一种降血糖十肽的制作方法

本发明属于生物制药领域，具体涉及一种降血糖十肽。

背景技术

糖尿病是一种慢性病，是由于体内胰岛素不足引起的蛋白质、脂肪、碳水化合物代谢紊乱，主要特点是慢性高血糖。研究发现有许多天然的抗糖尿病有效成分，譬如：银杏叶提取物、植物多糖等。生物活性多肽的降血糖方面的研究较少。已有的一些研究表明，生物活性肽能有效改善糖尿病的作用。例如，在王军波等的研究中，海洋胶原肽能够缓解高胰岛素血症大鼠的胰岛β细胞的结构损伤，增加颗粒的分泌，减少脂滴的形成，显著提高胰岛素的生物学活性；显著降低的空腹胰岛素水平，对空腹血糖和口服葡萄糖耐量也有一定的改善作用。在黄凤杰等的研究中，鲨鱼肝活性肽s-8300有抗氧化作用，通过清除自由基保护胰岛β细胞，调节糖脂代谢，延缓胰岛β细胞的衰竭，在一定程度上能够治疗糖尿病。

人体中淀粉等糖类物质的消化吸收，需要依赖α-葡萄糖苷酶与α-淀粉酶这两种关键酶。因此，抑制这两种关键酶的活性便能减缓碳水化合物降解为单糖的速度，以达到调控餐后血糖升高过快的目的。

技术实现要素：

本发明选取α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶为研究对象，测定合成肽的体外抑制活性。本发明的目的是提供一种具有体外降血糖活性的合成多肽，可应用于生物制药领域。

本发明所述的一种降血糖十肽缩写为lrselaawsr，分子量1188.35da，纯度为95.2％，序列为：leu-arg-ser-glu-leu-ala-ala-trp-ser-arg。其中，

leu表示英文名称为leucine，中文名称为亮氨酸的氨基酸的相应残基；

arg表示英文名称为arginine，中文名称为精氨酸的氨基酸的相应残基；

ser表示英文名称为serine，中文名称为丝氨酸的氨基酸的相应残基；

glu表示英文名称为glutamicacid，中文名称为谷氨酸的氨基酸的相应残基；

leu表示英文名称为leucine，中文名称为亮氨酸的氨基酸的相应残基；

ala表示英文名称为alanine，中文名称为丙氨酸的氨基酸的相应残基；

ala表示英文名称为alanine，中文名称为丙氨酸的氨基酸的相应残基；

trp表示英文名称为tryptophan，中文名称为色氨酸的氨基酸的相应残基；

ser表示英文名称为serine，中文名称为丝氨酸的氨基酸的相应残基；

arg表示英文名称为arginine，中文名称为精氨酸的氨基酸的相应残基。

进一步地，所述十肽对α-淀粉酶有抑制活性，ic50值为313.6μg/ml。

进一步地，所述十肽对α-葡萄糖苷酶的50％抑制浓度(ic50)为134.23μg/ml。

进一步地，所述十肽在浓度2.5-5mg/ml时，对α-淀粉酶的抑制率是77％-81％。

进一步地，所述十肽在浓度1-2.5mg/ml时，对α-葡萄糖苷酶的抑制率是120％-128％。

本发明所述的氨基酸序列采用标准fmoc方案，通过树脂的筛选，合理的多肽合成方法。将目标多肽的c-端羧基以共价键形式与一个不溶性的高分子树脂相连，然后以这个氨基酸的氨基作为起点，与另一分子氨基酸的羧基作用形成肽键。不断重复这一过程，即可以得到目标多肽产物。合成反应完成后，去除保护基，将肽链与树脂分离，即得到目标产物。多肽合成是一个重复添加氨基酸的过程，固相合成顺序从c端向n端合成。

本发明通过研究合成肽对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制作用来确定其降血糖作用。

与现有技术相比，本发明具有如下优点和技术效果：

本发明首次合成了该肽，并且检测了合成多肽对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制活性，所述合成多肽具有降血糖能力。

附图说明

图1a为合成多肽leu-arg-ser-glu-leu-ala-ala-trp-ser-arg的hplc图。

图1b为合成多肽leu-arg-ser-glu-leu-ala-ala-trp-ser-arg的ms图。

图2a为合成多肽leu-arg-ser-glu-leu-ala-ala-trp-ser-arg对α-淀粉酶的抑制活性曲线。

图2b为合成多肽leu-arg-ser-glu-leu-ala-ala-trp-ser-arg对α-葡萄糖苷酶的抑制活性曲线。

具体实施方式

以下结合具体实例对本发明作进一步说明，但本发明的实施和保护范围不限于此，需指出的是，以下若有未特别详细说明之过程或参数，均是本领域技术人员可参照现有技术理解或实现的。

多肽固相合成

选用高分子树脂(中肽生化有限公司)，按照氨基酸序列leu-arg-ser-glu-leu-ala-ala-trp-ser-arg的特征，先将leu的羧基以共价键的形式与一个树脂相连，然后leu的氨基和arg的羧基缩水反应，处理后，再添加ser，arg的氨基和ser的羧基反应，依次从右到左添加氨基酸，加好最后一个arg氨基酸后，再切除树脂即得到目标多肽。采用高效液相色谱进行纯化，色谱柱型号为phenomenexc18，尺寸4.6*150mm，流动相a:含有0.1％(v/v)三氟乙酸(tfa)的水；流动相b:含有0.09％tfa(v/v)的溶液(80％乙腈+20％水)；20min内b相由14.0％上升到24.0％，流速1.0ml/min，检测波长220nm。液氮速冻，冷冻干燥，得到最后的产品，要求纯度达到97.04％以上，并经ms鉴定结构(如图1所示)。

合成多肽对α-淀粉酶的体外抑制活性

1试剂的配制

1)0.2m磷酸缓冲液：称取na2hpo42.84g、kh2po42.72g分别溶于100ml蒸馏水中，取适量的两种溶液在磁力搅拌器的作用下混合至ph＝6.9，搅拌过程用ph计测量实时酸碱度。

2)1u/ml淀粉酶溶液：取淀粉酶4μl，与1996μl蒸馏水混合，配成2ml酶液。

3)1％淀粉溶液：取1g可溶性淀粉，溶于99ml缓冲液中。

4)样品溶液：取一定质量的样品，配置成不同剂量的样品溶液(0～10mg/ml)，溶剂为10％dmso。

5)dns终止反应液：称取1gdns，12g酒石酸钠钾于锥型瓶中，加入87ml0.4mna2co3溶液。

6)阿卡波糖溶液：用于阳性对照，称取一定量阿卡波糖配制成不同浓度梯度的溶液(0～8mg/ml)。

2实验步骤

1)1％淀粉溶液95℃水浴8min，预处理使其变性。

2)实验组用移液枪吸取抑制剂(0～10mg/ml)20μl与酶液10μl于试管中混合，对照组缓冲液20μl与酶液10μl混合，阳性对照组取阿卡波糖(0～8mg/ml)20μl与酶液10μl混合，于37℃摇床反应15min。

3)加入经预处理的淀粉溶液500μl，于37℃摇床反应5min。

4)加入dns溶液600μl，100℃水浴15min。

5)反应结束后，用移液枪吸取200μl反应液，于540nm测吸光度,实验组与对照组分别用a实验组与a对照组表示。

合成多肽对α-葡萄糖苷酶的体外抑制活性

1试剂的配制

1)0.2m磷酸缓冲液：称取na2hpo42.84g、kh2po42.72g分别溶于100ml蒸馏水中，取适量的两种溶液在磁力搅拌器的作用下混合至ph＝6.9，搅拌过程用ph计测量实时酸碱度。

2)p-npg溶液：底物溶液，称取0.003765gp-npg,溶于15ml蒸馏水中。

3)0.2u/mlα葡萄糖苷酶液：吸取已分装的酶液(200u/ml)5μl，用蒸馏水配成5ml。

4)样品溶液：取一定质量的样品，配置成不同浓度的样品溶液(0～10mg/ml)，溶剂为10％dmso。

5)0.2mna2co3：称取0.848gna2co3，溶于40ml蒸馏水中。

2实验步骤

1)于96孔板中反应，实验组、背景组、对照组、阳性对照组添加试剂如表1所示，于37℃摇床反应20min。

表1样品的添加量

2)各孔中加入缓冲液50μl，底物溶液40μl，于37℃摇床反应20min后去除，加入140μlna2co3溶液终止反应。

3)于405nm测吸光度。

应用实施例1

取1％淀粉溶液95℃水浴8min，预处理使其变性。实验组用移液枪吸取十肽(2.5mg/ml)20μl与α-淀粉酶酶液10μl于试管中混合，对照组缓冲液20μl与α-淀粉酶酶液10μl混合，阳性对照组取阿卡波糖(5mg/ml)20μl与α-淀粉酶酶液10μl混合，于37℃摇床反应15min。加入经预处理的淀粉溶液500μl，于37℃摇床反应5min。加入dns溶液600μl，100℃水浴15min。反应结束后，用移液枪吸取200μl反应液，于540nm测吸光度，计算抑制率。由图2a可知，十肽对α-淀粉酶的抑制率是77％。

应用实施例2

取1％淀粉溶液95℃水浴8min，预处理使其变性。实验组用移液枪吸取十肽(5mg/ml)20μl与α-淀粉酶酶液10μl于试管中混合，对照组缓冲液20μl与α-淀粉酶酶液10μl混合，阳性对照组取阿卡波糖(5mg/ml)20μl与α-淀粉酶酶液10μl混合，于37℃摇床反应15min。加入经预处理的淀粉溶液500μl，于37℃摇床反应5min。加入dns溶液600μl，100℃水浴15min。反应结束后，用移液枪吸取200μl反应液，于540nm测吸光度，计算抑制率。由图2a可知，十肽对α-淀粉酶的抑制率是81％。

应用实施例3

于96孔板中添加实验组(十肽(2.5mg/ml)20μl与α-葡萄糖苷酶酶液10μl)、背景组(十肽(2.5mg/ml)20μl与缓冲液10μl)、对照组(缓冲液10μl与α-葡萄糖苷酶酶液10μl)、阳性对照组(阿卡波糖溶液(2.5mg/ml)20μl与α-葡萄糖苷酶酶液10μl)，于37℃摇床反应20min。各孔中加入缓冲液50μl，底物溶液40μl，于37℃摇床反应20min后去除，加入140μlna2co3溶液终止反应。于405nm测吸光度并计算抑制率。由图2b可知，十肽对α-葡萄糖苷酶的抑制率是128％，是阿卡波糖抑制率(50％)的2倍。

应用实施例4

于96孔板中添加实验组(十肽(1mg/ml)20μl与α-葡萄糖苷酶酶液10μl)、背景组(十肽(1mg/ml)20μl与缓冲液10μl)、对照组(缓冲液10μl与α-葡萄糖苷酶酶液10μl)、阳性对照组(阿卡波糖溶液(1mg/ml)20μl与α-葡萄糖苷酶酶液10μl)，于37℃摇床反应20min。各孔中加入缓冲液50μl，底物溶液40μl，于37℃摇床反应20min后去除，加入140μlna2co3溶液终止反应。于405nm测吸光度并计算抑制率。由图2b可知，十肽对α-葡萄糖苷酶的抑制率是120％，是阿卡波糖抑制率(28％)的4倍。

序列表

<110>华南理工大学

<120>一种降血糖十肽

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>2

<211>10

<212>prt

<213>十肽(lrselaaws)

<400>2

leuargsergluleualaalatrpserarg

1510