0份，具体见表2。

表2

通过特异性试验、敏感性试验以及最后的检测结果可知本发明一步法实时荧光定量qrt-pcr能快速检测的猪pedv，具有良好的特异性和敏感性，便于临床使用。

实施例2

猪流行性腹泻病毒一步法实时荧光定量试剂盒的建立：

(1)上游引物为表1中的f1，下游引物为表1中的r1，探针为表1中的p1和p2。

(2)样品rna。

(3)反应体系：2×onesteprt-pcrbufferⅲ12.5μl；takaraextaqhs(5u/μl)0.5μl；primescriptrtenzymemixⅱ0.5μl；上游引物(浓度为10μmol/l)0.5μl；下游引物(浓度为10μmol/l)0.5μl；探针(浓度为10μmol/l)1μl；h2o5.5μl；模板rna4μl(takara)。

反应程序：42℃5min，95℃10s95℃5s，60℃30s40个循环。

(4)结果判定：

建立的一步法实时荧光定量rt-pcr最低可检测pedv野毒株为2250copies/ul,与阴性对照相比，样品ct值在24以内为pedv野毒株阳性，样品ct值大于24或者无上升曲线均为pedv阴性；而最低可检测疫苗株为225copies/ul，与阴性对照相比，样品ct值在33以内为pedv疫苗株阳性。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。