一种辅助鉴定小麦粒重性状的方法及其专用引物组与流程

本发明涉及一种辅助鉴定小麦粒重性状的方法及其专用引物组。

背景技术

作为三大粮食作物之一，小麦是全球35％～40％人口的主要粮食。随着人口增加、耕地面积减少和极端气候的加剧，持续提高小麦单产已成为保障粮食安全所面临的严峻课题。遗传改良是提高产量的重要途径，通过分子技术发掘产量性状相关基因位点并进行辅助选择，可显著提高高产新品种选育效率。

粒重改良是提高小麦产量潜力的重要因子，大量研究已对其进行了qtl分析，但多数qtl效应不大、表达不稳定，未经验证，且与之连锁的标记多为ssr或snp芯片检测标记，通量低、灵活性差，使其在育种中的应用受到限制。

kasp(kompetitiveallele-specificpcr，竞争性等位基因特异性pcr)是由英国lgc(laboratoryofthegovernmentchemist，政府化学家实验室)开发的一项经济有效、灵活的snp分型技术，基于引物末端碱基的特异匹配和通用荧光探针对snp进行分型，可在96、384和1536孔pcr板中进行，荧光定量pcr仪或普通pcr仪结合酶标仪即可满足大部分用户的需求。与其他标记相比，kasp标记更适合应用于分子标记辅助选择育种。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种辅助鉴定小麦粒重性状的方法及其专用引物组。

本发明提供了kasp5b8引物组，由引物k5b8a、引物k5b8b和引物k5b8c组成；

引物k5b8a为如下(a1)或(a2)：

(a1)序列表的序列1所示的单链dna分子；

(a2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的dna分子；

引物k5b8b为如下(b1)或(b2)：

(b1)序列表的序列2所示的单链dna分子；

(b2)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的dna分子；

引物k5b8c为如下(c1)或(c2)：

(c1)序列表的序列3所示的单链dna分子；

(c2)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的dna分子。

本发明还提供了kasp5b9引物组，由引物k5b9a、引物k5b9b和引物k5b9c组成；

引物k5b9a为如下(d1)或(d2)：

(d1)序列表的序列5所示的单链dna分子；

(d2)将序列5经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列5具有相同功能的dna分子；

引物k5b9b为如下(e1)或(e2)：

(e1)序列表的序列6所示的单链dna分子；

(e2)将序列6经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列6具有相同功能的dna分子；

引物k5b9c为如下(f1)或(f2)：

(f1)序列表的序列7所示的单链dna分子；

(f2)将序列7经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列7具有相同功能的dna分子。

本发明还提供了一种引物组组合，由kasp5b8引物组和kasp5b9引物组组成。

本发明还保护一种试剂盒，包括kasp5b8引物组或kasp5b9引物组或所述引物组组合。

所述试剂盒还包括特异引物组。所述特异探针组由荧光探针a、淬灭探针a、荧光探针b和淬灭探针b；荧光探针a如序列表的序列9所示，5’末端连接荧光基团；荧光探针b如序列表的序列10所示，5’末端连接荧光基团；荧光探针a和荧光探针b中的荧光基团不同；淬灭探针a如序列表的序列11所示，3’末端连接淬灭基团；淬灭探针b如序列表的序列12所示，3’末端连接淬灭基团。荧光探针a具体连接fam荧光基团。荧光探针b具体连接hex荧光基团。淬灭探针a具体连接连接淬灭基团bhq。淬灭探针b具体连接淬灭基团bhq。

所述试剂盒还包括kasp2×mastermix。

本发明还保护kasp5b8引物组或kasp5b9引物组或所述引物组组合的应用，为如下(g1)至(g20)中的至少一种：

(g1)鉴定小麦基于kasp5b8位点的基因型；

(g2)鉴定小麦基于kasp5b9位点的基因型；

(g3)鉴定或辅助鉴定小麦的粒重性状；

(g4)鉴定或辅助鉴定小麦的千粒重性状；

(g5)鉴定或辅助鉴定小麦的粒长性状；

(g6)鉴定或辅助鉴定小麦的粒宽性状；

(g7)筛选或选育具有高粒重性状的小麦单株或株系或品系或品种；

(g8)筛选或选育具有高千粒重性状的小麦单株或株系或品系或品种；

(g9)筛选或选育具有长粒长性状的小麦单株或株系或品系或品种；

(g10)筛选或选育具有宽粒宽性状的小麦单株或株系或品系或品种；

(g11)制备用于鉴定小麦基于kasp5b8位点的基因型的产品；

(g12)制备用于鉴定小麦基于kasp5b9位点的基因型的产品；

(g13)制备用于鉴定或辅助鉴定小麦的粒重性状的产品；

(g14)制备用于鉴定或辅助鉴定小麦的千粒重性状的产品；

(g15)制备用于鉴定或辅助鉴定小麦的粒长性状的产品；

(g16)制备用于鉴定或辅助鉴定小麦的粒宽性状的产品；

(g17)制备用于筛选或选育具有高粒重性状的小麦单株或株系或品系或品种的产品；

(g18)制备用于筛选或选育具有高千粒重性状的小麦单株或株系或品系或品种的产品；

(g19)制备用于筛选或选育具有长粒长性状的小麦单株或株系或品系或品种的产品；

(g20)制备用于筛选或选育具有宽粒宽性状的小麦单株或株系或品系或品种的产品；

本发明还保护所述试剂盒的应用，为如下(g1)至(g10)中的至少一种：

(g1)鉴定小麦基于kasp5b8位点的基因型；

(g2)鉴定小麦基于kasp5b9位点的基因型；

(g3)鉴定或辅助鉴定小麦的粒重性状；

(g4)鉴定或辅助鉴定小麦的千粒重性状；

(g5)鉴定或辅助鉴定小麦的粒长性状；

(g6)鉴定或辅助鉴定小麦的粒宽性状；

(g7)筛选或选育具有高粒重性状的小麦单株或株系或品系或品种；

(g8)筛选或选育具有高千粒重性状的小麦单株或株系或品系或品种；

(g9)筛选或选育具有长粒长性状的小麦单株或株系或品系或品种；

(g10)筛选或选育具有宽粒宽性状的小麦单株或株系或品系或品种。

以上任一所述kasp5b8位点为小麦基因组中的序列表的序列4所示dna分子的第19位核苷酸；

以上任一所述kasp5b9位点为小麦基因组中的序列表的序列8所示dna分子的第24位核苷酸。

本发明还保护一种鉴定待测小麦的籽粒性状的方法，包括如下步骤：检测待测小麦基于特异snp的基因型；tt基因型小麦的籽粒性状优于cc基因型小麦；籽粒性状优体现为粒重高和/或千粒重高和/或粒长长和/或粒宽宽；所述特异snp(kasp5b8)为小麦基因组中的序列表的序列4所示dna分子的第19位核苷酸。所述特异snp为t/c多态。

本发明还保护一种鉴定待测小麦的籽粒性状的方法，包括如下步骤：检测待测小麦基于特异snp的基因型；tt基因型小麦的籽粒性状优于cc基因型小麦；籽粒性状优体现为粒重高和/或千粒重高和/或粒长长和/或粒宽宽；所述特异snp(kasp5b9)为小麦基因组中的序列表的序列8所示dna分子的第24位核苷酸。所述特异snp为t/c多态。

本发明还保护一种鉴定待测小麦的籽粒性状的方法，包括如下步骤：

(1)以待测小麦的基因组dna为模板，采用kasp5b8引物组进行kasp；

(2)完成步骤(1)后，进行荧光扫描，确定待测小麦基于特异snp的基因型；

(3)根据基因型结果进行判断：tt基因型小麦的籽粒性状优于cc基因型小麦；

籽粒性状优体现为粒重高和/或千粒重高和/或粒长长和/或粒宽宽；

所述特异snp(kasp5b8)为小麦基因组中的序列表的序列4所示dna分子的第19位核苷酸。所述特异snp为t/c多态。

本发明还保护一种鉴定待测小麦的籽粒性状的方法，包括如下步骤：

(1)以待测小麦的基因组dna为模板，采用kasp5b9引物组进行kasp；

(2)完成步骤(1)后，进行荧光扫描，确定待测小麦基于特异snp的基因型；

(3)根据基因型结果进行判断：tt基因型小麦的籽粒性状优于cc基因型小麦；

籽粒性状优体现为粒重高和/或千粒重高和/或粒长长和/或粒宽宽；

所述特异snp(kasp5b9)为小麦基因组中的序列表的序列8所示dna分子的第24位核苷酸。所述特异snp为t/c多态。

本发明还保护一种特异dna分子，如序列表的序列4或序列表的序列8所示。

本发明还保护所述特异dna分子在鉴定小麦籽粒性状中的应用。所述应用中，所述特异dna分子作为检测靶标。

以上任一所述籽粒性为粒重和/或千粒重和/或粒长和/或粒宽。

以上任一所述方法可用于小麦育种，选择tt基因型的小麦进行育种。所述育种的目的为获得籽粒性状优的小麦。

以上任一所述kasp的反应体系中，两条上游引物的浓度均为0.132μm，下游引物的浓度为0.330μm。

以上任一所述kasp的反应程序如下：

步骤一：94℃、15min；

步骤二：94℃、20s，65℃、1min；94℃、20s，64℃、1min；94℃、20s，63℃、1min；94℃、20s，62℃、1min；94℃、20s，61℃、1min；94℃、20s，60℃、1min；94℃、20s，59℃、1min；94℃、20s，58℃、1min；94℃、20s，57℃、1min；94℃、20s，56℃、1min；

步骤三：94℃20s、57℃1min，32个循环。

以上任一所述确定待测小麦基于特异snp的基因型的方法为：采用多功能酶标仪进行扫描(fam激发波长为485nm，发射波长为520nm；hex激发波长为535nm，发射波长为556nm；系统参比荧光rox激发波长为575nm，发射波长为610nm)，采用klustercaller软件对酶标仪扫描数据进行分析，显示为红色的样本的基因型为cc纯合型，显示为蓝色的样本的基因型为tt纯合型。

以上任一所述确定待测小麦基于特异snp的基因型的方法为：采用多功能酶标仪进行扫描(fam激发波长为485nm，发射波长为520nm；hex激发波长为535nm，发射波长为556nm；系统参比荧光rox激发波长为575nm，发射波长为610nm)，采用klustercaller软件对酶标仪扫描数据进行分析，显示为红色的样本的基因型为cc纯合型，显示为蓝色的样本的基因型为tt纯合型，显示为绿色的样本的基因型为ct杂合型。

本发明的发明人对中麦871/中麦895的重组自交系(ril)群体进行遗传分析，在5b染色体定位一个新的控制千粒重、粒长、粒宽和平均灌浆速率的多效qtl。该qtl表现稳定，与其紧密连锁的kasp标记kasp5b8和kasp5b9已在高代育种品系中得到验证，可用于分子标记辅助育种。本发明对与培育高产小麦具有重大应用价值。

附图说明

图1为中麦871/中麦895的ril群体千粒重、粒长、粒宽和平均灌浆速率的频率分布。

图2为粒重相关性状qtl在5b染色体上的位置。

图3为实施例3中检测kasp5b8标记的部分结果。

图4为实施例3中检测kasp5b9标记的部分结果。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

中麦895是由中国农业科学院作物科学研究所和棉花研究所联合选育的品种，具有大粒饱满度好、后期灌浆速率快、抗干热风等优点，2012年通过黄淮冬麦区南片国家审定。

实施例1、新的粒重相关性状qtl的发现以及kasp引物组的设计

一、性状调查

于2015-2017年度在河南安阳、商丘、周口以及陕西咸阳共10个环境中对中麦871/中麦895的ril群体266个家系的千粒重、粒长、粒宽和平均灌浆速率(6个环境)进行鉴定。中麦871/中麦895的ril群体千粒重(tgw)、粒长(gl)、粒宽(gw)和平均灌浆速率(gfr)的频率分布见图1。上述性状均表现为连续性变化，为典型的数量性状特征。与中麦871相比，中麦895在所有环境中均表现为千粒重较高，籽粒较大且平均灌浆速率较快。性状间均呈显著正相关：千粒重与粒宽、平均灌浆速率关系密切(r＝0.75和0.88)，与粒长呈中等程度相关(r＝0.43)；粒宽与平均灌浆速率呈中等程度相关(r＝0.64)；粒长与平均灌浆速率、粒宽呈弱相关(r＝0.38和0.26)。

二、kasp标记开发

根据2015年度3个环境的千粒重，选择30个高千粒重和30个低千粒重的家系以及亲本。提取基因组dna，利用660ksnp芯片鉴定基因型。在630517个snp标记中，有39189个标记缺失率小于20％、奇异分离频率大于20％，且在亲本间有多态性。利用icimapping4.1软件中bin功能去除冗余标记，对剩余的5745个标记利用joinmap4.0软件分组并构建连锁图，其中4231个标记被分到65个连锁群中，分布在除3d以外的20个染色体上。利用icimapping4.1软件bip功能中单标记分析法(siglemarkeranalysis，sam)在5b染色体上分别发现2个与千粒重和13个与粒长显著相关的标记(见表1和图2)。初步表明这些标记所在区域含有一个控制千粒重和粒长的qtl。

表1

将与该qtl紧密连锁的snp标记转化为kasp标记，检测中麦871/中麦895的ril群体266个家系的基因型。利用joinmap4.0软件构建了一条长19.3cm的连锁图。结合10个环境的千粒重、粒长、粒宽数据和6个环境的平均灌浆速率数据，利用icimapping4.1软件bip功能中完备区间作图法(inclusivecompositeintervalmapping，icim)进行qtl定位。结果见表2。结果表明，5b染色体确实存在一个控制千粒重和粒长的qtl，且该qtl对粒宽和平均灌浆速率有显著作用，可分别解释千粒重、粒长、粒宽和平均灌浆速率表型变异的5.5％～17.3％、12.5％～20.5％、6.0％～6.5％和4.7％～13.0％，为稳定的主效qtl。该qtl的优异等位变异来自中麦895。

表2

用于检测kasp5b8标记的引物组命名为kasp5b8引物组，由两条上游引物(k5b8a和k5b8b)和一条下游引物(k5b8c)组成。

k5b8c(序列3)：5’-cgatgatactagattcaaccgtgtt-3’。

特异snp(kasp5b8)位于小麦基因组中的序列表的序列4所示dna分子的第19位核苷酸，为t/c多态。基于特异snp(kasp5b8)，中麦895的基因型为tt纯合型，中麦871的基因型为cc纯合型。

用于检测kasp5b9标记的引物组命名为kasp5b9引物组，由两条上游引物(k5b9a和k5b9b)和一条下游引物(k5b9c)组成。

k5b9c(序列7)：5’-acataccaccgtctcgtct-3’。

特异snp(kasp5b9)位于小麦基因组中的序列表的序列8所示dna分子的第24位核苷酸，为t/c多态。基于特异snp(kasp5b9)，中麦895的基因型为tt纯合型，中麦871的基因型为cc纯合型。

实施例2、方法的建立

1、提取待测小麦的叶片的基因组dna。

2、采用kasp5b8引物组或kasp5b9引物组进行kasp。

kasp2×mastermix为lgc公司产品(货号kbs-1016-002)。kasp2×mastermix中含有荧光探针a、荧光探针b、淬灭探针a、淬灭探针b、高保真taq酶、dntp、mg²⁺等。荧光探针a的序列为5’-gaaggtgaccaagttcatgct-3’，5’末端连接fam荧光基团。荧光探针b的序列为5’-gaaggtcggagtcaacggatt-3’，5’末端连接hex荧光基团。淬灭探针a的序列为5’-agcatgaacttggtcaccttc-3’，3’末端连接淬灭基团bhq。淬灭探针b的序列为5’-aatccgttgactccgaccttc-3’，3’末端连接淬灭基团bhq。

反应体系(5μl)：2.5μlkasp2×mastermix、引物组中的各条引物、基因组dna(dna含量约为75ng)，余量为无菌蒸馏水。引物组为kasp5b8引物组或kasp5b9引物组。反应体系中，两条上游引物的浓度均为0.132μm，下游引物的浓度为0.330μm。

反应程序：

步骤一：94℃、15min；

步骤二：94℃、20s，65℃、1min；94℃、20s，64℃、1min；94℃、20s，63℃、1min；94℃、20s，62℃、1min；94℃、20s，61℃、1min；94℃、20s，60℃、1min；94℃、20s，59℃、1min；94℃、20s，58℃、1min；94℃、20s，57℃、1min；94℃、20s，56℃、1min；

步骤三：94℃20s、57℃1min，32个循环。

3、进行荧光扫描。

完成步骤2后，采用多功能酶标仪进行扫描。fam激发波长为485nm，发射波长为520nm。hex激发波长为535nm，发射波长为556nm。系统参比荧光rox激发波长为575nm，发射波长为610nm。

4、进行等位基因分型。

完成步骤3后，采用klustercaller软件对酶标仪扫描数据进行分析，根据分析结果确定待测小麦基于特异snp的基因型。

对于kasp5b8标记来说：显示为红色的样本的基因型为cc纯合型，显示为蓝色的样本的基因型为tt纯合型，显示为绿色的样本的基因型为ct杂合型。显示为黑色的样本为以水为模板的空白对照。显示为红色的样本聚集在靠近y轴附近。显示为蓝色的样本聚集在靠近x轴附近。显示为绿色的样本聚集在对角线附近。

对于kasp5b9标记来说：显示为红色的样本的基因型为cc纯合型，显示为蓝色的样本的基因型为tt纯合型，显示为绿色的样本的基因型为ct杂合型。显示为黑色的样本为以水为模板的空白对照。显示为红色的样本聚集在靠近y轴附近。显示为蓝色的样本聚集在靠近x轴附近。显示为绿色的样本聚集在对角线附近。

实施例3、检测中麦871/中麦895的ril群体

采用实施例2建立的方法检测实施例1中获得的中麦871/中麦895的ril群体。

检测kasp5b8标记的部分结果见图3。

检测kasp5b9标记的部分结果见图4。

实施例4、鉴定192个高代新品系

一、制备192个高代新品系

所用192个高代品系由中国农业科学院作物科学研究所和棉花研究所联合选育而成，均采用系谱法选育，自交4代的后代进行检测。系谱信息见表3。表3的系谱信息中，/代表第1次杂交、前面为母本后面为父本，//代表第2次杂交，前面为母本后面为父本。以品系1为例，进行示例性解释如下：石新828为母本、周麦23为父本进行第1次杂交，第1次杂交得到的后代为母本、良星619为父本进行第2次杂交，第2次杂交的后代进行连续4代自交，得到的后代进行检测。以品系3为例，进行示例性解释如下：10ca118为母本、山农05-066为父本进行第1次杂交，第1次杂交得到的后代进行连续4代自交，得到的后代进行检测。

二、性状调查

于2016-2017年度在两地(安阳和新乡)种植待测小麦(待测小麦为步骤一得到的192个高代新品系)，平行条件下进行正常的田间管理，收获后统计千粒重、粒长和粒宽。结果见表3。表3中，千粒重的单位为g，粒长的单位为mm，粒宽的单位为mm。

三、检测基因型

采用实施例2建立的方法检测步骤一得到的192个高代新品系的基因型。

结果见表3。表3中，自右侧开始，第一列为基于kasp5b9标记的基因型，第二列为基于kasp5b8标记的基因型。

对各个待测小麦中的目标区段进行测序，结果与表3均一致。

表3

注：-代表基因型缺失。

对表3的数据进行统计分析，kasp5b8标记的相应结果见表4。tt基因型为优势基因型。

表4

注：***表示0.001显著水平。

对表3的数据进行统计分析，kasp5b9标记的相应结果见表5。tt基因型为优势基因型。

表5

注：**表示0.01显著水平，***表示0.001显著水平。

结果表明，kasp5b8标记和kasp5b9标记与千粒重、粒长、粒宽显著相关。携带中麦895中的等位变异可使千粒重、粒长和粒宽显著提高3g、0.3mm和0.1mm。

sequencelisting

<110>中国农业科学院作物科学研究所

<120>一种辅助鉴定小麦粒重性状的方法及其专用引物组

<130>gncyx181736

<160>12

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>40

<212>dna

<213>artificialsequence

<400>1

gaaggtgaccaagttcatgctgccatgcactcctggtact40

<210>2

<211>40

<212>dna

<213>artificialsequence

<400>2

gaaggtcggagtcaacggattgccatgcactcctggtacc40

<210>3

<211>25

<212>dna

<213>artificialsequence

<400>3

cgatgatactagattcaaccgtgtt25

<210>4

<211>94

<212>dna

<213>triticumaestivum

<220>

<221>misc_feature

<222>(19)

<223>y=torc

<400>4

gccatgcactcctggtacyttgccagcaagcttgagctgtgaagtgtacaaacacccagc60

ttgaccacgaacacggttgaatctagtatcatcg94

<210>5

<211>45

<212>dna

<213>artificialsequence

<400>5

gaaggtgaccaagttcatgctgcattcgagttagcaaaaagagat45

<210>6

<211>45

<212>dna

<213>artificialsequence

<400>6

gaaggtcggagtcaacggattgcattcgagttagcaaaaagagac45

<210>7

<211>19

<212>dna

<213>artificialsequence

<400>7

acataccaccgtctcgtct19

<210>8

<211>69

<212>dna

<213>triticumaestivum

<220>

<221>misc_feature

<222>(24)

<223>y=torc

<400>8

gcattcgagttagcaaaaagagaygctttatatatcctgtgtactgaactagacgagacg60

gtggtatgt69

<210>9

<211>21

<212>dna

<213>artificialsequence

<400>9

gaaggtgaccaagttcatgct21

<210>10

<211>21

<212>dna

<213>artificialsequence

<400>10

gaaggtcggagtcaacggatt21

<210>11

<211>21

<212>dna

<213>artificialsequence

<400>11

agcatgaacttggtcaccttc21

<210>12

<211>21

<212>dna

<213>artificialsequence

<400>12

aatccgttgactccgaccttc21