一种钙螯合肽及其制备方法和应用与流程

本发明属于功能性保健食品制备技术领域，具体涉及一种钙螯合肽及其制备方法和应用。

背景技术：

钙元素是骨矿物质的主要成分，人体主要通过摄入食物来获取钙，经研究发现，由钙摄入不足引起的钙代谢失衡，是人类各年龄段人群所发生的多种疾病的诱因。目前，钙营养不足已经成为世界性的营养现象，成人的日常推荐钙摄入量一般为1000mg/d，然而由于我国饮食结构问题，人民膳食钙的摄入量较为低下，远远达不到日常推荐摄入量的要求。据报道，一些饮食因素可能会影响钙的吸收，如银皮和种子中的植酸、菠菜中的草酸和茶中的鞣酸都可以减少钙的吸收。草酸被认为会通过形成钙的不溶盐来干扰钙的吸收。植酸是肌醇的六磷酸盐，结合钙和铁，使它们难以吸收利用。

钙螯合肽能够与钙离子形成可溶性络合物，其稳定性较高，并能够使钙离子以螯合物形式被小肠吸收利用，提高其生物利用率，同时也有利于钙离子的释放，是作为生物补钙剂的良好选择。目前越来越多的国内外研究者从动物、植物、海产蛋白资源中分离具有钙离子螯合活性的肽：大豆肽、鸭蛋清肽、酪蛋白磷酸肽等。经研究表明，水解胶原蛋白肽对骨关节炎和骨质疏松有着潜在的治疗作用。我国海产资源丰富，罗非鱼养殖和加工规模居世界首位，且由于产业结构的原因，加工过程中所产生的下脚料罗非鱼骨架未得到有效利用，造成资源浪费。

因此，如何利用获得具有高钙螯合活性的罗非鱼骨胶原蛋白源钙螯合肽，以及实现对罗非鱼骨的高值化利用，是制备钙元素补充剂亟需的研究方向。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术中罗非鱼骨架未得到有效利用的缺陷和不足，提供一种钙螯合肽。本发明提供的钙螯合肽具有较好的钙螯合活性，其钙螯合能力达43.018mg/g。

本发明的另一目的在于提供上述钙螯合肽的制备方法。

本发明的另一目的在于提供上述钙螯合肽在制备补钙制剂或功能性饮料中的应用。

为实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案：

一种钙螯合肽，所述钙螯合肽的氨基酸序列：gpagphgpvg（gly-pro-asp-gly-pro-his-gly-pro-val-gly）。

本发明提供的钙螯合肽安全无毒，与传统补钙剂相比具有更好的理化活性，其钙螯合能力达43.018mg/g；可在提高钙在人体中的吸收和生物利用率的同时，也可补充胶原蛋白肽，可用作药物开发以及生物补钙剂的原料。

优选地，所述钙螯合肽的分子量为844.4340da；所述钙螯合肽的钙螯合能力为43.018mg/g。

上述钙螯合肽的制备方法，包括如下步骤：

s1：将罗非鱼骨架进行酶解脱肉，碱洗脱脂，脱钙处理和酸处理后得到罗非鱼骨胶原蛋白；

s2：将s1所得罗非鱼骨胶原蛋白酶解后，灭酶，离心取上清液冻干；

s3：利用制备型反相高效液相色谱进行多级逐级分离纯化后，利用rt-hplc纯化即得到所述钙螯合肽。

本发明为以钙螯合活性为评价指标，采用制备型反相高效液相色谱和分析型高效液相色谱对罗非鱼骨胶原蛋白酶解产物进行分离纯化，即得到罗非鱼骨胶原蛋白源的钙螯合肽。

本发明提供的制备方法成功得到该钙螯合肽，可充分利用鱼产品资源，操作简单，为罗非鱼骨的高值化利用提供了新途径。

优选地，s1中所述酶解脱肉的过程为：将罗非鱼骨架切段，用中性蛋白酶酶解后，去除罗非鱼骨架上的碎肉。

优选地，s1中将罗非鱼骨架切成4~7cm的段状；所述中性蛋白酶酶解的时间为1~3h，温度为45~60℃，ph为7~8。

更为优选地，所述中性蛋白酶酶解的时间为2h，温度为55℃，ph为7.5。

优选地，s1中所述碱洗脱脂的过程为：利用无机碱性溶液清洗脱脂，然后清洗至中性。

更为优选地，所述无机碱性溶液为氢氧化钠溶液。

优选地，s1中所述脱钙处理的过程为：将碱洗脱脂后罗非鱼骨置于edta-2na溶液中，冷冻，搅拌，清洗至中性。

更为优选地，所述edta-2na溶液的ph为7.2，所述罗非鱼骨和edta-2na溶液的质量体积比为1:10。

优选地，s1中所述酸处理的过程为：脱钙后的鱼骨用酸性溶液处理后水洗至中性，即得到罗非鱼骨胶原蛋白。

更为优选地，所述酸性溶液为4%的盐酸溶液；所述酸处理的时间为18h。

优选地，s2中选用木瓜蛋白酶进行酶解；所述木瓜蛋白酶在酶解体系的质量分数为0.3~1%；所述酶解的时间为3~6h；所述酶解的温度为40~60℃；所述酶解的ph为6~7。

更为优选地，所述木瓜蛋白酶在酶解体系的质量分数为1%；所述酶解的时间为5h；所述酶解的温度为60℃；所述酶解的ph为7.0。

优选地，s3中所述rt-hplc的条件为：进样量为20ml；色谱柱为c18色谱柱；流动相为含有0.1wt%的tfa；洗脱速度为1.0ml/min；紫外检测波长为双检测波长：214nm、280nm。

上述钙螯合肽在制备补钙制剂或功能性饮料中的应用也在本发明的保护范围内。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明提供的钙螯合肽安全无毒，与传统补钙剂相比具有更好的理化活性，其钙螯合能力达43.018mg/g；可在提高钙在人体中的吸收和生物利用率的同时，也可补充胶原蛋白肽，可用作药物开发以及生物补钙剂的原料。本发明提供的制备方法成功得到该钙螯合肽，可充分利用鱼产品资源，操作简单，为罗非鱼骨的高值化利用提供了新途径。

附图说明

图1为脱钙粉碎后的罗非鱼骨胶原蛋白；

图2为制备型高效液相色谱第一次分离纯化（c1峰段为11~12.5min，c2峰段为12.5~16min，c3峰段为17~20min，c4峰段为21~22min，c5峰段为22~30min，c6峰段为20~38min，c7峰段为38~48min，c8峰段为48~60min）；

图3为制备型高效液相色谱第二次分离纯化；

图4为钙螯合肽（钙螯合活性肽单体）的分析型高效液相色谱；

图5为钙螯合肽肽（gly-pro-asp-gly-pro-his-gly-pro-val-gly）的hplc-ms鉴定图谱。

具体实施方式

下面结合实施例进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下例实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域常规条件或按照制造厂商建议的条件；所使用的原料、试剂等，如无特殊说明，均为可从常规市场等商业途径得到的原料和试剂。本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。

实施例1

本实施例提供一种钙螯合肽，其氨基酸序列为：gpagphgpvg（gly-pro-asp-gly-pro-his-gly-pro-val-gly）。

该钙螯合肽可通过如下制备方法制备得到：

（一）罗非鱼骨胶原蛋白的制备

a.酶解脱肉：将鱼骨架切成5cm左右，用中性蛋白酶对鱼骨架进行酶解2h（55℃，ph=7.5），以去除附于骨上的碎肉。

b.碱洗脱脂：酶解结束后洗去杂质后用naoh溶液进行脱脂，清洗至中性。

c.罗非鱼骨脱钙处理：将鱼骨放入edta-2na（ph=7.2，w/v=1:10）中，并置于4℃冷库中，期间进行定期搅拌，处理5d，随后将鱼骨清洗至中性后待用。

d.酸处理：将脱钙后的鱼骨用质量分数4%的盐酸处理18h后水洗至中性，即得到罗非鱼骨胶原蛋白（如图1）。

（二）罗非鱼骨胶原蛋白酶解

按照6%（w/w）比例向三级水中加入0.6g罗非鱼骨胶原蛋白，调ph精确至7.0，然后加入木瓜蛋白酶，酶用量1%（酶与鱼骨质量比：w/w），于温度60℃下酶解5h后，沸水浴中灭酶10min，置于室温下冷却，随后将样品4000r/min离心20min，取上清液冻干。

（三）钙螯合肽的分离纯化

1）c18制备型钢柱色谱层析分离：

①采用shimaduprc-ods钢柱（15mm，30mm×250mm），将酶解产物中钙螯合能力较好的组分冻干后，加一级水至其浓度为62mg/ml，过0.45um滤膜后再上样到的制备钢柱上，上样量为4ml，流速为：10ml/min,检测波长为214nm和280nm。用去离子水（含0.1%的tfa）和乙腈（含0.1的%tfa）梯度洗脱，洗脱程序如下：

根据液相色谱出峰时间的不同，将收集的组分分为六段命名为（c1、c2、c3、c4、c5、c6、c7、c8），组分经过50℃旋转蒸发浓缩后，移取到4ml离心管，经过-40℃,0.1kpa抽真空冻干，然后进行钙螯合活性测定筛选出活性组分c2。见图2。

②对上述组分c2在①系统中进一步分离纯化，采用相同的流速、洗脱液和检测波长，洗脱程序改变如下：

将第一次制备分离时所接取的c2组分在制备型高效液相色谱上进行第二次分离，获得c2-1、c2-2、c2-3、c2-4、c2-5、c2-6、c2-7及7七个峰，见图3。

2）分析型高效液相纯化单体

利用分析型高效液相色谱，采用c18柱（5m，4.6mm×250mm），将上述获得的组分c2-7进行纯化确认（见图4），流速为：10ml/min,检测波长为214nm和280nm。用水（含0.1%的tfa）和乙腈（含0.1%的tfa）梯度洗脱，洗脱程序如下：

3）采用邻甲酚酞比色法进行罗非鱼骨胶原钙螯合肽活性评价。取多肽样品5mg于10ml离心管中，加入1ml5mmol/l的cacl2和ph=7.8的0.2mol/l的磷酸钠缓冲液。取一支离心管不添加样品组作为空白对照组。然后置于摇床中混合液进行37ºc水浴反应60min。在取出进行离心，去除沉淀。将上清液稀释5倍后，再加入5倍体积的邻甲酚酞工作显色液，震荡混匀20s。在10min内，用酶标仪检测波长为570nm波长下的吸光度值，每个样品三个平行。在相同条件下制作钙含量-吸光值标准曲线：y=1.2522x+0.5884(r²=0.9824)，罗非鱼骨胶原肽钙螯合肽活性计算公式如下：

钙螯合活性（mg/g-peptide）=5x/1.667

结构检测：组分c2-7经检测为单一峰，利用高效液相色谱质谱联用技术（hplc-ms）测定得氨基酸序列为gly-pro-asp-gly-pro-his-gly-pro-val-gly。

测定结果表明：由表一可看出，酶解产物经过液相分离纯化，钙离子螯合活性提高至43.018mg/g-peptide。

表1罗非鱼骨胶原钙螯合肽活性

最后应当指出的是，以上实施例仅是本发明的具有代表性的例子。显然，本发明的技术方案并不限于上述实施例，还可有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明内容直接导出或联想到所有变形，均应认为是本发明的权利要求的保护范围。

序列表

<110>华南农业大学

<120>一种钙螯合肽及其制备方法和应用

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>10

<212>prt

<213>1(1)

<400>1

glyproalaglyprohisglyprovalgly

1510