一种基于器官芯片的人早期胎盘发育模型建立方法与流程

本发明涉及胎盘发育学，组织仿生以及细胞生物学研究的技术领域，具体涉及一种基于器官芯片的人早期胎盘发育模型建立方法。

背景技术：

胎盘是连接母体与胎儿的重要器官，也是胎儿与母体之间物质交换的重要器官。胎儿在子宫中发育，依靠胎盘从母体取得营养，以维持正常妊娠。越来越多的研究表明，人类儿童期甚至成年期的疾病，都和胎盘的生长发育有关。继美国启动人类胎盘计划后，中国的产科专家，也愈发关注对这一孕育生命的关键器官的研究。研究内容涉及胎盘结构、感染与炎症、基因组学与胎盘、胎盘功能等诸多领域。因此，能在细胞水平或者分子水平上探索人类胎盘的发生具有极大的应用价值。

胎盘是第一个分化的胚胎外组织，它起源于囊胚的外层(受精5天后)，被称为滋养层。这些细胞是滋养细胞的前体，围绕着充满液体的腔体来保护胚胎细胞。在母体子宫内植入人类胚胎后，它们有一种特殊的能力附着并侵入子宫壁。尽管胎盘发育具有基本的临床意义，但由于人类胚胎植入期的研究太少，以及人类与其他常用动物和细胞模型之间胎盘发生的显著差异，人类早期胎盘发育仍是一个谜。即使是最近在体外的研究进展，包括人类体外胚胎培养，或研究早期人类胚胎发生，人类胎盘的发育尚不清楚。

人体多能干细胞(hpscs)，在自我更新的基态与胚胎细胞相似，已经成功地应用于在胚胎植入阶段的小鼠胚胎发育研究中。尽管从脊椎动物发育的研究中获得的宝贵经验有助于我们产生体外人类胚胎，但人类hpscs在建模早期发育方面的适用性仍未确定。而在传统的2d条件下诱导hpscs细胞分化，虽然可以在细胞生长的不同时期表现出不同的滋养层细胞亚型，但其在结构上与生理情况还大不相同，而在体外模拟早期胎盘在三维基质中发育除了近生理的三维结构外，其在滋养层细胞分化效率及功能表达方面也有很大优势，因此，hpscs能够在体外模拟人早期胎盘形成的能力是极其有研究价值的。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种基于器官芯片的人早期胎盘发育模型建立方法，该方法是在3d基质中研究胎盘的发育，这一方法构建的模型具有近生理的三维结构，且与传统的二维单层相比，这些空腔也显示了滋养细胞的高效分化。该模型可为探索人类胎盘发生和胚胎发生在细胞水平和分子机制研究中提供平台。

本发明一种基于器官芯片的人早期胎盘发育模型建立方法，使用了一种三维基质材料，该三维基质材料为市购人工基底膜(matrigel)，按照以下步骤进行：

(1)孔板修饰与人多能干细胞(hpsc)接种培养

6孔板先用人工基底膜(matrigel)修饰并放于4°冰箱，之后放入37°培养箱20-50min，用细胞消化液室温消化，用细胞刮板刮下细胞团，离心600r1-3min，细胞用含y27632的mtesr1培养基重悬使细胞为小团块后接种于已修饰好的6孔板，37°培养1-4h后将培养液更换为不含y27632的mtesr1培养基培养。

所述修饰6孔板所用人工基底膜稀释倍数范围为1：500-1：1000，每孔1.5ml稀释液放于4°冰箱的时间范围为4小时-7天，培养基中含y27632的浓度范围为1-100mm。

(2)细胞消化并接种于三维基质中

待hpsc细胞生长为70％-90％后用消化液室温消化，用细胞刮板刮下细胞团，离心600r1-3min，将上清液体吸走，用培养基将matrigel稀释到一定比例后将细胞重悬得到合适的接种密度并接种，37°培养箱放置20-40min使悬有细胞的matrigel固化，之后仍为含bmp4的诱导hpsc分化的培养基。

所述matrigel稀释具体为培养基：matrigel的体积比为0：1-3:1，细胞接种密度为1×10⁴-1×10¹⁰cells/ml，含bmp4的诱导hpsc分化的培养基成分为：体积浓度96％的dmed/f12、体积浓度1％的双抗、体积浓度1％的谷氨酰胺、体积浓度1％的非必须氨基酸(memneaa)、体积浓度1％的its、100ng/ml的肝素、10ng/ml的bmp4，由此配置的每50ml培养基中添加1gbsa，溶解后即为含bmp4的诱导hpsc分化的培养基。

(3)人早期胎盘发育模型的建立

接步骤以上(2)每天更换培养基，培养基为步骤(2)中诱导hpsc分化的培养基，模型建立时间范围为为4-12天。

本发明提供了一种基于器官芯片的人早期胎盘发育模型的应用，该模型可用于细胞形态的表征包括hpsc细胞向滋养层细胞分化情况、融合型滋养层细胞、侵袭型滋养层细胞等细胞类型的表征，与2d条件下hpsc诱导分化的表征等等。

本发明利用hpsc的自组装性质在三维基质材料中形成了具有近生理的三维空腔结构，这些空腔也显示了滋养细胞的高效分化特点。该方法具有简单易操作、重复性强等特点。该模型的建立可为探索人类胎盘发生和胚胎发生在细胞水平和分子机制研究领域提供平台，在胎盘发育过程中的表观遗传学研究中也具有极大的应用价值。

附图说明

图1是本发明构建的一种基于器官芯片的人早期胎盘发育模型建立方法示意图。

图2是本发明实例1中细胞接种于三维基质中的明场跟踪图，包括d0、d1、d2、d4、d6的明场图，bar：50um。

图3是本发明实例1中hpsc细胞向滋养层细胞分化情况、融合型滋养层细胞、侵袭型滋养层细胞等细胞类型的pcr表征图。

图4是传统2d条件下hpsc诱导分化示意图。

图5是本发明实例2中细胞在2d条件下诱导的明场跟踪图，包括d0、d2、d4的明场图，bar：25um。

图6是本发明实例2中细胞2d和3d条件下诱导的pcr结果图，其中图a为滋养层细胞相关基因(cdx2、oct4、ck7、gata3)的表达情况，图b为融合型滋养层细胞相关基因(cgb)的表达情况，图c为侵袭型滋养层细胞相关基因(hla-g)表达情况。

具体实施方式

下面的实施例将对本发明予以进一步的说明，但并不因此而限制本发明。

实施例1

利用hpsc自组装特性体建立人早期胎盘发育模型

本发明使用了一种三维基质材料，该三维基质材料为市购人工基底膜(matrigel)(货号ref：354277，公司corning)。

本发明一种基于器官芯片的人早期胎盘发育模型建立方法，采用以上三维基质材料，具体包括如下过程：

(1)孔板修饰与人多能干细胞(hpsc)接种培养

6孔板先用人工基底膜(matrigel)修饰并放于4°冰箱，之后放入37°培养箱20min，用细胞消化液室温消化，用细胞刮板刮下细胞团，离心600r2min，细胞用含y27632的mtesr1培养基重悬使细胞为小团块后接种于已修饰好的6孔板，37°培养1h后将培养液更换为不含y27632的mtesr1培养基培养。

所述修饰6孔板所用人工基底膜稀释倍数范围为1：1000，每孔1.5ml稀释液放于4°冰箱的时间为7天，培养基中含y27632的浓度为10mm。

(2)细胞消化并接种于三维基质中

待hpsc细胞生长为90％后用消化液室温消化，用细胞刮板刮下细胞团，离心600r2min，将上清液体吸走，用培养基将matrigel稀释到一定比例后将细胞重悬得到合适的接种密度并接种，37°培养箱放置20min使悬有细胞的matrigel固化，之后更换为含bmp4的诱导hpsc分化的培养基。

所述matrigel稀释具体为培养基：matrigel的体积比为0：1，细胞接种密度为1×10⁶cells/ml，含bmp4的诱导hpsc分化的培养基成分体积浓度96％的dmed/f12、体积浓度1％的双抗、体积浓度1％的谷氨酰胺、体积浓度1％的非必须氨基酸(memneaa)、体积浓度1％的its、100ng/ml的肝素、10ng/ml的bmp4，由此配置的每50ml培养基中添加1gbsa，溶解后即为含bmp4的诱导hpsc分化的培养基，按以上步骤建立的胎盘发生模型方法示意图如图1所示。

(3)人早期胎盘发育模型的建立

接步骤以上(2)每天更换培养基，培养基为步骤(2)中含bmp4的诱导hpsc分化的培养基，模型建立时间为6天，三维基质中细胞明场跟踪图如图2所示，对三维基质中hpsc细胞向滋养层细胞分化情况、融合型滋养层细胞、侵袭型滋养层细胞等细胞类型的pcr结果表征如图3所示。

实施例2

一种基于器官芯片的人早期胎盘发育模型中2d与3d基质对细胞形态及功能差异表征

采用与实例1相同的人工基底膜以及细胞接种密度建立人胎盘发育模型。在此，对比了2d条件下hpsc诱导分化的情况与案例1中3d条件下的差异，充分说明本发明在三维基质中构建的模型具有近生理的三维结构，且与传统的二维单层相比，这些空腔也显示了滋养细胞的高效分化。

2d条件下诱导hpsc分化的过程如下：

(1)孔板修饰与人多能干细胞(hpsc)接种培养

6孔板先用人工基底膜(matrigel)修饰并放于4°冰箱，之后放入37°培养箱50min，用细胞消化液室温消化，用细胞刮板刮下细胞团，离心600r3min，细胞用含y27632的mtesr1培养基重悬使细胞为小团块后接种于已修饰好的6孔板，37°培养4h后将培养液更换为不含y27632的mtesr1培养基培养。

所述修饰6孔板所用人工基底膜稀释倍数范围为1：500，每孔1.5ml稀释液放于4°冰箱的时间为4小时，培养基中含y27632的浓度为10mm。

(2)2d条件下诱导hpsc分化

hpsc细胞生长为90％左右后换用不含bmp4的诱导培养基处理2天，每天换液。

所述不含bmp4的诱导hpsc分化的培养基成分为：体积浓度96％的dmed/f12、体积浓度1％的双抗、体积浓度1％的谷氨酰胺、体积浓度1％的非必须氨基酸(memneaa)、体积浓度1％的its、100ng/ml的肝素、10ng/ml的bmp4，由此配置的每50ml培养基中添加1gbsa，溶解后即为含bmp4的诱导hpsc分化的培养基，之后换成含bmp4的诱导培养基处理6天，按以上步骤建立传统的2d条件下hpsc诱导分化示意图如图4所示，传统的2d条件下诱导hpsc分化的明场跟踪图如图5所示。

本发明建立的一种基于器官芯片的人早期胎盘发育模型建立方法中2d与3d基质对细胞形态及功能差异表征，其特征在于：包括hpsc细胞向滋养层细胞分化情况、融合型滋养层细胞、侵袭型滋养层细胞等细胞类型的表征，与2d条件下hpsc诱导分化的表征有明显差异，pcr结果如图6所示，说明与传统的二维单层相比，在三维基质中hpsc显示了滋养细胞的高效分化。该模型可以为探索人类胎盘发生和胚胎发生的细胞和分子机制提供平台。

实施例3

利用hpsc自组装特性体建立外模拟人早期胎盘发育模型

本发明使用了一种三维基质材料，该三维基质材料为市购人工基底膜(matrigel)(货号ref：354277，公司corning)。

本发明一种体外模拟人早期胎盘发育模型的建立方法，采用以上三维基质材料，具体包括如下过程：

(1)孔板修饰与人多能干细胞(hpsc)接种培养

6孔板先用人工基底膜(matrigel)修饰并放于4°冰箱，之后放入37°培养箱40min，用细胞消化液室温消化，用细胞刮板刮下细胞团，离心600r1min，细胞用含y27632的mtesr1培养基重悬使细胞为小团块后接种于已修饰好的6孔板，37°培养3h后将培养液更换为不含y27632的mtesr1培养基培养。

所述修饰6孔板所用人工基底膜稀释倍数范围为1：800，每孔1.5ml稀释液放于4°冰箱的时间为3天，培养基中含y27632的浓度为5mm。

(2)细胞消化并接种于三维基质中

待hpsc细胞生长为70％后用消化液室温消化，用细胞刮板刮下细胞团，离心600r1min，将上清液体吸走，用培养基将matrigel稀释到一定比例后将细胞重悬得到合适的接种密度并接种，37°培养箱放置20min使悬有细胞的matrigel固化，之后更换为含bmp4的诱导hpsc分化的培养基。

所述matrigel稀释具体为培养基：matrigel的体积比为3：1，细胞接种密度为1×10⁸cells/ml，含bmp4的诱导hpsc分化的培养基成分为：体积浓度96％的dmed/f12、体积浓度1％的双抗、体积浓度1％的谷氨酰胺、体积浓度1％的非必须氨基酸(memneaa)、体积浓度1％的its、100ng/ml的肝素、10ng/ml的bmp4，由此配置的每50ml培养基中添加1gbsa，溶解后即为含bmp4的诱导hpsc分化的培养基，按以上步骤建立的胎盘发生模型方法示意图如图1所示。

(3)人早期胎盘发育模型的建立

接步骤以上(2)每天更换培养基，培养基为步骤(2)中含bmp4的诱导hpsc分化的培养基，模型建立时间为8天，三维基质中细胞明场跟踪图与图2结果类似，对三维基质中hpsc细胞向滋养层细胞分化情况、融合型滋养层细胞、侵袭型滋养层细胞等细胞类型的pcr结果表征与图3类同，在这里不做过多描述。