乌拉尔图小麦抗白粉病基因Pm60特异分子标记的开发及其应用的制作方法

本发明属于基因工程及分子生物学领域，尤其涉及乌拉尔图小麦抗白粉病基因pm60特异分子标记的开发及其应用。

背景技术

小麦白粉病是小麦的主要病害之一，严重威胁小麦的生产安全。现有的抗白粉病基因中有许多是来自小麦的近缘种属，上世纪七十年代，抗病育种开始大量利用小麦-黑麦t1bl/1rs易位系所携带的pm8基因，使得小麦大规模推广品种中的抗病基因单一，导致小麦白粉菌中对pm8基因的毒力频率迅速上升。1990-1991年我国白粉菌大流行的一个原因就是pm8基因抗病性的丧失(周阳等，2004；zhuangetal.,1993；李洪杰等，2011)。因此，通过分子标记将多个抗病基因聚合到一个材料中，是实现小麦的持久抗性的重要途径。

小麦a基因组供体乌拉尔图小麦(triticumurartu)是小麦抗病育种的重要资源，但目前为止，只有1个已克隆的小麦抗白粉病基因pm60来源于乌拉尔图小麦，并报道pm60有三种形式的等位基因pm60a(4125bp),pm60(4365bp),pm60b(4605bp)(zouetal.,2017)。但是pm60基因的特异标记未见报道，限制了乌拉尔图小麦中pm60基因的鉴定及分子标记辅助育种等工作。综上所述，开发特异的pm60基因的分子标记对于小麦抗病育种十分必要。

技术实现要素：

本发明一个目的是提供鉴定小麦白粉病抗性的成套引物。

本发明提供的成套引物，包括由引物1和引物2组成的引物对甲；

所述引物1为如下(a1)或(a2)：

(a1)序列表的序列2所示的单链dna分子；

(a2)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的dna分子；

所述引物2为如下(a3)或(a4)：

(a3)序列表的序列3所示的单链dna分子；

(a4)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的dna分子。

上述成套引物还包括由引物3和所述引物2组成的引物对乙；

所述引物3为如下(a5)或(a6)：

(a5)序列表的序列1所示的单链dna分子；

(a6)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的dna分子。

上述的成套引物中，

所述引物1和所述引物2的摩尔比为1：1；

所述引物和所述引物4的摩尔比为1：1。

本发明另一个目的是提供鉴定小麦白粉病抗性的成套引物的pcr试剂。

本发明提供的pcr试剂，包括含有上述引物对甲的pcr试剂甲。

上述pcr试剂还包括含有上述引物对乙的pcr试剂乙。

上述的pcr试剂中，

所述引物1和所述引物2在其所在所述pcr试剂中的浓度均为200nm；

或，所述引物3和所述引物4在其所在所述pcr试剂中的浓度均为200nm。

含有上述的成套引物或上述的pcr试剂的试剂盒也是本发明保护的范围。

上述的成套引物或权上述的pcr试剂或上述试剂盒在如下1)或2)中的应用也是本发明保护的范围：

1)鉴别小麦白粉病抗性；

2)制备用于小麦白粉病抗性的产品。

本发明第3个目的提供了所述试剂盒的制备方法。

本发明提供的制备方法，包括将各条引物单独包装的步骤。

本发明第4个目的是提供一种鉴别或辅助鉴别待测小麦白粉病抗性的方法。

本发明提供的方法，为如下1)或2)：

1)所示的方法，包括如下步骤：

用上述引物对甲扩增待测小麦，检测pcr扩增产物，

若得到扩增产物，则所述待测小麦为或候选为抗白粉病小麦；

若未得到扩增产物，则所述待测小麦不为或候选不为抗白粉病小麦；

2)所示的方法，包括如下步骤：

用上述引物对甲和所述引物对乙分别扩增待测小麦，检测所述引物对甲的pcr扩增产物和所述引物对乙的pcr扩增产物，

若所述引物对甲扩增得到扩增产物，或所述引物对乙扩增得到扩增产物，则所述待测小麦为或候选为抗白粉病小麦；若所述引物对甲未扩增得到扩增产物，且所述引物对乙未扩增得到扩增产物，则所述待测小麦不为或候选不为抗白粉病小麦。

上述引物对甲扩增得到的扩增产物大小为516bp(pm60a)、756bp(pm60)或996(pm60b)；

上述引物对乙扩增得到的扩增产物大小为591bp(pm60a),931bp(pm60)或1171(pm60b)。

所述待测小麦为乌拉尔图小麦或栽培一粒小麦。

本发明的实验证明，本发明找到的分子标记，其具有如下优点：特异性好，能够准确的通过pcr的方法鉴定乌拉尔图小麦中的pm60a,pm60b和pm60三种有抗病功能的基因型；扩增片段较短，适合分子标记辅助育种的应用。

附图说明

图1为乌拉尔图小麦白粉菌抗性示意图。

图2为m-pm60标记在pm60a,pm60和pm60b上的位置。

图3为pm60a,及pi662269(抗病材料)和pi662227(感病材料)扩增序列比对。

图4为利用pm60-f(2900t)和pm60-r(3465t)、pm60-f(3000t)和pm60-r(3465t)两对pm60特异标记在部分乌拉尔图小麦中扩增的pcr电泳胶图。

图5为利用pm60-f(2900t)和pm60-r(3465t)、pm60-f(3000t)和pm60-r(3465t)两对pm60特异标记在部分乌拉尔图小麦中扩增的pcr电泳胶图。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

乌拉尔图和栽培一粒小麦的pi号通过网站查询：https://www.genesys-pgr.org/zh/sel/。

8个白粉菌生理小种：e01,e05,e07,e09,e15,e18,e20,e13-10记载在如下文献中：周益林,段霞瑜,陈刚,盛宝钦,张莹.40个小麦优良品种资源的抗白粉病基因推导[j].植物病理学报,2002(04):301-305+318.高海峰,范洁茹,周益林,王锁牢,白微微,李广阔.小麦品种(系)抗白粉病基因推导及分子标记鉴定[j].植物病理学报,2017,47(03):370-379.

薛早记载在如下文献中：李根桥,房体麟,朱婕,高亮亮,李闪,解超杰,杨作民,孙其信,刘志勇.普通小麦品种brock抗白粉病基因分子标记定位[j].作物学报,2009,35(09):1613-1619.

兰考86记载在如下文献中：石闺阁.小麦品系“兰考86(79)”[j].河南农业,1996(06):8.

二芒麦记载在如下文献中：黄苗苗,孙振宇,曹世勤,贾秋珍,刘太国,陈万权.223份小麦农家品种田间抗条锈病性评价及抗病基因分子检测[j].植物保护学报,2018,45(01):90-100.

郑农17记载在如下文献中：马香花,王保林,周秋峰.高产小麦新品种郑农17的选育及栽培[j].农业科技通讯,2007(06):15-16.

京411记载在如下文献中：陈新民,何中虎,王德森,庄巧生,张运宏,张艳,张勇,夏先春.利用京411为骨干亲本培育高产小麦新品种[j].作物杂志,2009(04):1-5.

石4185记载在如下文献中：朱履宽.石4185小麦[n].农民日报,2004/10/09(006).

科农199记载在如下文献中：李俊明,张相岐,张爱民,王志国,安调过,纪军,王静.高产广适小麦新品种—科农199[j].麦类作物学报,2007(02):368。

实施例1、乌拉尔图小麦抗谱的鉴定

一、白粉菌抗性鉴定

1、利用普通小麦薛早进行白粉菌的扩繁；

2、在无菌温室种植待鉴定的乌拉尔图小麦苗，待叶片长至一叶一心时，分别接种8个小麦白粉病生理小种e01,e05,e07,e09,e15,e18,e20,e13-10；采用接菌塔，使小麦叶片充分接种白粉菌新鲜孢子。22℃，16h光照，8小时黑暗，湿度70％培养。

鉴定方法参照(liuetal.1999)，图1为乌拉尔图小麦的白粉菌抗性的鉴定示意图，其中，注：0级为免疫；0；为有过敏性坏死反应；1级为高抗；2级为中抗；3级为中感；4级为高感。

鉴定200份乌拉尔图小麦种质材料分别对8个小麦白粉病生理小种e01,e05,e07,e09,e15,e18,e20,e13-10的抗性，部分结果如表1所示。表型数据用于后续与pm60标记的关联分析中。

二、乌拉尔图小麦中pm60基因的初步筛选

对照：

利用公布的pm60转化的连锁分子标记m-pm60(m-pm60-p1：

cattaactttgagttgttgga；m-pm60-p2：cggtgatcataccagaattc)，在200份乌拉尔图小麦中进行pm60基因的初步筛选。

该标记扩增pcr产物长度为：得到1210bp为等位基因pm60a,得到1550bp为等位基因pm60,得到1790bp为等位基因pm60b(标记位置及基因结构简图详见图2)。

pcr扩增条件：genstarmix，94℃5min预变性；94℃35s，57℃35s,72℃1min45s，35循环；72℃10min。

根据pcr扩增产物片段大小信息，共筛选到9个疑似包含pm60a，5个pm60b，及38个pm60的乌拉尔图材料。

结果显示：能扩增出pm60和pm60b等位基因的乌拉尔图小麦材料对6个白粉菌生理小种均表现为0级免疫或1级高抗，而扩增出pm60a等位基因的小麦中四个材料pi538727，pi662229，pi662274，pi662227表现为感病性状，这与白粉病抗性鉴定的结果有差异(表1)。

由此可见利用m-pm60标记筛选鉴定的pm60a乌拉尔图小麦材料出现了假阳性，有必要进行pm60特异标记的开发。

三、乌拉尔图pm60特异标记的开发

对5个抗病材料pi662269,pi662251,pi428219,pi428208和01c0104213以及4个感病材料pi538727,pi662229,pi662274,pi662227的m-pm60扩增的pcr产物进行测序，经序列进行分析显示：5个抗病材料的序列一致，与pm60a相似度为100％，推测这5个抗病材料中可能为pm60a。而4个感病材料的序列一致(序列4)，与pm60a的相似度为98％，有部分snp差异(图3所示)。因此可利用这些差异进行pm60特异标记的开发。

两对分子标记为如下：

标记1，扩增的pcr产物大小为：591bp(pm60a),931bp(pm60),1171(pm60b)；：

pm60-f(2900t)ctcacagttccacactgatat(序列1)

pm60-r(3465t)ctccatcaatctcaagttcttcg(序列3)；

pcr扩增程序：genstarmix，94℃5min预变性；94℃35s，55℃35s,72℃1min10s，35循环；72℃10min；

标记2，扩增的pcr产物大小为：516bp(pm60a),756bp(pm60),996(pm60b)：

pm60-f(3000t)tgtatattaatgggtataatag(序列2)

pm60-r(3465t)ctccatcaatctcaagttcttcg(序列3)

pcr扩增体系程序：genstarmix，94℃5min预变性；94℃35s，52℃35s,72℃1min，35循环；72℃10min；

体系20ul：dna模板(50ng/20ul)、引物f(终浓度为200nm)、引物r(终浓度为200nm)、mix(1x,genstar,cat#a012-101lot#6ae01)，其余用水补齐体积。

提取表1所示的乌拉尔图的基因组dna作为模板，用上述的标记1和标记2分别进行pcr扩增。

以标记m-pm60为对照。

结果如图4和表1所示，1-5(pm60a,抗病):pi662269,pi662251,pi428219,pi428208,01c0104213-3,6-9(感病)pi538727,pi662229,pi662274,pi66222710-14(pm60b,抗病):pi428203,pi428215,pi428204,pi662230,pi42831515-22(pm60,抗病):pi428309,pi428310,pi538737,pi428276,pi428306,pi538740,pi428296,pi428288；利用pm60特异的两对分子标记在感病的乌拉尔图小麦pi538727,pi662229,pi662274,pi662227中未扩增出条带，且有扩增条带的材料均为抗病材料(表1)。

因此这两对特异的分子标记的带型能与抗病表型关联，与m-pm60标记相比有更高的特异性。此外，其扩增片段较小，能够更加明显地区分pm60a,pm60和pm60b。

同时，对筛选到的5个pm60b材料标记扩增的产物进行测序，结果显示均与pm60b有100％的相似度。

对15个筛选到带有pm60材料(pi662224，pi538737，citr17664，pi428309，pi428310，pi538742，pi428325，pi428325，pi538751，pi428254，pi428260，pi428335，pi662248，ig45292，pi428308)的标记扩增产物进行测序分析，结果显示均与pm60有100％的相似度。并且，pm60特异标记在供试的感病乌拉尔图小麦材料中均未扩增出任何条带，有扩增条带的材料均对8个小麦白粉菌生理小种均有较高的抗性(表1)。

表1乌拉尔图小麦对白粉菌不同生理小种抗性鉴定及pm60标记鉴定结果

注：

m-pm60为：现有公开的标记m-pm60-p1/m-pm60-p2；

标记1为：pm60-f(2900t)和pm60-r(3465t)；

标记2为：pm60-f(3000t)和pm60-r(3465t)；

0级为免疫；0；为有过敏性坏死反应；1级为高抗；2级为中抗；3级为中感；4级为高感。

因此，可以建立判断或辅助判断待测小麦白粉病抗性的方法，为如下1)或2)：

1)所示的方法，包括如下步骤：

用pm60-f(3000t)、pm60-r(3465t)扩增待测小麦的dna，检测pcr扩增产物，

若得到pcr扩增产物，则待测小麦含有pm60基因或其等位基因，则待测小麦为或候选为抗白粉病小麦；

若未得到pcr扩增产物，则待测小麦不含有pm60基因或其等位基因，则待测小麦不为或候选不为抗白粉病小麦；

上述pcr扩增产物为516bp(pm60a)、756bp(pm60)或996(pm60b)。

2)所示的方法，包括如下步骤：

用pm60-f(3000t)、pm60-r(3465t)、pm60-f(2900t)、pm60-r(3465t)分别扩增待测小麦的dna，检测pm60-f(3000t)和pm60-r(3465t)的pcr扩增产物和pm60-f(2900t)和pm60-r(3465t)的pcr扩增产物，

若pm60-f(3000t)和pm60-r(3465t)扩增得到目的产物，或pm60-f(2900t)和pm60-r(3465t)扩增得到目的产物，则待测小麦含有pm60基因或其等位基因，则待测小麦含有pm60基因或其等位基因，则待测小麦为或候选为抗白粉病小麦；

若pm60-f(3000t)和pm60-r(3465t)扩增和pm60-f(2900t)和pm60-r(3465t)扩增均未得到对应的目的产物，则待测小麦不含有pm60基因或其等位基因，则待测小麦不为或候选不为抗白粉病小麦；

上述pm60-f(3000t)、pm60-r(3465t)扩增的目的产物为516bp(pm60a)、756bp(pm60)或996(pm60b)。

上述pm60-f(2900t)和pm60-r(3465t)扩增的目的产物为591bp(pm60a),931bp(pm60)或1171(pm60b)。

实施例2、pm60标记判断待测小麦的白粉病抗性的应用

一、白粉菌抗性鉴定

将表2中待测栽培一粒小麦采用实施例1中的一的白粉菌抗性鉴定方法鉴定，结果如表2所示。

二、pm60标记判断待测小麦的白粉病抗性

1、利用ctab法提取表2中待测栽培一粒小麦的基因组dna。

2、pcr扩增

以表2中待测栽培一粒小麦的基因组dna为模板，分别用实施例1的一中的标记1(pm60-f(3000t)、pm60-r(3465t))和标记2(pm60-f(2900t)、pm60-r(3465t))进行pcr扩增，具体如下1)或2)：

1)所示的方法，包括如下步骤：

用pm60-f(3000t)和pm60-r(3465t)扩增待测小麦的dna，检测pcr扩增产物，

若得到pcr扩增产物，则待测小麦含有pm60基因或其等位基因，则待测小麦为或候选为抗白粉病小麦；

若未得到pcr扩增产物，则待测小麦不含有pm60基因或其等位基因，则待测小麦不为或候选不为抗白粉病小麦；

上述pcr扩增产物为516bp(pm60a)、756bp(pm60)或996(pm60b)。

2)所示的方法，包括如下步骤：

用pm60-f(3000t)和pm60-r(3465t)、pm60-f(2900t)和pm60-r(3465t)分别扩增待测小麦的dna，检测pm60-f(3000t)和pm60-r(3465t)的pcr扩增产物和pm60-f(2900t)和pm60-r(3465t)的pcr扩增产物，

若pm60-f(3000t)和pm60-r(3465t)扩增得到目的产物，或pm60-f(2900t)和pm60-r(3465t)扩增得到目的产物，则待测小麦含有pm60基因或其等位基因，则待测小麦含有pm60基因或其等位基因，则待测小麦为或候选为抗白粉病小麦；

若pm60-f(3000t)和pm60-r(3465t)扩增和pm60-f(2900t)和pm60-r(3465t)扩增均未得到对应的目的产物，则待测小麦不含有pm60基因或其等位基因，则待测小麦不为或候选不为抗白粉病小麦；

上述pm60-f(3000t)和pm60-r(3465t)扩增的目的产物为516bp(pm60a)、756bp(pm60)或996(pm60b)。

上述pm60-f(2900t)和pm60-r(3465t)扩增的目的产物为591bp(pm60a),931bp(pm60)或1171(pm60b)。

以标记m-pm60为对照。

结果如图5(1-3:pi662251(pm60a),pi428309(pm60),pi428204(pm60b)；4-9(tmpm60，抗病):tri1418,tri4275,tri28871,tri4312,tri4323,pi265008；10-17(抗病):tri644,tri2381,tri18421,tri18425,tri18426,tri18429,tri18422,tri19070；18-24(感病):tri19069,tri19315,tri19319,tri19313,tri4308,tri4322,tri12749；)和表2所示，

表2为栽培一粒小麦对不同白粉菌生理小种的抗性及pm60标记鉴定结果

注：

m-pm60为：现有公开的标记m-pm60-p1/m-pm60-p2；

标记1为：pm60-f(2900t)和pm60-r(3465t)；

标记2为：pm60-f(3000t)和pm60-r(3465t)；

0级为免疫；0；为有过敏性坏死反应；1级为高抗；2级为中抗；3级为中感；4级为高感。

可以看出，共筛选到6份有pcr扩增条带的材料(tri1418,tri4275,tri28871,tri4312,tri4323,pi265008)，片段大小指示为pm60，通过测序显示这6份材料的pcr产物序列一致(序列5)。其与pm60相似度为99％，3487位有a→g的snp变异，导致pm60蛋白的1163位苏氨酸thr变为丙氨酸ala,但这6份材料均对所检测的4个小麦白粉菌生理小种均有较高的抗性(见表2)。而m-pm60标记在很多抗病和感病的材料中均有扩增条带，大小指示为pm60a，3个抗病(tri1774,tri1990,tri17946)和4个感病(tri11488,tri14261,tri17026,tri4322)材料的pcr产物序列分析发现这些抗病和感病材料之间所测序列无差异(序列6)，与pm60a的相似度为98％，与乌拉尔图小麦感病材料m-pm60标记扩增的序列(序列4)的相似度为99.42％，序列分析及扩增结果显示利用特异的pm60分子标记可以排除这种类似序列的干扰(图5)。由以上结果可知:这两个pm60特异的分子标记，在乌拉尔图小麦以外的其他小麦种属的pm60同源基因的筛选及鉴定中也有一定的应用价值。

实施例3、pm60特异标记在普通小麦中分子标记辅助育种的潜力

采用实施例2的二的方法对11份苗期对e13-10菌种感病的普通小麦薛早，京411，石4185，中国春，chancellor，filder，科农199，兰考86，二芒麦，洋白麦和郑农17中进行检测，均未能扩增出任何条带，表明这些小麦均不为包含pm60基因的白粉病抗性小麦，pm60基因和开发的pm60特异标记可应用于这些材料的抗病改良及分子标记辅助育种中。

序列表

<110>中国科学院遗传与发育生物学研究所

<120>乌拉尔图小麦抗白粉病基因pm60特异分子标记的开发及其应用

<160>6

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

ctcacagttccacactgatat21

<210>2

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

tgtatattaatgggtataatag22

<210>3

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

ctccatcaatctcaagttcttcg23

<210>4

<211>1221

<212>dna

<213>人工序列

<400>4

gagaggctacagatgggagcaacaagcactgctgagatgcaatccactgtaagttctcgt60

agttgacaggagcctgcaggcgataacaggttggtccttgctaccaccaattccgagaac120

aaatccgctgatacagaacggctaagacaatttcctctgttgtagatcttcaaactgttg180

aggttgactgtgatgagaggattgaaaccatccactgttaaattctcagagttcaccagt240

ataagatcggtgagacaagtgaggttcgagagctgagccattgactccatgcttgactct300

ccatcaatctcaagttcctcaagggaagcaggcaaaggattgatgatggtgtgagctgct360

tcgatgggccgccgaaagaagttgccacattcttttactgtaagtgattggaggcacgcg420

aggtcctgcagtccaatgcacgtgatgctgcatcttctgacatctagtcttcttagggat480

ttcagattgctgagcggagccattgactgcatgcctgactctccttcaatctcaagtgtc540

tcgagggaagcagggaaaagcttgatggtgtgagctacttcggtatgccatggaaagaag600

atgccacagttgtatactgtaagatattggaggcacgcgaggtcctggagtccatggcac660

gtgaagctgcatcttctgacatctagtcttcttagggatttcagattgttcagctctgtc720

attgaaatgtgtgatacatctgtaatactcattttctctacttttcgcacgttatgcaag780

tccacctcaccattatacccattaatatacatgttgttccctgcataataagtcagctct840

gcggaactatgtctcacatcacaaactatcattgtggagctgtgaggcatgggagggaga900

gacaactttgggcaatcaaaaatttcaagtttcgacagatggttataacagccagcagag960

tactcccgcaggaagggtagcgtacggagattggggcatgacctgcaataaatagtttca1020

agccttgcaaacgaatcattaggcaccccaacccactcaataagttcaggcaatgaatca1080

aggacaatcagcttcaactgcaaaaaacttttgtttgtagcgccaccaaagacatggcgg1140

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