一种猪凝血酶的制备方法与流程

本发明涉及一种猪凝血酶的制备方法。
背景技术：
：凝血酶(thombin,ec3.4.21.5)是在血液凝固系统中起重要作用的丝氨酸蛋白水解酶，由凝血酶原激活物激活而成，具有较高的专一性，是近年来国内开发的一种新型速效局部止血药，临床上广泛应用于消化道出血和外科手术止血。高纯度的凝血酶在基因工程后序加工处理中具有特殊作用。凝血酶止血机理是促使血液中的纤维蛋白原转化为纤维蛋白，同时促使血小板聚集，加速血液凝固，达到迅速止血的目的。目前国内外主要从动物血浆几人血浆中制备凝血酶原，再经激活物激活而成为凝血酶。凝血酶是一种蛋白质，其制备方法一般包括三个基本步骤：即提取、纯化和冻干，中国专利cn201010230028.6的生产包括以下步骤：1)血液中加入抗凝剂，离心分离得血浆；2)血浆加入bacl2，得到凝血酶原沉淀；3)凝血酶原沉淀用edta溶解洗涤离心提纯；4)溶解沉淀，用cacl2激活，得到凝血酶；专利号cn200510010518.4生产步骤包括1)血液中加入抗凝剂，离心分离得血浆；2)制备猪凝血酶原活酶复合物3)通过等电点沉淀法，离心得到凝血酶原溶液4)用猪凝血酶原活酶复合物激活凝血酶原溶液，得到凝血酶。以上两个专利所得的凝血酶杂蛋白较多，而且未处理凝血酶制剂中可能存在的病毒，存在安全隐患，凝血酶作为血液提取物，属于含病毒高危制品，但工艺中没有病毒灭活步骤，严重影响产品的安全性。技术实现要素：本发明要解决的技术问题是克服现有技术中制备的凝血酶的杂质较多，而且对凝血酶制剂中可能存在的病毒未做处理，存在安全隐患的缺陷，提供一种猪凝血酶的制备方法。为了解决上述技术问题，本发明提供了如下的技术方案：一种猪凝血酶的制备方法，包括以下步骤：1)血浆的制备向收集的新鲜猪血中加入柠檬酸钠溶液，15℃以下，离心分离血红细胞和血浆，所得血浆置于-20℃冻存；2)s/d法病毒灭活将经过室温解冻的血浆用定性滤纸过滤，所得滤液加入曲拉通x-100和磷酸三丁酯，搅拌3～6小时；3)凝血酶原粗品制备将经过s/d灭活处理的血浆用定性滤纸过滤，所得滤液中加入deaesephadexa-50凝胶，搅拌；过滤，弃去滤液；配置0.01～0.1mol/l的柠檬酸钠、0.05～0.8mol/l氯化钠溶液的高盐洗涤液，先用高盐溶液淋洗凝胶除去杂蛋白；再用高盐溶液洗脱液浸泡凝胶10～20分钟，过滤，重复三次或三次以上，收集滤液；4)凝血酶激活液制备向上述滤液中加入氯化钙溶液，调整滤液中ca+的浓度最终调节为0.02～0.15mol/l，25℃～32℃搅拌激活0.5小时；5)凝血酶纯化以sp-sepharoseff填充的柱子，将上述凝血酶激活液按1:3～6的比例用柠檬酸钠溶液稀释，上样；上样完毕后用高盐洗涤液淋洗≥3个柱体积，洗涤杂蛋白；再用高盐洗涤液洗脱2个柱体积，收集凝血酶纯品；6)超滤脱盐将上述收集液进行超滤脱盐；7)纳米膜除病毒将dv20ni0552纳滤膜正确安装后，给储液罐中的超滤浓缩液加压，维持滤膜前后的压差在2～5bar，过滤超滤浓缩液，得到凝血酶溶液。进一步的，所述步骤2)中曲拉通x-100和磷酸三丁酯的添加量为0.3％-2％。进一步的，所述高盐洗涤液的ph为6～9。进一步的，将所述步骤5)中高盐洗涤液中的柠檬酸钠替换为柠檬酸三钠或三(羟甲基)氨基甲烷。优选的，一种猪凝血酶的制备方法，包括以下步骤：1)血浆的制备向收集的新鲜猪血中按20:1的比例加入10％的柠檬酸钠溶液；15℃以下，3500r/min离心分离血红细胞和血浆，所得血浆置于-20℃冻存。2)s/d法病毒灭活将经过室温解冻的血浆用定性滤纸过滤，所得滤液加入曲拉通x-100和磷酸三丁酯，室温下搅拌3～6小时。3)凝血酶原粗品制备将经过病毒灭活处理的血浆用定性滤纸过滤，所得滤液按10:1加入deaesephadexa-50凝胶，搅拌30分钟；过滤，弃去滤液；用3倍与凝胶体积的0.02mol/l柠檬酸钠+0.1mol/l氯化钠洗涤液淋洗凝胶除去杂蛋白；再用等体积的0.02mol/l柠檬酸钠+0.5mol/l氯化钠洗脱液浸泡凝胶15分钟，过滤，重复三次，收集滤液。4)凝血酶激活液制备向上述滤液中加入氯化钙溶液，使滤液中ca+的浓度最终调节为0.05mol/l，30℃搅拌激活0.5小时5)凝血酶纯化准备以sp-sepharoseff填充的柱子，将上述凝血酶激活液按1:5的比例用0.02mol/l柠檬酸钠溶液稀释，上样；上样完毕后用0.02mol/l柠檬酸钠+0.1mol/l氯化钠洗涤液淋洗3个柱体积，洗涤杂蛋白；再用0.02mol/l柠檬酸钠+0.3mol/l氯化钠洗脱液洗脱2个柱体积，收集凝血酶纯品。6)超滤脱盐将上述收集液进行超滤脱盐，氯离子浓度检测效果等同于自来水含氯检测效果，即脱盐完毕。7)纳米膜除病毒将dv20ni0552纳滤膜正确安装后，给储液罐中的超滤浓缩液加压，维持滤膜前后的压差在3bar左右，过滤超滤浓缩液，得到凝血酶溶液。本发明所达到的有益效果是：本发明通过到工艺过程中的两步联合病毒灭活步骤，有效的控制了终产品中的病毒含量，提高了凝血酶的安全性；人为添加病毒bvdv，prv，vsv，emcv，ppv后，经过第三方病毒灭活工艺验证，病毒降低量(log10)≥4logs(表1)，两步联合灭活/除病毒工艺为有效操作，符合国家标准。附图说明附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：图1是本发明实施例1和实施例2的工艺流程图；图2是marker电泳图谱。具体实施方式以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。实施例1根据附图1的工艺流程图配置10％柠檬酸钠溶液2.5kg，与50kg新采集的新鲜猪血50kg搅拌均匀，离心的血浆22kg。向血浆中加入220ml曲拉通x-100和220ml磷酸三丁酯，温度控制24℃，搅拌4小时。血浆经过定性滤纸过滤后，加入2.2kgdeaesephadexa-50凝胶，搅拌30min，过滤，滤饼用8kg0.03mol/l柠檬酸钠和0.1mol/l氯化钠溶液淋洗，取出凝胶再用2.5kg左右的0.03mol/l柠檬酸钠和0.5mol/l氯化钠溶液浸泡15min，过滤，重复三次，合并滤液约7.5kg。加入cacl2，是滤液中ca+的浓度调整为0.05mol/l，30℃搅拌激活30min。用0.03mol/l柠檬酸钠稀释上述滤液到45kg。准备sp-sepharoseff柱子，上述液体直接上样，上样完毕后，用0.03mol/l柠檬酸钠和0.1mol/l氯化钠溶液淋洗6kg，弃去，再用0.03mol/l柠檬酸钠和0.3mol/l氯化钠4kg洗脱凝血酶，得到凝血酶溶液。该溶液经过超滤脱盐后，用dv20ni0552纳滤膜除去病毒，得到凝血酶溶液。实施例2根据附图1的工艺流程图配置10％柠檬酸钠溶液2.5kg，与50kg新采集的新鲜猪血50kg搅拌均匀，离心的血浆22kg。向血浆中加入330ml曲拉通x-100和330ml磷酸三丁酯，温度控制26℃，搅拌4小时。血浆经过定性滤纸过滤后，加入2.3kgdeaesephadexa-50凝胶，搅拌30min，过滤，滤饼用8kg0.05mol/l柠檬酸钠和0.1mol/l氯化钠溶液淋洗，取出凝胶再用2.5kg左右的0.05mol/l柠檬酸钠和0.5mol/l氯化钠溶液浸泡15min，过滤，重复三次，合并滤液约7.5kg。加入cacl2，是滤液中ca+的浓度调整为0.08mol/l，30℃搅拌激活30min。用0.05mol/l三(羟甲基)氨基甲烷稀释上述滤液到45kg。准备sp-sepharoseff柱子，上述液体直接上样，上样完毕后，用0.05mol/l三(羟甲基)氨基甲烷和0.1mol/l氯化钠溶液淋洗6kg，弃去，再用0.05mol/l三(羟甲基)氨基甲烷和0.3mol/l氯化钠4kg洗脱凝血酶，得到凝血酶溶液。该溶液经过超滤脱盐后，用dv20ni0552纳滤膜除去病毒，得到凝血酶溶液。病毒灭活工艺验证人为添加病毒bvdv，prv，vsv，emcv，ppv后，经过第三方病毒灭活工艺验证，病毒降低量(log10)≥4logs(表1)，两步联合灭活/除病毒工艺为有效操作，符合国家标准。表1病毒灭活工艺验证注：bvdv：牛腹泻病毒；prv：伪狂犬病毒；vsv：水疱性口炎病毒；emcv：脑心肌炎病毒；ppv：猪细小病毒在附图2中各条带的含义具体如下：激活液二次纯化前的激活液0.1m氯化钠浓度为0.1mol/lmarker不同分子量对照0.3m-1氯化钠浓度为0.3mol/l，收集的第一个柱体积0.3m-2氯化钠浓度为0.3mol/l，收集的第二个柱体积0.3m-3氯化钠浓度为0.3mol/l，收集的第三个柱体积0.3m-4氯化钠浓度为0.3mol/l，收集的第四个柱体积从图2的marker电泳确认可知，两步纯化明显提高了凝血酶的纯度，同时控制了s/d的残留，提高了纳滤膜除病毒的效率。总效价下降为纯化前的90％，蛋白总量下降为纯化前的2.9％，从图2中可以看出大量杂蛋白被除去；表2两步纯化前后的蛋白质含量结果最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。当前第1页12