一种人源抗VEGFR2单链抗体及其应用的制作方法

本发明属于抗体药物领域，涉及一种全人源抗vegfr2单链抗体及其应用。

背景技术：

肿瘤血管为肿瘤发生、发展提供足够的氧分和营养，靶向肿瘤血管新生可以达到饿死肿瘤的治疗效果，但是肿瘤血管新生的分子调控机制非常复杂，需要许多生长因子、受体及信号通路的介导。

在血管新生过程中，血管内皮细胞生长因子(vegf)起着重要作用，能强烈地刺激血管内皮细胞增殖。vegf结合的受体包括vegfr1(也被称作flt-1)和vegfr2(也被称作flk-1)。vegfr1和vegfr2属于iii型受体酪氨酸激酶家族，胞外区由7个免疫球蛋白样结构域组成，含配体结合域和受体二聚化结构域，中间包含一个细胞跨膜区，胞内含有一个酪氨酸激酶结构域。vegfr2介导vegf的多种效应，包括内皮细胞增殖、血管增生和渗透，而vegfr1似乎并没有直接参与内皮细胞增殖和血管增生。vegf二聚体结合vegfr2后诱发受体二聚化，胞内酪氨酸激酶结构域的酪氨酸残基磷酸化，从而激活下游信号通路，包括激活磷脂酶c，增加细胞内钙离子浓度等，引发包括血管内皮细胞增殖、存活、细胞骨架重排、细胞迁移、基因表达等，最终引起血管增生。

针对vegf的抑制剂贝伐单抗(bevacizumab)是由基因泰克公司开发的一种针对vegf的重组人源化单克隆抗体，由93％人源和7％的鼠源部分组成。2004年2月26日获得fda的批准在美国上市是美国第一个获得批准上市的抑制肿瘤血管生成的药物。贝伐单抗2004年全球销售额为5.56亿美元，2013达到为70.37亿美元。针对vegfr2的抑制剂雷莫卢单抗(ramucirumab)，是礼来公司收购imclone公司的imc-1121b项目后，开发并成功上市。雷莫卢单抗是针对vegfr2的全人igg1单克隆抗体，特异性结合kdr/vegfr2。该药物于2014年5月在美国上市，应用于晚期或转移性胃癌或胃食管结合部腺癌。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种人源抗vegfr2抗体及其应用。。

本发明所述方法构建了高容量高多样性抗体库，从大容量抗体库中筛选出和vegfr2结合且能阻断其与配体vegf结合的抗体，且筛选出的抗体具有细胞活性。

本发明提供的人源抗vegfr2抗体。

一种抗vegfr2的单链抗体，所述单链抗体包括重链可变区域和轻链可变区域，并且重链可变区域和轻链可变区域通过柔性肽连接，柔性肽的氨基酸序列为seqidno.3。

所述重链可变区具体可为序列表的seqidno.1所示的多肽。

所述轻链可变区具体可为序列表的seqidno.2所示的多肽。

本发明所述的单克隆抗体是全人源的。

所述重链可变区中的cdr1、cdr2和cdr3依次为序列表的序列1自n末端第26-38位氨基酸残基、第53-69位氨基酸残基和第102-107位氨基酸残基；所述轻链可变区中的cdr1、cdr2和cdr3依次为序列表的序列2自n末端第24-35位氨基酸残基、第51-58位氨基酸残基和第93-101位氨基酸残基。

本发明还公开了所述抗vegfr2单链抗体在制备抑制肿瘤生长的产品中的应用。

所述肿瘤生长体现为肿瘤的体积变大和/或肿瘤的质量增加。

本发明涉及的抗体基因可变区的序列，可构建全长抗体分子作为药物用于临床上由于新生血管生成所导致的适应症的使用。

附图说明

图1为vegfr2的特异性单链抗体纯化过程sds-page。

图2为vegfr2的特异抗体不同浓度ligand的ec50。

图3为肿瘤体积与给药(avr2和avastin对比)时间关系图。

图4为给药后实体瘤体积变化图。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

实施例1、vegfr2特异抗体的发现

一、天然人源单链抗体文库建立

从知情同意的志愿者获得外周血，分离淋巴细胞并提取总rna。将总rna反转录得到cdna。以cdna为模板，用兼并引物pcr扩增抗体重链和轻链的可变区(vh和vl)。pcr产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，回收vh的dna和vl的dna，用重叠pcr的方式以编码柔性肽(seqidno.3)的基因连接成单链抗体(scfv)基因。将来自不同的志愿者的单链抗体基因等量混合，分组用内切酶切割，然后进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，回收dna片段并连接到已经用相同内切酶切割的噬菌粒载体质粒，将连接后的噬菌粒载体质粒用电转方式转入大肠杆菌，获得噬菌体单链抗体库。

二、vegfr2人源单克隆抗体筛选

1、抗体库的噬菌体展示和淘选

取100倍库容量的上述人源vh和vl单链抗体库菌液接种900ml2yt-ag培养基(含100μg/ml氨苄青霉素和2％葡萄糖)，37℃、250rpm培养至od600＝0.5～0.6，加入细胞密度100倍的辅助噬菌体，侵染0.5h，离心收集菌体，用900ml2yt-ak培养基(含100μg/ml氨苄青霉素和50μg/ml卡那霉素)重悬细胞，30℃、250rpm培养过夜。

将上一步培养物10000rpm、4℃离心20min，收集上清,加入1/4上清体积的peg/nacl，混匀，冰上静置2h；10000g4℃离心25min，弃上清，离心管倒扣在平板纸上，使液体除尽；用3ml预冷1×pbs重悬噬菌体沉淀，12000g4℃离心5min；转移上清到新的15ml离心管中，即获得第一轮起始噬菌体。

以vegfr2-fc为抗原包被免疫管，采用3％的m-pbs封闭；然后加入100×库容的第一轮起始噬菌体进行抗体抗原结合，用pbst洗去未结合的噬菌体，用0.6mltriethylamine洗脱噬菌体5min，加入0.6ml1mtris-hcl(ph7.4)平衡，将洗脱下来的噬菌体重新感染tg1，进行洗脱产物的扩增，peg/nacl沉淀纯化噬菌体用于下一轮筛选。共进行3-4轮噬菌体库的富集筛选，抗原量依次降低，洗涤强度依次增强，每轮洗脱产物均进行滴度测定。

2、单克隆的诱导表达及elisa筛选

将淘选后的菌液有限稀释涂布平板，培养过夜；挑取单克隆于分装有0.5ml/孔2yt-ag培养基的96孔深孔板培养过夜；然后将过夜培养物按照1:10转接至含有0.5ml/孔2yt-ag培养基的96孔深孔板中，培养至od600＝0.5～0.6，加入辅助噬菌体37℃侵染15min,37℃培养45min，4000g离心收集菌体，用2yt-ak培养基(含100μg/ml氨苄青霉素和50μg/ml卡那霉素)重悬菌体，30℃诱导过夜，第二天离心转移上清至洁净的96孔深孔板，获得单克隆噬菌体样品。

以vegfr2-fc为抗原包被96孔酶标板，封闭后向每孔中加入50μl单克隆噬菌体样品，37℃孵育1.5h；然后向每孔中加入300μlpbst，振荡5～10s，弃溶液，重复3～5次；之后向每孔中加入抗m13-hrp抗体pbst稀释液100μl，37℃孵育1h；然后向每孔中加入300μlpbst，振荡5～10s，弃溶液，重复5次；向每孔中加入50μltmb显色液，显色3～10min(具体显色时间视显色速度而定)，之后向每孔中加入50μl1mh2so4终止显色；使用酶标仪测定od450值。依据单克隆噬菌体elisa数据选定elisa测定阳性样品；取上述在96孔板深孔板2yt-ag培养基中的过夜培养菌液，进行测序分析，最终获得独特的单克隆抗体的序列如seqidno.6所示(由seqidno.1、3、2组成)。

实施例2、vegfr2抗体的表达

一、重组质粒的构建

1、采用scfv-f和scfv-r组成的引物对编码vegfr2特异抗体的dna分子进行pcr扩增，得到pcr扩增产物。

scfv-f：ctacggcagccgctggattg(seqidno.4)

scfv-r：ctcgaggcctgaggagacggtgac(seqidno.5)

2、用限制性内切酶ncoi和xhoi酶切步骤1得到的pcr扩增产物，回收酶切产物。

3、用限制性内切酶ncoi和xhoi酶切pet28b质粒(购买于novagene)，回收载体骨架。

4、将步骤2的酶切产物和步骤3的载体骨架连接，得到重组质粒pet28b-scfv。

二、重组菌株的获得

将重组质粒pet28b-scfv化转入bl21感受态细胞，得到重组菌株。

实施例3、vegfr2特异抗体的大规模制备和纯化

1、取保存在-80℃冰箱的菌种，在kan抗性的平板上划线，37℃过夜培养约15h；挑取单克隆，接种在3ml的kan抗性的液体lb培养基中，37℃，200rpm，过夜震荡培养约15h；取1ml菌液接种到100ml新鲜kan抗性液体培养基中(1:100)，37℃，200rpm，震荡培养；待菌液od600达到0.6时，加入iptg母液，使终浓度为0.5mmol/l；30℃，200rpm，震荡培养3h；4℃，1000rpm，离心10min收集菌体，用pbs重悬菌体，再次相同条件离心收集菌体；收集的菌体直接用于菌体裂解。

2、样品的准备(使用生工ni-ted1ml预装重力柱)：将宿主细胞碎片通过离心等方式去除，然后过0.45μm的微孔滤膜，用结合缓冲液进行适当稀释。水洗：用5～10倍柱体积纯水以50～150cm/h清洗树脂，去除乙醇。平衡：用5～10倍柱体积结合缓冲液以150～600cm/h平衡介质，保证介质中的溶液的组分和ph与样本一致。上样：样品经过离心、过滤(0.45μm)后以低流速进行上样。若为20cm柱高，建议流速≤150cm/h，若为1ml柱体积，洗杂：用10～20倍柱体积洗杂液以150cm/h洗杂，清洗非特异吸附的杂蛋白，并收集洗杂液用于后续分析。洗脱：用5～10倍柱体积洗脱液以低流速进行洗脱，并收集洗脱液，sds-page检测(如图1)，使用超滤管浓缩脱盐，-20℃保存目的蛋白。

实施例3、vegfr2抗体与ligand的结合

将不同浓度的ligand(vegfr2抗原)固定在酶标板上。然后再入不同浓度的vegfr2抗体，37℃孵育2小时。洗去未结合的抗体。与ligand结合的抗体用anti-humanigg-hrp(购自invitrogen公司)检测。结果如图2所示。结果表明，vegr2抗体与ligand有很强的结合。

实施例4、vegfr2治疗乳腺癌

裸鼠购自南京大学模式动物所。在裸鼠上接种乳腺癌细胞，2周后注射vegfr2抗体和对照药物(图3)。结果表明，vegfr2可以有效抑制肿瘤生长，在测试条件下其效果优于avastin。图4为治疗组与对照组的肿瘤大小比较。

sequencelisting

<110>浙江蓝盾药业有限公司

<120>一种人源抗vegfr2单链抗体及其应用

<130>

<160>6

<170>patentinversion3.5

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<212>prt

<213>人工序列

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<213>人工序列

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<212>prt

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sercysargglyseraspalaalaserleuthrthrargsertrphis

202530

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