本发明涉及一种银杏内酯类化合物的提取方法。
背景技术：
银杏(GinkgobilobaL)又名白果树、公孙树、鸭掌树，为银杏科银杏属多年生落叶乔木，有裸子植物活化石之称，是目前世界上生存的最古老的树种之一。按银杏科树木的化石推断，其历史可追溯到2亿年前。
对银杏的研究具有较长的历史。明代李时珍在《本草纲目》中写到：“银杏入肺经、益肺气、定哮喘、缩小便。”1932年，日本学者古川周二首次从银杏叶中提取了双黄酮类物质。1941年，中泽浩一又分离出了银杏黄素。随后，Borker等人从银杏黄素的混合物内分离出异银杏黄素和白果黄素两种双黄酮。中西香尔教授和他的研究小组从银杏叶提取物中发现的4个具有特殊结构的二萜内酯类(diterpenelactones)化合物即银杏内酯A、B、C和M(ginkgolideA、B、C、M)。
迄今为止，已从银杏叶中发现各种化合物达160多种，且在不断地发现新的成分。主要包括黄酮类化合物、银杏萜内酯、有机酸类、酚类、聚戊烯醇类、甾体化合物及营养元素等：如白果酸、白果酚、17种氨基酸、25种微量元素(Ca、Zn、Cu、P、B、Se、Fe、F、Cr等)；还具有蛋白质、糖类、维生素、叶绿素、胡萝卜素等。其中黄酮类和银杏萜内酯是银杏叶中发挥多方面独特药理活性的主要化学成分，内酯成分主要是银杏内酯A、B、C、M、J(式II)和白果内酯(式I)，银杏内酯的量对制剂的疗效和内在质量起着关键的作用，而且是银杏叶及其提取物和植物药制剂质量控制的重要依据。
银杏内酯A：R1为OH，R2为H，R3为H；
银杏内酯B：R1为OH，R2为OH，R3为H；
银杏内酯C：R1为OH，R2为OH，R3为OH；
银杏内酯M：R1为H，R2为OH，R3为OH；
银杏内酯J：R1为OH，R2为H，R3为OH。
因此，研发出一种提取银杏内酯类化合物的方法具有一定的生产应用价值。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种银杏内酯类化合物的提取方法，具有提取银杏内酯A、B、C的混合物的优点。
本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：
一种银杏内酯类化合物的提取方法，包括以下步骤：
(1)取银杏叶，在-20～-15℃和60～80Pa下冷冻干燥至含水量低于1wt％；取冻干后的银杏叶，加乙醇，在65～70℃下搅拌反应120～180min；加65～70℃的水，在65～70℃下搅拌60～90min；将反应体系冷却至25～30℃，加25～30℃的水，在25～30℃下搅拌30～35min；
按质量计，冻干后的银杏叶、乙醇、65～70℃的水和25～30℃的水的用量比为1∶3～4∶6～8∶3～4；
(2)向反应体系中加入烟酰胺，在25～30℃下搅拌90～120min，用0.22μm或0.45μm有机过滤膜过滤，取滤液；将滤液升温至45～50℃，析出固体，过滤取固体，烘干，即得；
按质量计，冻干后的银杏叶和烟酰胺的用量比为1∶0.08～0.10。
采用上述技术方案，得到高含量的银杏内酯A、银杏内酯B和银杏内酯C，降低产品中其他杂质(包括与银杏内酯A、银杏内酯B和银杏内酯C结构相似的银杏内酯M、银杏内酯J和白果内酯)的含量；产品可控，银杏内酯A、银杏内酯B和银杏内酯C的含量比为5∶2∶3，银杏内酯M、银杏内酯J和白果内酯的含量低于1wt％；利用溶剂结晶法来提取银杏提取物，并通过不同银杏内酯与烟酰胺的结合作用，不同结合物在水中溶解度不同，将银杏内酯A、银杏内酯B和银杏内酯C与其他银杏内酯分离开，再利用银杏内酯A、银杏内酯B和银杏内酯C与烟酰胺的结合力弱来加热将其分离开，从而获得高含量的银杏内酯A、银杏内酯B和银杏内酯C。与现有技术常用的柱分离不同成分相比，本申请的提取方法较为便捷、经济。
进一步优选为：步骤(2)中，在添加烟酰胺时，还添加有乙醚和沸石粉；按质量计，冻干后的银杏叶、烟酰胺、乙醚和沸石粉的用量比为1∶0.08～0.10∶0.5～1.0∶0.05～0.06。
采用上述技术方案，进一步提高银杏内酯A、银杏内酯B和银杏内酯C的含量，降低非银杏内酯、银杏内酯M、银杏内酯J和白果内酯的含量。
进一步优选为：还包括步骤(3)，步骤(3)包括以下步骤：
取烘干的固体，加入乙醚、水和聚丙烯酸，密封后于4～10℃下搅拌反应30～40min，于4～10℃和常压下敞口放置至表面溶剂挥干，于30～35℃烘干；
按质量计，烘干的固体、乙醚、水和聚丙烯酸的用量比为1∶0.15～0.20∶3～4∶0.01～0.02。
采用上述技术方案，对产品进行结晶处理，进一步提高含量的结晶物，产品较为稳定；进一步提高银杏内酯A、银杏内酯B和银杏内酯C的含量，降低银杏内酯M、银杏内酯J和白果内酯的含量，银杏内酯M、银杏内酯J和白果内酯的含量低于1wt％。
综上所述，本发明具有以下有益效果：
得到高含量的银杏内酯A、银杏内酯B和银杏内酯C，降低产品中其他杂质(包括与银杏内酯A、银杏内酯B和银杏内酯C结构相似的银杏内酯M、银杏内酯J和白果内酯)的含量；产品可控，银杏内酯A、银杏内酯B和银杏内酯C的含量比为5∶2∶3，银杏内酯M、银杏内酯J和白果内酯的含量低于0.1wt％；利用溶剂结晶法来提取银杏提取物，并通过不同银杏内酯与烟酰胺的结合作用，不同结合物在水中溶解度不同，将银杏内酯A、银杏内酯B和银杏内酯C与其他银杏内酯分离开，再利用银杏内酯A、银杏内酯B和银杏内酯C与烟酰胺的结合力弱来加热将其分离开，从而获得高含量的银杏内酯A、银杏内酯B和银杏内酯C。与现有技术常用的柱分离不同成分相比，本申请的提取方法较为便捷、经济。
具体实施方式
本具体实施例仅仅是对本发明的解释，其并不是对本发明的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本发明的保护范围内都受到专利法的保护。
实施例1：一种银杏内酯类化合物的提取方法，包括以下步骤：
(1)取银杏叶，在-20℃和80Pa下冷冻干燥至含水量低于1wt％；取冻干后的银杏叶，加乙醇，在65℃下搅拌反应180min；加65℃的水，在65℃下搅拌90min；将反应体系冷却至25℃，加25℃的水，在25℃下搅拌35min；
按质量计，冻干后的银杏叶、乙醇、65℃的水和25℃的水的用量比为1∶3∶6∶3；
(2)向反应体系中加入烟酰胺，在25℃下搅拌120min，用0.22μm有机过滤膜过滤，取滤液；将滤液升温至45℃，析出固体，过滤取固体，烘干；
按质量计，冻干后的银杏叶和烟酰胺的用量比为1∶0.08。
实施例2：一种银杏内酯类化合物的提取方法，与实施例1的不同之处在于，步骤(2)中，在添加烟酰胺时，还添加有乙醚和沸石粉；按质量计，冻干后的银杏叶、烟酰胺、乙醚和沸石粉的用量比为1∶0.08∶0.5∶0.05。
实施例3：一种银杏内酯类化合物的提取方法，与实施例2的不同之处在于，还包括步骤(3)，步骤(3)包括以下步骤：
取烘干的固体，加入乙醚、水和聚丙烯酸，密封后于4℃下搅拌反应40min，于4℃和常压(1个大气压)下敞口放置至表面溶剂挥干，于30℃烘干；
按质量计，烘干的固体、乙醚、水和聚丙烯酸的用量比为1∶0.15∶3∶0.01。
实施例4：一种银杏内酯类化合物的提取方法，包括以下步骤：
(1)取银杏叶，在-15℃和60Pa下冷冻干燥至含水量低于1wt％；取冻干后的银杏叶，加乙醇，在70℃下搅拌反应120min；加70℃的水，在70℃下搅拌60min；将反应体系冷却至30℃，加30℃的水，在30℃下搅拌30min；
按质量计，冻干后的银杏叶、乙醇、70℃的水和30℃的水的用量比为1∶4∶8∶4；
(2)向反应体系中加入烟酰胺，在30℃下搅拌90min，用0.45μm有机过滤膜过滤，取滤液；将滤液升温至50℃，析出固体，过滤取固体，烘干；
按质量计，冻干后的银杏叶和烟酰胺的用量比为1∶0.10。
实施例5：一种银杏内酯类化合物的提取方法，与实施例4的不同之处在于，步骤(2)中，在添加烟酰胺时，还添加有乙醚和沸石粉；按质量计，冻干后的银杏叶、烟酰胺、乙醚和沸石粉的用量比为1∶0.10∶1.0∶0.06。
实施例6：一种银杏内酯类化合物的提取方法，与实施例5的不同之处在于，还包括步骤(3)，步骤(3)包括以下步骤：
取烘干的固体，加入乙醚、水和聚丙烯酸，密封后于10℃下搅拌反应30min，于10℃和常压下敞口放置至表面溶剂挥干，于35℃烘干；
按质量计，烘干的固体、乙醚、水和聚丙烯酸的用量比为1∶0.20∶4∶0.02。
性能表征
1、含量测定
以10000g冻干后的银杏叶(含水量低于1wt％)为基准，测试终产品的生成量，测试终产品中银杏内酯A、B、C、M、J、白果内酯的含量。含量测定的方法参照倪琳等人在《中国实验方剂学杂志》2015年3月第21卷第6期发表的《HPLC同时测定脉平片中白果内酯、银杏内酯A和银杏内酯B、银杏内酯C的含量》，其中银杏内酯M和银杏内酯J也按同方法测定。平行试验5次，取平均值。测试结果如表1所示。
表1显示：
(1)实施例1-6的终产品中主要为银杏内酯A、银杏内酯B和银杏内酯C，其中的银杏内酯M、J、白果内酯的含量极低；
(2)相比实施例1，实施例2和实施例3的生成量更低，银杏内酯A、银杏内酯B和银杏内酯C的含量更高；相比实施例4，实施例5和实施例6的生成量更低，银杏内酯A、银杏内酯B和银杏内酯C的含量更高；
其中，实施例3和实施例6的银杏内酯A、银杏内酯B和银杏内酯C的总含量不低于99％；
(3)实施例1-6中，银杏内酯A：银杏内酯B：银杏内酯C(含量比)接近于5∶2∶3。
表1含量测定
2、应用测试
(1)对照组的制备
对照样1，即银杏内酯A；银杏内酯A参照CN103588785A的实施例1制备，产品中银杏内酯A的含量为95.4wt％。
对照样2，即银杏内酯B；银杏内酯B参照CN103588785A的实施例1制备，产品中银杏内酯B的含量为95.9wt％。
对照样3，即银杏内酯C；银杏内酯C参照CN101412722A的实施例1制备，产品中银杏内酯C的含量为94.3wt％。
对照样4，即银杏内酯M；银杏内酯M参照CN101747338A的实施例5制备，产品中银杏内酯M的含量为97.1wt％。
对照样5，即银杏内酯J；银杏内酯J参照CN101747338A的实施例4制备，产品中银杏内酯J的含量为95.0wt％。
对照样6，即白果内酯；白果内酯参照CN101318967A的实施例1制备，产品中白果内酯的含量为91.2wt％。
对照样7：将对照样1、对照样2和对照样3按质量比5∶2∶3混合。
对照样8：将对照样1、对照样2和对照样3按质量比1∶1∶1混合。
对照样9：将对照样7、对照样4、对照样5和对照样6按质量比100∶2∶2∶2混合。
对照样10：将对照样7、对照样4、对照样5和对照样6按质量比100∶1∶1∶1混合。
对照样11：将对照样7、对照样4、对照样5和对照样6按质量比100∶0.2∶0.2∶0.2混合。
对照样12：冻干后的银杏叶。
对照组13：空白对照。
(2)安全性试验
选取皮肤健康的志愿者组成受试人群380人，年龄在20～40岁之间，其中男性190人，女性190人，随机分为19组，每组20人，分别为试验组1～19，分别涂抹不同试验样(实施例1-6、对照样1-13)。将受试者左右手臂内侧距手掌基部5cm处，各确定4×4cm的面积作为受试部位。受试者在涂抹乳霜前，先将受试部位洗净，擦开水分后，涂抹于左右两臂内侧。每天早晚各涂抹一次，连续测试1月。观察受试者皮肤是否出现局部发红或剥落现象。
平行试验5次，取平均值。经观察，试验组1-19的受试者均无皮肤局部发红或剥落现象，使用后无刺激感。
(3)生化法检测酪氨酸酶活性
试验内容：①按表2中配比先配制两管B溶液，摇匀，在37℃水浴加热10min，在分光光度计中校正归零，在475nm波长下单点测定吸光度；②配制A溶液，摇匀，在37℃水浴加热10min，加入酶0.5ml，仍在37℃下加热5min，在分光光度计中以B为参比单点测量吸光度，用T2表示；③配制D和C溶液，按前述测T2的步骤测定C的吸光度值，用T1表示；④计算样品对酪氨酸酶的抑制率P，公式为P＝(T2-T1)/T2×100％。平行试验5次，取平均值。
表2测试溶液配制表
试验结果：结果如表3所示。表3显示：①和单独的银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯C、银杏内酯M、银杏内酯J或白果内酯(对照样1-6)相比，组合的银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯C、银杏内酯M、银杏内酯J或白果内酯对酪氨酸酶的抑制率更高；②实施例1-6、对照样7、对照样10对照样11对酪氨酸酶的抑制率高于其他试验样，说明银杏内酯A：银杏内酯B：银杏内酯C(含量比)为5∶2∶3且银杏内酯M、银杏内酯J或白果内酯的含量均低于1％时更佳；其中实施例3、实施例6、对照样7和对照样11为最佳实施例，说明银杏内酯A：银杏内酯B：银杏内酯C(含量比)为5∶2∶3且银杏内酯M、银杏内酯J或白果内酯的含量均不高于0.1％时最佳。
表3生化法检测酪氨酸酶活性
以上内容不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明，对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明由所提交的权利要求书确定的专利保护范围。