一种喜盐芽胞杆菌耐盐碱基因yigB及其鉴定方法与流程

本发明涉及分子生物学和基因工程技术领域，尤其涉及一种喜盐芽胞杆菌耐盐碱基因yigb及其鉴定方法。

背景技术：

我国的盐渍土(盐碱土)具有种类特异、分布广泛、面积之多等特点，分布在我国的东北、西北、中原、西藏、内蒙等地区。盐渍土壤还有大量的可溶性盐，主要包括一些硫酸盐和碳酸盐(硫酸钠、碳酸钠等)，以及一些氯化物和重碳酸盐。因为盐渍土壤具有农作物难以生长的环境，大量的可溶性盐破坏了农作物细胞内的渗透压，使得植物失去离子平衡、酸碱平衡等稳态环境，对农作物生长有着不可小视的破坏作用。盐渍土壤虽是世界上最低产的土壤之一，但可恢复性高、潜力巨大，已是世界上各界学者长期关注研究的问题之一。由松花江和嫩江冲击而成的松嫩平原有着370万公顷的盐碱地，它作为全球三大苏打盐碱地的集中分布区之一，已成为黑龙江省最有潜力的待开发土地资源。由于东北地区独特的气候环境以及人为因素的影响，该地区的盐碱地恶化严重，并以1.4％的速度扩展延伸，应当引起我们的足够重视。

土壤复垦是指利用物理方法、化学方法以及生物方法等方法，将破坏和退化的土壤中的阻碍农作物生长的物质降低到可重新利用开垦的程度。我国作为一个农业大国，土地资源是人民耐以生存、国家长治久安的重要保障，将盐渍化的土地恢复成可利用开发的土地，重新构建新的土壤生态平衡，是我国解决土地匮乏等问题的重要手段。目前采用生物修复的方法，即利用动物、植物、微生物与环境之间的相互作用关系和一些代谢途径，将土壤中的一些污染物(或不利于生物生长的物质如高浓度的碳酸盐、硫酸盐)转化降解。生物修复在世界多地取得显著成效，松嫩平原盐碱地复垦迫在眉睫。微生物作为生态系统中的最底层的阶层—分解者，具有体积小、繁殖快、生命力强、代谢稳定等优势，并且其在生命进程中产生大量的次级代谢物，能够高效将土壤中的盐离子转移或降解，能达成对盐渍土地复垦的目标。因此在土地复垦过程中对耐盐微生物中耐盐碱功能基因的研究有着举足轻重的意义。

所以，对抗盐基因的分离是当前利用基因工程方法进行抗盐作物培育的首要任务。

综上所述，现有技术存在的问题是：

目前技术缺陷在于可用于土壤改良的微生物肥料和植物不具备高效的耐盐碱的能力，并在规模化地发掘高效耐盐碱的新功能基因用以构建相应基因工程菌株微生物肥料和转基因植物方面缺乏理论依据，且在进行抗盐作物培育方面缺乏有效的鉴定方法。

技术实现要素：

本发明的目的就在于为了解决上述问题而提供一种喜盐芽胞杆菌耐盐碱基因yigb及其鉴定方法。

本发明通过以下技术方案来实现上述目的：

本发明针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种喜盐芽胞杆菌耐盐碱基因yigb及其鉴定方法。利用构建基因文库的创新技术手段，发现一种高效的喜盐芽胞杆菌耐盐碱基因yigb，所述喜盐芽胞杆菌耐盐碱基因yigb，含一个663bp的完整开放阅读框orf，orf的核苷酸序列为seqidno.1，并通过新型基因工程手段构建高效耐盐菌株，从而为培育高效土壤改良微生物和植物提供了可能。其中:喜盐芽胞杆菌，保藏时间2012年06月12日，保藏编号cgmccn0.1.12153，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心。

本发明的另一目的在于提供一种利用上述喜盐芽胞杆菌耐盐碱基因yigb编码的蛋白，核苷酸序列为seqidno.2。

进一步功能验证显示，所述蛋白yigb能够恢复大肠杆菌盐敏感突变株knabc的耐盐碱能力；具有l-2-卤代链烷酸脱卤酶活性；利用原子吸收光谱技术，进一步确定了基因yigb具有维持细胞内的na⁺平衡的功能；利用荧光猝灭恢复技术，排除了yigb是na⁺/h⁺逆向转运蛋白的可能性，结合蛋白印迹杂交实验与跨膜区预测的结果，推测yigb极可能是一种膜结合蛋白。

本发明的另一目的在于提供一种喜盐芽胞杆菌耐盐碱基因yigb的鉴定方法包括以下步骤：

(1)通过基因文库与基因功能互补相结合的筛选技术，从喜盐芽胞杆菌中获得含有耐盐碱相关的基因片段，所述的耐盐碱相关的基因片段中含有一个长663bp的yigb基因的完整开放阅读框orf，orf的核苷酸序列如seqidno.1；

(2)构建含有yigb基因的原核表达载体；

(3)通过化转异源宿主escherichiacoliknabc，将基因yigb热击转化的方法导入至knabc宿主中，对基因yigb生理功能及编码的蛋白功能进行鉴定。

进一步，yigb基因的亚克隆：通过对原始克隆的重组质粒puc-sl40进行酶位点分析，我们利用位于第1508的hindiii酶切位点和第2461的bamhi酶切位点，去除不完整的orf1，然后胶回收段与puc18进行连接，构建亚克隆重组质粒puc-yigb(附图a)，后化转盐敏感缺陷株knabc，以检测orf2的耐盐能力。并通过提取重组质粒，hindiii、bamhi双酶切验证，确保亚克隆构建成功。

进一步，构建含有yigb基因的原核表达载体，所述原核表达载体pet19b-yigb的构建方法包括：

(1)根据yigb基因序列，首先利用primer5软件设计yigb-f/yigb-r特异引物，并在基因的5’和3’端分别引入ndei、bamhi两个酶切位点，然后进行yigb基因的pcr扩增，对yigb基因进行亚克隆；

(2)将pcr扩增产物加a纯化后连接到克隆载体peasy-t3上，化转到trans1-t1感受态细胞中，将转化产物进行蓝白斑筛选；

(3)用限制性内切酶进行酶切鉴定peasy–yigb重组质粒；为进一步确定序列的准确性，对连接到克隆载体peasy-t3上的插入片段进行测序。

(4)yigb亚克隆ndei-bamhi建到pet19b(ndei-bamhi),化转至大肠杆菌knabc中，获得重组质粒pet19b-yigb,对插入喜盐芽胞杆菌耐盐碱基因yigb片段进行双酶切验证，酶切结果正确的质粒进行基因测序。

本发明的另一目的在于提供一种利用上述喜盐芽胞杆菌耐盐碱基因yigb构建的具有较高的脱卤酶活性的蛋白。

本发明的另一目的在于提供一种利用上述喜盐芽胞杆菌耐盐碱基因yigb构建的耐盐碱工程菌。

本发明的另一目的在于提供一种利用上述喜盐芽胞杆菌耐盐碱基因yigb制备的开发微生物肥料。

本发明的另一目的在于提供一种利用上述喜盐芽胞杆菌耐盐碱基因yigb制备的耐盐碱性的转基因植物。

本发明的有益效果在于：

本发明是一种喜盐芽胞杆菌耐盐碱基因yigb及其鉴定方法，与现有技术相比，本发明基于基因文库筛选法并结合钠离子耐受性功能互补法，从喜盐芽胞杆菌的基因组中随机筛选有关na⁺输出的相关基因，并通过测序分析及生理生化实验来进一步确定有价值的基因，通过对其na⁺耐受能力、脱卤酶活性的鉴定以及自身蛋白的定位和分析，初步验证该基因的功能，从而获得一个新型的耐盐碱基因。本发明的ha_yigb是新型的首次被挖掘和鉴定的新型耐盐碱基因，高效地构建耐盐碱菌株，成功率高达百分之百，且该方法节约60％的技术成本。

本发明与传统技术相比，首次公开喜盐芽胞杆菌耐盐碱基因鉴定及其用途，从此菌中获取并具有序列表中seqidno.1所示的核苷酸序列，并能够获得含有该基因的重组载体和宿主细胞，本发明所提出的yigb基因对盐碱地土壤改良具有重要意义，获得了高效耐盐碱工程菌、开发微生物肥料和提高植物耐盐碱性的转基因领域的技术效果。

本发明从分子生物学和基因工程技术出发，构建高效耐盐碱的基因工程菌株以及转基因植物，由此获得用于土壤改良的耐盐碱微生物和植物。由于细菌与植物在耐盐碱方面有很大的相似性，它们在高渗条件下，均在细胞内积累相似的化合物。因此，高效耐盐碱细菌资源库的构建及关键新功能基因的发掘，不仅可以解决构建耐盐碱细菌基因工程菌株的问题，而且优良的高效耐盐碱细菌基因可以为构建高效耐盐碱转基因植物提供重要基因资源储备，同时，利用硫氰酸汞分光光度法，测出yigb具有l-2-卤代链烷酸脱卤酶活性。原子吸收实验更好地说明了：含有yigb基因的菌株能对抗高盐胁迫，它将细胞内多余的na⁺排出，以保持细胞内的na⁺平衡。因此新型的耐盐碱基因yigb具有极高的研究价值，这就是本发明的核心价值所在。

附图说明

图1是本发明实施例提供的ha_yigb基因原核表达载体pet-19b-yigb的构建流程图；

图2是本发明实施例提供的构建ha_yigb基因表达载体构建的电泳检测图；

其中a:m-1kbdnamarker；1-puc18digestedbybamhi-hindiii；2-puc-sl40digestedbybamhiandhindiii；b:m-dnamarkeriv；1-puc-yigbdigestedbybamhiandhindiii；c:m-200bpdnamarker；1-puc-sl40-yigb(about664bp)pcr；d:m-dnamarkeriv；1-peasy-t3vector；2-t3-yigb；e:m-200bpdnamarker；1-t3-yigbdigestedbybamhiandndei；2-peasy-t3digestedbybamhiandndeiascontrol；e:m-1kbdnamarker；1-pet19-phy1digestedbybamhiandndeiascontrol；2-pet-yigbdigestedbybamhiandndei

图3是本发明实施例提供的ha_yigb基因生理功能的鉴定图；

图4是本发明实施例提供的ha_yigb系统发育进化树图；

图中：◆喜盐芽胞杆菌rdd蛋白，◇表示rdd家族其他同源蛋白成员，；

图5是本发明实施例提供的ha_yigb蛋白的同源性比对图；

图6是本发明实施例提供的ha_yigb蛋白细胞定位图；

图中：m为预染蛋白分子量标准marker，1、3、5泳道为表达有yigb蛋白的相应样品，2、4、6泳道为阴性对照相应样品。

图7是本发明实施例提供的ha_yigb蛋白活性的鉴定图；

图中：a.na⁺/h⁺逆向转运活性，b.li⁺/h⁺逆向转运活性，c.k⁺/h⁺逆向转运活性；

图8是本发明实施例提供的原子吸收法验证基因yigb的na⁺耐受能力鉴定图；

图9是本发明实施例提供的硫氰酸汞分光光度法测定yigb的脱卤酶活性鉴定图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明作进一步说明：

本发明基于基因文库筛选法并结合钠离子耐受性功能互补法，从喜盐芽胞杆菌的基因组中随机筛选有关na+输出的相关基因，并通过测序分析及生理生化实验来进一步确定有价值的基因，通过对其离子转运功能的鉴定和自身蛋白的定位和分析，初步验证该基因的离子转运机制，从而获得一个新型的耐盐碱基因。本发明的ha_yigb是新型的首次被挖掘和鉴定的新型耐盐碱基因。

下面结合附图对本发明的应用原理作详细描述。

本发明实施例提供的喜盐芽胞杆菌耐盐碱基因yigb，所述的基因yigb含一个663bp的完整开放阅读框orf，orf的核苷酸序列如seqidno.1所示。

本发明实施例提供的喜盐芽胞杆菌yigb基因编码的蛋白，核苷酸序列如seqidno.2所示。

所述喜盐芽胞杆菌yigb基因通过功能互补实验，证明了基因yigb能够恢复大肠杆菌盐敏感突变株knabc的耐盐碱能力；利用硫氰酸汞分光光度法，测出yigb具有l-2-卤代链烷酸脱卤酶活性；利用原子吸收光谱，进一步确定了基因yigb具有维持细胞内的na⁺平衡的功能；通过跨膜区预测的结果、蛋白定位实验以及荧光猝灭恢复实验的结果，推测yigb极可能是一种膜结合蛋白。

生物信息学分析所述的喜盐芽胞杆菌yigb与奥哈芽孢杆菌(bacillusokhensis)中的l-2-卤代链烷酸脱卤酶(l-2-haloalkanoicaciddehalogenase,accessionno.khf39277.1)的同源性最高(52％)，命名为yigb。编码的蛋白属于hydrolasesuperfamily。yigb为喜盐芽胞杆菌yigb基因的原核表达蛋白。

本发明实施例提供的喜盐芽胞杆菌耐盐碱基因yigb的鉴定方法，包括以下步骤：

(1)通过基因文库与基因功能互补相结合的筛选技术，从喜盐芽胞杆菌中获得含有耐盐碱相关的基因片段，所述的耐盐碱相关的基因片段中含有一个长663bp的yigb基因的完整开放阅读框orf，orf的核苷酸序列如seqidno.1所示；

(2)构建含有yigb基因的原核表达载体；

(3)通过化转异源宿主escherichiacoliknabc，将yigb基因导入knabc宿主中，对其生理功能及蛋白活性进行鉴定；

(4)利用原子吸收光谱技术，进一步确定了基因yigb具有维持细胞内的na⁺平衡的功能；

(5)利用硫氰酸汞分光光度法，测出yigb具有l-2-卤代链烷酸脱卤酶活性；

(6)利用荧光猝灭恢复技术，排除了yigb是na⁺(li⁺，k⁺)/h⁺逆向转运蛋白的可能性，结合蛋白印迹杂交实验与跨膜区预测的结果，推测yigb极可能是膜结合蛋白。

下面结合具体实施例对本发明的应用原理作进一步描述。

实施例1.ha_yigb基因原核表达载体pet19b-yigb的构建流程，如图1和2所示；

根据yigb基因序列，首先利用primer5软件设计yigb-f/yigb-r特异引物(如表1所示)，seqidno.3：yigb-f：catatggtgattaaagccgtgc；

seqidno.4：yigb-r：ggatccctaaaacgttcgctcc。

并在基因的5’和3’端分别引入ndei、bamhi两个酶切位点，然后进行yigb基因的扩增(如表2所示)，对yigb基因进行亚克隆。

表1yigb基因表达载体构建引物序列

表2pcr扩增反应

将pcr产物加a纯化后连接到克隆载体peasy-t3上，化转到trans1-t1感受态细胞中，将转化产物进行蓝白斑筛选。结果如图3可知，pcr产物:yigb(663bp)大小与dnamarker比对，应符合pcr产物的实际长度。为了进一步鉴定peasy–yigb重组质粒是否正确，用限制性内切酶进行酶切验证。如图3可知，双酶切产生的片段大小与pcr产物大小基本一致，为进一步确定序列的准确性，对插入片段进行测序，测序结果与原始序列一致。以上结果表明yigb基因成功插入peasyt3载体中。

通过胶回收双酶切片段，与pet19的ndei、bamhi双酶切片段通过t4dna连接酶连接，构建表达载体pet-yigb酶切结果正确的质粒进行基因测序，测序结果与原始序列一致。表明重组质粒pet19b-yigb构建成功(图3)。

实施例3ha_yigb基因生理功能的鉴定：

为了鉴定ha_yigb基因的生理功能，本发明以knabc/puc18(负对照)、knabc/pet19(负对照)、knabc/puc-sl40、knabc/puc-yigb以及knabc/pet-yigb同时涂布在含有0.2mnacl的lbk平板上，同时涂布一个0mlbk的平板作为对照，我们明显看到原始克隆和亚克隆都能够在0.2mlbk的平板上生长，而负对照不能在0.2mlbk的平板上生长(图3-a所示)，结果暗示基因yigb能起到耐盐碱作用。将上述五种菌株转接到含有不同盐浓度(0、0.2、0.3mnacl)的lbk液体培养基中培养24h，测它们od600nm值。结果表明(如图3-b所示)：在0.2mnacl的盐胁迫下，原始克隆knabc/puc-sl40、亚克隆knabc/puc-yigb和亚克隆knabc/pet-yigb均能使盐敏感突变株knabc恢复生长，并且三者的生长趋势很一致；负对照(knabc/puc18、knabc/pet19)，在0.2mnacl的盐胁迫下，不能恢复knabc的生长。在0.3mnacl的盐胁迫下，带有yigb基因的菌株(knabc/puc-sl40、knabc/puc-yigb、knabc/pet-yigb)仍能有微弱生长，但负对照(knabc/puc18、knabc/pet19)无生长迹象。

为了进一步测试yigb基因在表达载体上耐锂离子的能力，我们将上述五株菌的活化菌液转接到含有不同浓度锂离子(0、10、20、30、40、50mmlicl)的新鲜lbk培养基中培养24h(如图3-c所示))。结果显示：在10mmlicl的盐胁迫下，含有yigb基因的菌株(knabc/puc-sl40、knabc/puc-yigb和knabc/pet-yigb)比不含有yigb基因的菌株(knabc/puc18和knabc/pet19)的生长情况要好；在高于20mmlicl的盐胁迫下，原始克隆knabc/puc-sl40、亚克隆knabc/puc-yigb和亚克隆knabc/pet-yigb均能使盐敏感突变株knabc恢复生长，并且他们的生长趋势基本一致。这些结果表明基因yigb有一定的li⁺耐受能力。

基因yigb的耐碱实验：

我们将knabc/puc18(负对照)、knabc/pet19(负对照)、原始克隆knabc/puc-sl40、亚克隆knabc/puc-yigb以及亚克隆knabc/pet-yigb同时接种到在ph7.0-9.0的lbk液体培养基中(如图3-d所示)，结果显示：在ph8.0时，nabc/puc-sl40、knabc/puc-yigb、knabc/pet-yigb菌株比对照knabc/puc18和knabc/pet19生长优势明显；且在ph8.5时，含有yigb基因的knabc菌株生长状况仍然良好，而不含该基因的knabc菌株几乎不能生长。耐碱实验说明在碱性条件下基因yigb能使盐敏感突变株knabc具有一定的耐碱能力。

实施例4yigb基因表达蛋白的生物信息学分析

一、ha_yigb基因编码蛋白理化性质：

采用expasyprotparam对yigb基因编码蛋白进行基本的理化性质的预测和分析。结果表明：耐盐碱基因yigb编码220个氨基酸，相对分子量为25.75354kd，等电点6.19，为碱性蛋白；组成的原子是c(1173)h(1816)n(316)o(328)s(5)，一共3638个原子，理论半衰期10h，不稳定参数41.15，是不稳定蛋白，氨基酸中带正电荷氨基酸(arg、lys)31个，带负电荷氨基酸(asp、glu)36个。yigb蛋白的氨基酸组成(表3)，结果显示其中包含的疏水性氨基酸、亲水性氨基酸、酸性氨基酸、碱性氨基酸分别为51.8％、43.6％、16.4％、19.5％。

表3ha_yigb基因编码蛋白氨基酸组成

二、ha_yigb系统发育进化树

利用neighbor-joining算法，选取ncbi数据库中ha_yigb相似性50-53％、40-50％、30-40％各10个同源蛋白进行系统进化距离分析。结果表明(图5)：yigb与同家族的其他蛋白聚集在一簇。所以，本发明首次发现来自于喜盐芽胞杆菌中的新的耐盐碱基因yigb可能具有l-2-卤代链烷酸脱卤酶(l-2-haloalkanoicaciddehalogenase)活性，后续的实验得到了验证。

三、ha_yigb与同系物的同源性比对

本发明选择了blast数据库中与它同源性50％-53％最近的10个同源蛋白进行多序列比对(图6)，结果发现：ha_yigb与这些同源性最高的同系物高度保守的模块很少。

实施例六ha_yigb蛋白的细胞定位

本发明利用超离法将knabc/pet19b-yigb细胞的胞浆蛋白与膜蛋白分离开，再通过蛋白印迹杂交(westernblot，简称wb)的技术手段，分别对提取的细胞全蛋白(超声破碎上清液)、胞浆蛋白(超离上清液)和膜蛋白(超离沉淀)进行检测。理论上，wb实验只能在制备的细胞全蛋白(超声破碎上清液)和膜蛋白(超离沉淀)样品中检测出目的条带(即ha_yigb所携有的标签抗体信号)，而胞浆蛋白样品(超离上清液)则检测不出目的条带。

发现(图6)：第一，与负对照相比(b-2、4、6)，ha_yigb蛋白只在细胞的全蛋白和膜蛋白样品中被检测出条带(b-1、5)，而胞浆蛋白样品中没有(b-3)，综上所述，ha_yigb的确是位于在内膜上的膜蛋白，这与之前对它的分析是相反的，这表明yigb可能是膜结合蛋白，需进一步的验证。

实施例5ha_rdd蛋白活性的鉴定

本发明将含有pet-yigb和pet19的knabc细胞用法式细胞破碎仪破碎制备成反转膜，经超高速离心收集。在不同的ph体系中，加入吖啶橙作为荧光指示剂的情况下，加入d-乳酸为细胞供能，检测yigb的na⁺(li⁺，k⁺)/h⁺逆向转运蛋白活性(如图3中a所示)。结果显示：加入d-乳酸发生荧光猝灭，待猝灭至稳定至平衡点时，加入单一的na⁺溶液，在不同的ph条件下，knabc/pet-yigb的荧光恢复值都比较低，均小于10％，且与负对照knabc/pet19没有明显的区别。我们在检测yigb的li⁺(k⁺)/h⁺逆向转运蛋白活性时，也均没有检测到活性(如图3中b和c所示)。因此，我们断定yigb没有na⁺(li⁺，k⁺)/h⁺逆向转运蛋白活性，这也暗示着yigb很可能是一种膜结合蛋白，与跨膜区预测(无跨膜区，结果未出示)、蛋白定位的结果互应。

实施例六ha_yigb蛋白具有维持细胞内的na⁺平衡功能的鉴定

本发明利用利用原子吸收光谱技术，进一步确定了基因yigb具有维持细胞内的na⁺平衡的功能。检测了knabc/pet19(负对照)和knabc/pet-yigb在用不同浓度的nacl处理后细胞中na⁺含量随时间的变化情况(结果如图3所示)。结果表明，在knabc/pet19(负对照)中，细胞内钠离子含量随钠离子浓度的增加而显著上升。然而，含有yigb基因的菌株knabc/pet-yigb中na⁺含量，随着不同浓度的na⁺胁迫下，细胞内的钠离子变化平缓，基本保持平衡。这说明含有yigb基因的细胞能对抗高盐胁迫，将细胞内多余的na⁺排出，以保持细胞内的na⁺平衡。以上实验说明，yigb基因与钠离子输出的密切相关。因此本发明证明了ha_yigb具有维持细胞内的na⁺平衡的功能。

实施例六ha_yigb蛋白脱卤酶活性的鉴定

本发明利用氰酸汞分光光度法验证yigb的脱卤酶活性,利用knabc/pet19(负对照)和knabc/pet-yigb粗酶提取液，对yigb的脱卤酶活性进行初步鉴定。与knabc/pet19相比，knabc/pet-yigb粗酶提取液的酶活性很高。由此可见，yigb基因能够在大肠杆菌功能缺陷型菌株knabc中表达，并产生脱卤酶活性,因此本发明证明了ha_yigb蛋白具有脱卤酶活性。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

<110>东北农业大学

<120>一种喜盐芽胞杆菌耐盐碱基因yigb及其鉴定方法

<130>xxxxx

<160>4

<210>1

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<213>喜盐芽胞杆菌（halobacillusandaensis）

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