一种斑马鱼卵母细胞催熟剂及其应用的制作方法

本发明属于水产技术领域，具体涉及一种斑马鱼卵母细胞催熟剂及其应用。

背景技术：

雌性的正常生育过程中，卵母细胞的减数分裂被精确调节。鱼类卵母细胞和其他脊椎动物一样，经历减数分裂，随后在第一次减数分裂前期停滞，直到垂体释放的促性腺激素(lh)作用下，恢复减数分裂细胞周期，卵母细胞从第一次减数分裂的前期进入第二次减数分裂的中期。前期-中期转换的特点是生发泡破裂(gvbd)，这是卵母细胞成熟的标志。

已经证明，lh通过与其受体lhr起作用。然而，lhr是在卵巢的颗粒细胞中表达。因此，在卵母细胞上lh的作用是间接的，需要介质来将信号从颗粒细胞传递到卵母细胞。在大多数鱼类中，一种名为17α，20β-二羟基-4-孕3-酮(dhp)的类固醇被认为是lh诱导卵母细胞成熟过程中的主要介质。dhp与其受体结合，激活多种信号转导途径，并诱导促成熟因子(mpf)的活化，进而能促使卵母细胞进入减数分裂i期的m期和减数分裂ii。近年来，越来越多的新因子被认为可刺激或抑制lh信号通路介导的卵母细胞成熟过程中的刺激物或抑制物，包括胰岛素样生长因子、活化素、转化生长因子、皮生长因子与雌激素等,这些研究结果表明卵母细胞成熟可被在多层次上被不同因子调控。

对部分养殖经济鱼类以及濒危的鱼类，卵母细胞不能正常成熟是困扰这些鱼类养殖的主要问题之一。因此研究卵母细胞成熟的机理，开发新型的卵母细胞催熟剂对于水产养殖有着重要意义。

目前发现的绝大多数诱导鱼类卵母细胞成熟的因子都为激素或者生长因子。这些因子在使用过程中，都存在不同的问题，如激素对水体的污染问题，高活性的生长因子不容易获得，激素和生长因子在部分鱼类中并不能达到很好的催熟效果。因此开发更高效，更低廉的催熟剂对于促进水产养殖显得尤为重要。

技术实现要素：

本发明的第一个目的在于提供一种斑马鱼卵母细胞催熟剂，该催熟剂可诱导斑马鱼卵母细胞成熟，且高效、成本低。

本发明的目的还在于提供一种诱导斑马鱼卵母细胞成熟的方法，该方法稳定、高效。

本发明第三个目的在于提供上述斑马鱼卵母细胞催熟剂在诱导斑马鱼卵母细胞成熟中的应用。

本发明的上述第一个目的是通过以下技术手段来实现的：一种斑马鱼卵母细胞催熟剂，含有锌。

进一步地，还包括锌离子载体。

优选的，所述的锌为氯化锌(zncl2)或硫酸锌(znso4)。

优选的，所述的锌离子载体为吡啶硫酮锌(znpt)。

优选的，所述锌的终浓度为0.5～1.5mm，锌离子载体的终浓度为5～15μm。

更佳的，所述锌的终浓度为1.0mm，锌离子载体的终浓度为10μm。

本发明的上述第二个目的是通过以下技术手段来实现的：上述诱导斑马鱼卵母细胞成熟的方法，选取雌性斑马鱼，取出卵巢，置于培养基中培育后，选取离体完全生长期卵子，孵育后加入上述的斑马鱼卵母细胞催熟剂进行处理，获得成熟的斑马鱼卵母细胞。

优选的，所述培养基为leibovitzl-15培养基。

优选的，孵育的温度为25～30℃，孵育时间为10～20h。

更佳的，孵育的温度为28℃，孵育时间为16h时，可诱导绝大多数卵母细胞发生成熟。

本发明的上述第三个目的是通过以下技术手段来实现的：上述的斑马鱼卵母细胞催熟剂在诱导斑马鱼卵母细胞成熟中的应用。

本发明具有以下优点：本发明申请人通过研究，首次发现锌可诱导斑马鱼卵母细胞成熟，表明锌可作为一种新型的鱼类催熟剂应用于鱼类卵母细胞催熟中。此外，锌的原材料易得，价格低廉，在斑马鱼中诱导卵母细胞成熟的效率较高，不仅可用于斑马鱼卵母细胞成熟的诱导，也可能应用于其他鱼类的卵母细胞成熟诱导，因此具备良好的应用前景。

附图说明

图1是实施例3中znso4或zncl2在卵母细胞成熟过程中的作用，(a)znso4(处理16小时)对卵母细胞成熟率的浓度依赖性关系；(b)znso4(1mm)对卵母细胞成熟率的时间依赖性关系；(c)znso4(1mm处理16h)对卵母细胞成熟率的影响；(d)zncl2(处理16h)对卵母细胞成熟率的剂量依赖性关系；(e)zncl2(1mm)对卵母细胞成熟率的时间依赖性关系；(f)zncl2(1mm处理16h)对卵母细胞成熟率的时期依赖性关系；

图2是实施例3中锌离子载体(10μmznpt)对znso4或zncl2诱导卵母细胞成熟的作用；

图3是实施例3中(a)完整卵泡(左)和去壳卵母细胞(右)pi染色；(b)znso4或zncl2(1mm)对裸露卵母细胞处理4h后，对卵母细胞成熟的影响，每个值代表三个独立实验的五份试验的平均值±sem(*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001)。

具体实施方式

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例1

本实施例提供的斑马鱼卵母细胞催熟剂，含有锌。

进一步的，还可以包括锌离子载体。

优选的，锌为氯化锌或硫酸锌。

优选的，锌离子载体为吡啶硫酮锌(znpt)。

优选的，锌的终浓度为0.5～1.5mm，锌离子载体的终浓度为5～15μm。

更佳的，锌的终浓度为1.0mm，锌离子载体的终浓度为10μm。

实施例2

本实施例提供的诱导斑马鱼卵母细胞成熟的方法，包括以下步骤：选取雌性斑马鱼，取出卵巢，置于培养基中培育后，选取离体完全生长期卵子，孵育后加入实施例1中的斑马鱼卵母细胞催熟剂进行处理，获得成熟的斑马鱼卵母细胞。

优选的，培养基为leibovitzl-15培养基。

优选的，孵育的温度为25～30℃，孵育时间为10～20h。

更佳的，孵育的温度为28℃，孵育16h时，即可诱导绝大多数卵母细胞发生成熟。

优选的，锌的终浓度为0.5～1.5mm，锌离子载体的终浓度为5～15μm。

更佳的，锌的终浓度为1.0mm，锌离子载体的终浓度为10μm。

实施例3

以下通过具体实验来说明斑马鱼卵母细胞催熟剂在诱导斑马鱼卵母细胞成熟中的应用。

1、材料和药品

leibovitz'sl-15培养基购自gibco公司(美国)，氯化锌(zncl2)和硫酸锌(znso4)购自sigma-aldrich公司(美国)，锌离子载体购自selleck(美国)。

卵巢卵泡分离和培养

斑马鱼麻醉并处死后，解剖15～20条雌性斑马鱼，取出卵巢放在含有用无菌水稀释的，质量百分含量为60％的leibovitzl-15培养基的培养皿中，人工分离完全生长期卵子(fg期；直径约为0.65毫米)。分离过程通常在室温下持续4-6h，28℃下孵育和药物处理。

24孔培养板中28℃下孵育(30-40个/孔)。经过处理后发生gvbd的卵泡通过其卵浆清除(由于卵黄蛋白的裂解)而被鉴定。每组有4个平行，每个实验重复3次。

数据分析：所有数据均表示为平均值±标准误，p<0.05，采用单向方差法进行统计学处理，采用graphpadsoftware软件进行fisher最小显著性差异检验，并采用非配对双尾t检验对两组进行统计学比较，所有实验均进行两次或三次验证。

2、结果

为了研究锌能否促进鱼类卵母细胞的成熟。利用氯化锌(zncl2)或硫酸锌(znso4)处理后，发现对促进卵母细胞成熟具有明确的剂量、时间和时期依赖性(图1所示，对照为没有添加锌的完全生长期卵子)。

在测试不同剂量的实验中，氯化锌(zncl2)和硫酸锌(znso4)在促进卵母细胞成熟中均表现出剂量依赖性，并在1mm的浓度时效果最好(图1中a图，d图)。

在测试不同时间的实验中，氯化锌(zncl2)和硫酸锌(znso4)在促进卵母细胞成熟中均表现出时间依赖性，在18小时可达到最好的效果(图1中b图，e图)。

在测试不同时期的实验中，氯化锌(zncl2)和硫酸锌(znso4)在促进卵母细胞成熟中均表现出时期依赖性，仅可诱导完全生长期的卵子发生成熟(图1中c图，f图)。

综上所述，氯化锌(zncl2)和硫酸锌(znso4)在1mm的浓度下处理18小时可诱导完全生长期的卵子发生成熟。

进一步采用锌离子载体znpt来增加锌的流入量。用10μmznpt可显著提高zncl2或znso4对卵母细胞成熟的作用(图2所示)。

仅用1mm的氯化锌(zncl2)和硫酸锌(znso4)处理4小时，只能促进少量卵子发生成熟，添加10μmznpt后，会显著性的促进卵子成熟。

因此，znpt的添加有利于锌促进卵母细胞成熟。

为探讨锌是否直接作用于卵母细胞，用胶原酶处理卵巢滤泡层，用pi染色和荧光显微镜观察，证实成功去除了卵巢滤泡细胞层(图3中a图)。用zncl2或znso4处理裸露的卵母细胞也能显著促进卵母细胞的成熟(图3中b图)。

这些结果表明，锌对卵母细胞本身的成熟有直接的促进作用。

以上这些结果都证明了金属锌可诱导斑马鱼卵母细胞成熟。

因此，在本发明中，申请人发现并证明了锌能刺激斑马鱼卵母细胞的成熟。目前常用的鱼类卵母细胞成熟催熟剂均为激素或者生长因子。锌的原材料易得，价格低廉，在斑马鱼中诱导卵母细胞成熟的效率较高，不仅可用于斑马鱼卵母细胞成熟的诱导，也可能应用于其他鱼类的卵母细胞成熟诱导，因此具备良好的应用前景。

综上所述，锌可作为斑马鱼卵母细胞催熟剂，在诱导斑马鱼卵母细胞成熟中应用。

本发明不局限于上述特定的实施方案范围内，上述实施方案仅仅是为了能够对本发明的使用过程进行详细地说明，而且有相等功能的生产方法和技术细节也属于本发明内容的一部分。事实上，本领域技术人员根据前文的描述，就能够根据各自需要找到不同的调整方案，这些调整都应在本文所附的权利要求书的范围内。