用于鉴别H9和H6亚型低致病性禽流感病毒的冻干微芯片、试剂盒及方法与流程

本发明涉及病毒的分子生物学检测技术领域，特别是涉及一种用于鉴别h9和h6亚型低致病性禽流感病毒的冻干微芯片、试剂盒及方法。

背景技术：

禽流感病毒感染全称禽类流行性感冒病毒感染，是由甲型流感病毒某些亚型的毒株引起的人的急性呼吸道传染病。基因组为分节段单股负链rna。依据其外膜血凝素(h)/和神经氨酸酶(n)蛋白抗原性的不同，目前可分为17个h亚型(h1～h17)和9个n亚型(n1～n9)。禽流感病毒可分为高致病性禽流感病毒、低致病性禽流感病毒和无致病性禽流感病毒。低致病性禽流感又叫致病性禽流感、非高致病性禽流感和温和型禽流感，它是指某些致病性低的禽流感病毒毒株(如h9n2和h6n1亚型)感染家禽引起的以低死亡率和轻度的呼吸道感染或产蛋率下降等临床症候群，其本身并不一定造成禽群的大规模死亡。由于它们对家禽养殖和贸易的影响没有高致病性禽流感严重，因此没有被列为a类或b类疾病。但它感染后往往造成禽群的免疫力下降，对各产蛋鸡或严重应激的鸡，损伤主要发生在呼吸道、生殖道、肾或胰腺。因此低致病性禽流感对养禽业的危害也是很严重的。尽管h9亚型和h6亚型不像h5n1和h7n2亚型属于高致病性情流感，但是因为流感病毒的抗原转变这一特点。当水禽或者野鸟同时感染2种或2种以上流感病毒是，低致病性禽流感病毒可能为高致病性禽流感提供基因片段，为新一轮禽流感的爆发和流行埋下隐患。所以为了保障禽类和人类的安全，对低致病性禽流感h9亚型和h6亚型病毒的快速检测是十分必要的。

近年来，虽然各国科学家已对禽流感病毒进行了多方面的研究，但至今还未找到有效根除禽流感病毒的方法，其防控有赖于及时准确地检测和疫情的控制。检测是防控的基础不同基因型和致病性的禽流感病毒毒株抗原性差异较大、检测技术和防控疫苗等均有不同，依据检测目的不同分类型检测是该病防控的首要之举。目前对禽流感病毒的检测所采用的方法我国动物流感研究中心(airc)在近几年时间内相继建立了禽流感琼脂扩散(agp)、血凝抑制试验(hi)、神经氨酸酶抑制试验(ni)、间接酶联免疫吸附试验(elisa)等血清学检测技术以及分子检测技术(rt-pcr)。病毒分离操作烦琐，耗时长，漏检率高；elisa方法相对简便，快速，但对于微量或杂质较多的样品，其特异性和灵敏度较低，可能造成漏诊或误诊。pcr作为一种新型的分子生物学技术，自诞生以来，由于其特异性、敏感性高，能在短时间内通过基因扩增得到大量的目的片段，克服了传统的禽流感检测技术包括病毒分离鉴定试验周期长的缺点，为禽流感早期快速检测提供了敏感、快速、实用的检测方法，使之成为目前禽流感病毒检测的重要手段之一。但普通pcr仍存在操作繁琐、检测时间长且易污染等弊端。所以目前市场急需快速、准确、灵敏度高，且便携，能现场操作的检测和鉴别检测h9或h6亚型的低致病性禽流感病毒的试剂产品。可以为我国禽流感尤其是低致病性禽流感的防制提供先进、有效的早期快速检测技术和监测手段的同时，也为禽流感防制争取到极为宝贵的快速反应时间。

技术实现要素：

基于本领域的上述需求，本发明的目的在于提供一种用于鉴别h9和h6亚型低致病性禽流感病毒冻干微芯片及试剂盒，使其能够快速、有效地对禽流感病毒进行检测，准确性、特异性和敏感性高，重复性好。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

用于鉴别h9和h6亚型低致病性禽流感病毒的冻干微芯片，其特征在于，用于鉴别h9和h6亚型低致病性禽流感病毒的荧光pcr反应体系通过冻干被固定在所述微芯片上；

所述荧光pcr反应体系包括：下述引物和探针：

禽流感h9亚型病毒上游引物：5＇-ccacccgccgatgct-3＇，

禽流感h9亚型病毒下游引物：5＇-tgttgccacactcgttgttgt-3＇，

禽流感h9亚型病毒taqman探针：5＇-agatctgtacacgagaacc-3＇；

禽流感h6亚型病毒上游引物：5＇-gccagactactgaaggagtgataaga-3＇，

禽流感h6亚型病毒下游引物：5＇-caatccacagagggctcaca-3＇，

禽流感h6亚型病毒taqman探针：5＇-ccaccaaaacattccag-3＇。

所述荧光pcr反应体系还包括：taq酶、反转录酶、海藻糖、tris-cl、dntp、mg²⁺；

优先地，所述h9和h6亚型低致病性禽流感病毒的taqman探针的5`端标记有荧光报告基团；3`端标记有荧光淬灭基团。

所述荧光pcr反应体系包括：上游引物0.4μm；下游引物0.4μm；taqman探针0.4μm；dna聚合酶0.5u/μl；反转录酶0.5u/μl；dntp0.3mm；mg²⁺3mm；海藻糖5μm；tris-cl5mm，其余为灭菌去离子水，总体积为36μl，每孔体积为1.2μl；

优先地，所述禽流感h9亚型病毒的taqman探针的5`端标记的荧光报告基团为fam荧光报告基团；

所述禽流感h6亚型病毒的taqman探针的5`端标记的荧光报告基团为rox荧光报告基团；

所述h9和h6亚型低致病性禽流感病毒的taqman探针3`端标记的荧光淬灭基团为mgb淬灭基团。

所述微芯片上设置有若干个加样孔；所述荧光pcr反应体系通过冻干被固定在所述加样孔内；

优选地，所述微芯片上的加样孔为30个；所述微芯片的结构与pcr仪的加样板结构相适配。

所述冻干包括如下步骤：将装有所述荧光pcr反应体系的微芯片置于-80℃冷冻1h后再进行设备冻干；

优选地，所述设备冻干包括：预冻阶段，隔板温度下降到-55℃，预冻时保持时间为1h，然后设备进行抽真空，保持冷冻干燥1h；解析干燥阶段，再将隔板温度升至-25℃保持1h，然后将隔板温度升至37℃并保持2h，最后将隔板降至25℃并保持1h。

用于鉴别h9和h6亚型低致病性禽流感病毒的试剂盒，包括权利要求1-5任一所述的冻干微芯片。

所述试剂盒还包括：稀释液，10×稀释液使用无核酸酶水稀释成2×稀释液用于滴入冻干微芯片的加样孔中，再将冻干微芯片置于荧光pcr仪上进行荧光pcr扩增。

所述试剂盒还包括：矿物油，封闭所述冻干微芯片上的加样孔；

阳性对照，具体为h9和h6亚型低致病性禽流感病毒基因组cdna混合物；

阴性对照，具体为无核酸酶水。

用于鉴别h9和h6亚型低致病性禽流感病毒的方法，其特征在于，采用所述的冻干微芯片，和/或，所述的试剂盒对待测样品进行荧光pcr扩增。

在冻干微芯片的加样孔中加入待测样品及稀释液后，将冻干微芯片置于荧光pcr仪上进行所述荧光pcr扩增；

优选地，所述稀释液为10×buffer；

进一步优选地，所述荧光pcr扩增的反应程序为：50℃10min；95℃1min；以95℃5s，60℃15s为1个循环，进行40个循环，每个循环的延伸结束时进行荧光信号检测。

本发明提供一种荧光rt-pcr检测试剂盒，所述试剂盒包括一个冻干微芯片、一瓶矿物油、一管阳性对照、一管阴性对照、一管稀释液及一管无核酸酶水，所述冻干微芯片包含引物、探针、taq酶、反转录酶、海藻糖、tris-cl、dntp、mg²⁺。

所述的h9和h6亚型低致病性禽流感病毒荧光冻干微芯片pcr检测试剂盒，taqman探针的核苷酸序列的3＇端标记mgb荧光淬灭基团。所述冻干微芯片包被具有如下核苷酸序列的引物和taqman探针：

禽流感h9亚型病毒上游引物：5＇-ccacccgccgatgct-3＇，

禽流感h9亚型病毒下游引物：5＇-tgttgccacactcgttgttgt-3＇，

禽流感h9亚型病毒taqman探针：

5＇fam-agatctgtacacgagaacc-mgb-3＇；

禽流感h6亚型病毒上游引物：5＇-gccagactactgaaggagtgataaga-3＇，

禽流感h6亚型病毒下游引物：5＇-caatccacagagggctcaca-3＇，

禽流感h6亚型病毒taqman探针：5＇rox-ccaccaaaacattccag-mgb-3＇。

所述荧光定量pcr的冻干体系终浓度包括：上游引物0.4μm；下游引物0.4μm；taqman探针0.4μm；dna聚合酶0.5u/μl；反转录酶0.5u/μl；dntp0.3mm；mg²⁺3mm；海藻糖5μm；tris-cl5mm；余量为灭菌去离子水；

优选地，所述荧光定量pcr的冻干体系的总体积为36μl，每孔体积为1.2μl；

所述荧光定量pcr的ariaysb冻干微芯片的整个冻干微芯片上样孔为30个，将上述荧光pcr反应体系(包含h9和h6亚型低致病性禽流感病毒2套引物探针)，每个微芯片孔加入1.2μl。

所述荧光定量pcr的冻干微芯片先于-80℃冷冻1h。设备冻干条件为：预冻阶段，隔板温度下降到-55℃，预冻时保持时间为1h，然后设备进行抽真空，保持冷冻干燥1h；解析干燥阶段，再将隔板温度升至-25℃保持1h，然后将隔板温度升至37℃并保持2h，最后将隔板降至25℃并保持1h。

h9和h6亚型低致病性禽流感病毒冻干微芯片荧光rt-pcr检测试剂盒，其特征在于，所述冻干微芯片荧光rt-pcr反应条件为：50℃10min，为第一步循环；95℃1min，为第二步循环；95℃5s，60℃15s，为第三步，40个循环，所述第三步每个循环的延伸结束时进行荧光信号检测。

h9和h6亚型低致病性禽流感病毒冻干微芯片荧光rt-pcr检测试剂盒，包括pcr冻干微芯片，所述pcr冻干微芯片包括具有如下核苷酸序列的引物和taqman探针：禽流感h9亚型病毒上游引物：5＇-ccacccgccgatgct-3＇，禽流感h9亚型病毒下游引物：5＇-tgttgccacactcgttgttgt-3＇，禽流感h9亚型病毒taqman探针：5＇fam-agatctgtacacgagaacc-mgb-3＇；禽流感h6亚型病毒上游引物：5＇-gccagactactgaaggagtgataaga-3＇，禽流感h6亚型病毒下游引物：5＇-caatccacagagggctcaca-3＇，禽流感h6亚型病毒taqman探针：5＇rox-ccaccaaaacattccag-mgb-3＇。

作为进一步地改进，所述taqman探针的核苷酸序列的3＇端标记mgb荧光淬灭基团。

所述禽流感h9亚型病毒检测taqman探针的核苷酸序列的5＇端标记fam荧光报告基团；禽流感h6亚型病毒检测taqman探针的核苷酸序列的5＇端标记rox荧光报告基团。

所述冻干微芯片试剂还包括dna聚合酶、反转录酶、dntp、mg²⁺、海藻糖、tris-cl。

所述荧光定量pcr的冻干ariaysb微芯片的整个冻干微芯片上样孔为30个，将上述荧光pcr反应体系(包含h9和h6亚型低致病性禽流感病毒2套引物探针)用稀释液稀释，每个微芯片孔加入1.2μl。

所述冻干条件为荧光定量pcr的冻干微芯片先于-80℃冷冻1h。设备冻干条件为：预冻阶段，隔板温度下降到-55℃，预冻时保持时间为1h，然后设备进行抽真空，保持冷冻干燥1h；解析干燥阶段，再将隔板温度升至-25℃保持1h，然后将隔板温度升至37℃并保持2h，最后将隔板降至25℃并保持1h。

所述常规试剂包括矿物油、稀释液、双蒸水在内的商品化分子试剂；

所述商品化稀释液为10×buffer(不含mg²⁺)，使用无核酸酶水稀释为2×buffer。

所述冻干微芯片荧光定量pcr的1.2μl反应体系包括：荧光定量pcr冻干试剂孔、稀释液0.6μl；检测样品rna0.6μl。

所述试剂盒还包括阳性对照，所述阳性对照为h9和h6亚型低致病性禽流感病毒基因组cdna混合物。

所述h9和h6亚型低致病性禽流感病毒冻干微芯片荧光rt-pcr检测试剂盒，其特征在于，采用所述的引物、和/或、所述的试剂盒对待测样品进行检测。

所述检测指冻干微芯片荧光定量pcr检测；所述上游引物0.4μm；下游引物0.4μm；taqman探针0.4μm；dna聚合酶0.5u/μl；反转录酶0.5u/μl；dntp0.3mm；mg²⁺3mm；海藻糖5μm；tris-cl5mm；余量为灭菌去离子水，总体积为36μl，每孔体积为1.2μl。

所述冻干微芯片荧光rt-pcr的反应条件包括：50℃10min，为第一步循环；95℃1min，为第二步循环；95℃5s，60℃15s，为第三步40个循环，所述第三步每个循环的延伸结束时进行荧光信号检测。

由于采用上述技术方案，本发明至少具有以下优点：

(1)本发明根据国内已发现的h9和h6亚型低致病性禽流感病毒ha基因设计引物，合成特异性引物及taqman-mgb探针，采用荧光定量pcr方法可同时快速灵敏地检测h9和h6亚型低致病性禽流感病毒，且准确性、特异性和敏感性高，重复性好。

(2)本发明一方面采用了高拷贝的靶基因，一方面采用taqman-mgb探针荧光定量pcr检测法，使得利用taqman-mgb探针法荧光定量pcr检测的灵敏度约是普通pcr的100倍。

(3)由于采用定量检测技术-taqman-mgb荧光定量pcr(real-timepcr)，该方法(real-timepcr)具有单管封闭操作防污染、自动化程度高、特异性强、可实时监控等优点，有效地解决了传统方法只能终点检测的局限。

(4)冻干微芯片技术相对于目前使用的荧光pcr检测技术，反应体系更小，仅1.2μl，常规的反应体系为20-25μl，所以微芯片技术可以节省rt-pcr扩增试剂以及样品的用量。

(5)冻干微芯片较小的反应体系可以保证在pcr扩增过程中体系受热更加均匀，升降温速率更快。升温速率(10-12℃/s)相比目前采用的荧光pcr检测系统升降温速率(3-5℃/s)快。荧光pcr整个过程(包括加样)可在40分钟内完成，计算机自动报告结果，无需电泳及其他后续的工作，即方便了操作又减少了污染。

(6)冻干微芯片可进行常温保存和运输，避免试剂反复冻融，检测结果更稳定。

本发明采用的实时荧光定量pcr技术(real-timepcr)，是指在pcr反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个pcr进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。

本发明采用的微芯片是由硅胶或者铝盘形成的带有由保护膜覆盖的微反应器(微反应器的体积和质量取决于微芯片的类型)的反应区域。微芯片的反应区有一层矿物油覆盖。试剂穿过一层矿物油通过手动或者自动的带枪头的移液器注入至微反应器上，可避免检测样本的交叉污染和反应体系蒸发。

本发明将pcr反应试剂冻干在微芯片上，结合taqman探针荧光定量pcr技术，核酸的分析是微芯片在热循环期间同时读取在每个反应器上由pcr产物产生的荧光信号。本发明采用的微芯片技术不同于目前常用的塑料pcr管作为载体盛载pcr反应体系进行pcr扩增，而是采用金属载体微芯片，反应体系及样本直接加到金属载体上进行pcr扩增。金属载体热传导效率和升降温速率更快，可大幅度缩短反应程序时间。具有反应体系小、自动化程度高、反应时间短、特异性强、敏感性高、重复性强、反应试剂不需低温保存、可进行定量检测及微芯片操作污染可能性小等特点。本发明产品可在反应条件一致的情况下快速鉴定并可区分h9和h6亚型低致病性禽流感病毒，操作简单，从样本处理到结果分析可在1个小时内完成。

综上，由于采用了以上技术方案，本发明通过设计特异性引物和探针并优化微芯片冻干条件，发展了能够快速、有效地检测h9和h6亚型低致病性禽流感病毒的微芯片荧光定量pcr的反应体系，同时制备了基于该方法的检测试剂盒。本发明通过大量实验验证，本发明的引物探针/试剂盒/检测方法比常规方法准确性更高、特异性优良，同时最低检出限可达10tcid50/ml，说明敏感性非常高，同时所述检测试剂盒批内变异系数在0.87％～1.22％之间，批间变异系数在0.47％～1.87％之间，说明重复性良好。

附图说明

图1是冻干微芯片荧光rt-pcr检测禽流感h9亚型病毒的特异性检测。图中，1：禽流感h9n2亚型病毒；2：禽流感h6n1亚型病毒；3：禽流感h5n1亚型病毒；4：禽流感h7n9亚型病毒；5：甲型流感h1n1亚型病毒；6：甲型流感h3n2亚型病毒；7：新城疫病毒；8：禽传染性支气管炎；9：传染性法氏囊；10：禽脑脊髓炎病毒；11：禽传染性喉气管炎病毒；12：鸡传染性贫血病毒；13：鸡滑液囊支原体；14：鸡毒支原体单；15：禽腺病毒；16：沙门氏菌核酸；17：无核酸酶水。

图2是冻干微芯片荧光rt-pcr检测禽流感h6n1亚型病毒的特异性检测。图中，1：禽流感h6n1亚型病毒；2：禽流感h9n2亚型病毒；3：禽流感h5n1亚型病毒；4：禽流感h7n9亚型病毒；5：甲型流感h1n1亚型病毒；6：甲型流感h3n2亚型病毒；7：新城疫病毒；8：禽传染性支气管炎；9：传染性法氏囊；10：禽脑脊髓炎病毒；11：禽传染性喉气管炎病毒；12：鸡传染性贫血病毒；13：鸡滑液囊支原体；14：鸡毒支原体单；15：禽腺病毒；16：沙门氏菌核酸；17：无核酸酶水。

图3是冻干微芯片荧光rt-pcr试剂检测禽流感h9n2亚型病毒敏感性结果。图中，a：1×10⁶tcid50/ml；b：1×10⁵tcid50/ml；c：1×10⁴tcid50/ml；d：1×10³tcid50/ml；e：1×10²tcid50/ml；f：1×10¹tcid50/ml；g:1×10⁰tcid50/ml；h:无核酸酶水。

图4是常规荧光rt-pcr试剂检测禽流感h9n2亚型病毒敏感性结果。图中，a：1×10⁶tcid50/ml；b：1×10⁵tcid50/ml；c：1×10⁴tcid50/ml；d：1×10³tcid50/ml；e：1×10²tcid50/ml；f：1×10¹tcid50/ml；g:1×10⁰tcid50/ml；h:无核酸酶水。

图5是冻干微芯片荧光rt-pcr试剂检测禽流感h9n2亚型病毒标准曲线结果。

图6是常规荧光rt-pcr试剂检测禽流感h9n2亚型病毒标准曲线结果。

具体实施方式

为了能够更清楚了解本发明的技术手段，以下结合附图与具体实施方式对本发明作进一步的详细说明。除非特别指明，以下实施例中所用的试剂均为分析纯级试剂，且可从正规渠道商购获得。

生物材料的来源或记载出处

本发明实验例使用的禽流感h9n2亚型灭活毒株由国家动物疫控保存，禽流感h6n1亚型灭活毒株是由北京亿森宝生物科技有限公司保存，可商购获得。

本发明使用的其它病毒株、支原体、菌株也可商购获得。

第1组实施例：本发明的冻干微芯片

本组实施例提供一种用于鉴别h9和h6亚型低致病性禽流感病毒的冻干微芯片，其特征在于，用于鉴别h9和h6亚型低致病性禽流感病毒的荧光pcr反应体系通过冻干被固定在所述微芯片上；

所述荧光pcr反应体系包括：下述引物和探针：

禽流感h9亚型病毒上游引物：5＇-ccacccgccgatgct-3＇，

禽流感h9亚型病毒下游引物：5＇-tgttgccacactcgttgttgt-3＇，

禽流感h9亚型病毒taqman探针：5＇-agatctgtacacgagaacc-3＇；

禽流感h6亚型病毒上游引物：5＇-gccagactactgaaggagtgataaga-3＇，

禽流感h6亚型病毒下游引物：5＇-caatccacagagggctcaca-3＇，

禽流感h6亚型病毒taqman探针：5＇-ccaccaaaacattccag-3＇。

在具体的实施例中，所述荧光pcr反应体系还包括：taq酶、反转录酶、海藻糖、tris-cl、dntp、mg²⁺；

优先地，所述h9和h6亚型低致病性禽流感病毒的taqman探针的5`端标记有荧光报告基团；3`端标记有荧光淬灭基团。

在更具体的实施例中，所述荧光pcr反应体系包括：上游引物0.4μm；下游引物0.4μm；taqman探针0.4μm；dna聚合酶0.5u/μl；反转录酶0.5u/μl；dntp0.3mm；mg²⁺3mm；海藻糖5μm；tris-cl5mm，其余为灭菌去离子水；

上述这些成分的终浓度，既是冻干前荧光pcr反应体系的终浓度，也是冻干后，加样0.6ul并加入0.6μl2×稀释液后的终浓度。

冻干前配制的荧光pcr反应体系的总体积一般为36μl，每孔体积为1.2μl。

优先地，所述禽流感h9亚型病毒的taqman探针的5`端标记的荧光报告基团为fam荧光报告基团；

所述禽流感h6亚型病毒的taqman探针的5`端标记的荧光报告基团为rox荧光报告基团；

所述h9和h6亚型低致病性禽流感病毒的taqman探针3`端标记的荧光淬灭基团为mgb淬灭基团。

在一些实施例中，所述微芯片上设置有若干个加样孔；所述荧光pcr反应体系通过冻干被固定在所述加样孔内；

优选地，所述微芯片上的加样孔为30个；所述微芯片的结构与pcr仪的加样板结构相适配。所述微芯片的结构类似于一块pcr板，但本发明的微芯片是无盖的，需使用矿物油进行加样孔的封闭，在加样时候不容易串孔，不容易污染。因此不会出现pcr体系流动溢出或者串孔污染现象。

在另一些实施例中，所述冻干包括如下步骤：将装有所述荧光pcr反应体系的微芯片置于-80℃冷冻1h后再进行设备冻干；

将装有所述荧光pcr反应体系的微芯片先置于-80℃冷冻1h的目的是预冷冻，使第一步预冻阶段时，体系能保持固体状态，并且这一步还可以缩短干燥时间。

设备冻干指的是在专门的冻干设备中通过设定设备的工作条件来进行冻干；优选地，所述冻干设备指真空冷冻干燥机。

优选地，所述设备冻干包括：预冻阶段，隔板温度下降到-55℃，预冻时保持时间为1h，然后设备进行抽真空，保持冷冻干燥1h；解析干燥阶段，再将隔板温度升至-25℃保持1h，然后将隔板温度升至37℃并保持2h，最后将隔板降至25℃并保持1h。

所述隔板温度指冷冻干燥机内的托盘隔板的温度，需要在所述托盘隔板上放置装有所述荧光pcr反应体系的微芯片；预冻阶段这一步的作用在于使荧光pcr反应体系能保持固体状态。“对设备抽真空，保持冷冻干燥1h”这一步的主要目的是真空冷冻干燥机，需要把内部空气抽干，使固体中的水分升华，从而达到冻干效果。接下来的2步“将隔板温度升至-25℃保持1h”和“将隔板温度升至37℃并保持2h”均为了保持干燥升华过程；最后“将隔板降至25℃并保持1h”的作用是将冻干成品在25℃并保持稳定，至此，基本完成了整个冻干过程。

上述“设备冻干”过程是本发明针对装有所述荧光pcr反应体系的微芯片独创的一套冻干工艺。由于冻干试剂共晶点不同，需要进行分别测定，而且干燥过程中的升温时间、干燥时间中的干燥时间需要进行优化。冻干试剂里面的组分对共晶点的影响都需要调整试剂组分浓度来摸索。特别是反应体系里的酶，在常温长时间放置，酶的活性是会降低的，需要加入保护剂和稳定剂组分，例如海藻糖5μm；tris-cl5mm，而且其浓度对pcr反应是否有抑制需要通过实验验证和调整，才能保证冻干微芯片用来进行荧光pcr检测时获得本发明记载的优良的高灵敏度、高重复性、高准确性、高特异性等优异效果。另外，还需要同时兼顾冻干工艺冻干后使用稀释液的复溶效果，这也需要经过调整冻干工艺的才能使冻干微芯片的达到最终的本发明的检测方法获得的高灵敏度、高重复性、高准确性、高特异性等优异效果。

本领域技术人员可根据本发明的公开，人工合成所述引物，将它们用来定性或定量检测h9和h6亚型低致病性禽流感病毒，能获得如本发明所述的预期效果，因此任何基于商业目的合成的引物，并将其放入标有“检测h9和h6亚型低致病性禽流感病毒”用途的商品包装盒内的行为，或采用上述序列的引物用于商业检测h9和h6亚型低致病性禽流感病毒的行为，均落入本发明请求保护的范围。

第2组实施例：本发明的试剂盒

本组实施例提供一种用于鉴别h9和h6亚型低致病性禽流感病毒的试剂盒，包括第1组实施例任一项所述的冻干微芯片。

所述稀释液具体为pcr10×buffer，具体成分不含mg²⁺，含500mmkcl，100mmtris-hcl，0.1％明胶，该稀释液可商购获得。在使用时，需使用无核酸酶水将该稀释液稀释成2×buffer，在微芯片的每孔内加入0.6μl。

在更进一步的实施例中，所述试剂盒还包括：矿物油，用于对所述微芯片上的加样孔进行封闭，由于体系非常微量，不封油很容易风干，封油相当于盖住pcr管的管盖，使样本不容易污染。

阳性对照，具体为h9和h6亚型低致病性禽流感病毒基因组cdna混合物；

阴性对照，具体为无核酸酶水。

在具体的实施例中，所述探针的核苷酸序列的3＇端标记mgb淬灭基团，5＇端标记fam或rox荧光报告基团。上述“mgb”、“fam”和“rox”基团均为本领域常见的荧光基团，本领域技术人员还可以选用其它本领域常见的荧光淬灭基团和荧光报告基团来替换本文的“mgb”、“fam”和“rox”，例如，常见的荧光淬灭基团还包括：bhq-1、bhq-2、dabcyl2；常见的荧光报告基团还可以选自：tet、hex、5-tamra、texasred-x、cy3(tyetm563)、cy5(tyetm665)、joe。

在进一步的实施例中，所述试剂盒还包括用于进行荧光定量pcr检测的ariaysb微芯片及常规试剂。

所述冻干微芯片试剂还包括dna聚合酶、反转录酶、dntp、mg²⁺、海藻糖、tris-cl。

在优选的实施例中，所述常规试剂包括dna聚合酶、反转录酶、dntp、mg²⁺、海藻糖、tris-cl；和/或，包括所述矿物油、稀释液、双蒸水在内的商品化分子试剂；

在进一步优选的实施例中，所述商品化稀释液为10×buffer(不含mg²⁺)，使用无核酸酶水稀释为2×buffer。本领域商品化的dna聚合酶、反转录酶、dntp、10×buffer还有多种，本领域技术人员可以选用其它品牌和其它类型的分子试剂。

第3组实施例：本发明的检测方法

本组实施例提供一种用于鉴别低致病性h9和h6亚型低致病性禽流感病毒的冻干微芯片荧光rt-pcr检测方法。本组所有实施例都具有如下特征：所述方法包括：采用第1组实施例任一所述的冻干微芯片，和/或，第2组实施例任一所述的试剂盒对待测样品进行荧光pcr扩增。

在一些实施例中，在冻干微芯片的加样孔中加入待测样品及稀释液后，将冻干微芯片置于荧光pcr仪上进行所述荧光pcr扩增；

优选地，所述稀释液2×buffer的加入量为0.6μl，阳性对照、阴性对照或样本的加入量为0.6μl；

进一步优选地，所述荧光pcr扩增的反应程序为：50℃10min；95℃1min；以95℃5s，60℃15s为1个循环，进行40个循环，每个循环的延伸结束时进行荧光信号检测。

在一些实施例中，所述检测指荧光定量pcr检测；所述h9和h6亚型低致病性禽流感病毒的冻干微芯片包括：上游引物0.4μm；下游引物0.4μm；taqman探针0.4μm；dna聚合酶0.5u/μl；反转录酶0.5u/μl；dntp0.3mm；mg²⁺3mm；海藻糖5μm；tris-cl5mm；余量为灭菌去离子水，总体积为36μl，每孔体积为1.2μl。

所述荧光定量pcr的冻干微芯片的整个冻干微芯片上样孔为30个，将上述荧光定量pcr体系(包含h9和h6亚型低致病性禽流感病毒2套引物探针)，每个微芯片孔加入1.2μl。

在一些实施例中，所述冻干条件为荧光定量pcr的冻干微芯片先于-80℃冷冻1h。设备冻干条件为：预冻阶段，隔板温度下降到-55℃，预冻时保持时间为1h，然后设备进行抽真空，保持冷冻干燥1h；解析干燥阶段，再将隔板温度升至-25℃保持1h，然后将隔板温度升至37℃并保持2h，最后将隔板降至25℃并保持1h。

在进一步的实施例中，所述荧光定量pcr的反应程序包括：50℃10min，为第一步循环；95℃1min，为第二步循环；95℃5s，60℃15s，为第三步40个循环，所述第三步每个循环的延伸结束时进行荧光信号检测。

实验例1h9和h6亚型低致病性禽流感病毒冻干微芯片荧光rt-pcr检测试剂盒特异性验证

1、设计引物和taqman-mgb探针

根据国内已发现检测h9和h6亚型低致病性禽流感病毒，找出ha基因序列、低致病性h9和h6亚型低致病性禽流感病毒ha基因的特异性保守序列，并设计多对引物和探针。经过比对筛选，最终各确定一组最佳引物和一条taqman-mgb探针。

禽流感h9亚型病毒上游引物：5＇-ccacccgccgatgct-3＇，

禽流感h9亚型病毒下游引物：5＇-tgttgccacactcgttgttgt-3＇，

禽流感h9亚型病毒taqman探针：

5＇fam-agatctgtacacgagaacc-mgb-3＇；

禽流感h6亚型病毒上游引物：5＇-gccagactactgaaggagtgataaga-3＇，

禽流感h6亚型病毒下游引物：5＇-caatccacagagggctcaca-3＇，

禽流感h6亚型病毒taqman探针：5＇rox-ccaccaaaacattccag-mgb-3＇。

其中禽流感h9亚型病毒taqman探针的核苷酸序列的5＇端标记fam荧光报告基团；禽流感h6亚型病毒taqman探针的核苷酸序列的5＇端标记rox荧光报告基团。3＇端标记mgb淬灭荧光基团。淬灭荧光基团选择mgb的原因在于，taqman-mgb探针与传统的taqman-tamra探针比较具有以下优势：(1)提高tm值--平均15bases可提高18℃，这样可以使探针的长度缩短，尤其对at含量高的序列设计有很大的帮助，并且提高配对与非配对模板间的tm值差异。(2)提高信噪比--由于在探针的3＇端的淬灭基团为不发光的荧光基团，并且与报告基团在空间的位置更接近，实验结果更精确，分辨率更高。

2、病毒rna提取

利用总rna提取试剂盒(北京亿森宝生物科技有限公司，货号ear002)提取禽流感h9n2亚型病毒、禽流感h6n1亚型病毒、禽流感h5n1亚型病毒、禽流感h7n9亚型病毒、甲型流感h1n1亚型病毒、甲型流感h3n2亚型病毒、新城疫病毒、禽传染性支气管炎、传染性法氏囊、禽脑脊髓炎病毒基因组rna。利用总dna提取试剂盒(北京亿森宝生物科技有限公司，货号ead001)提取鸡传染性贫血病毒、禽传染性喉气管炎病毒、鸡滑液囊支原体、鸡毒支原体单、禽腺病毒、沙门氏菌基因组dna。放置于-20℃备用。

3、冻干微芯片制备

按照如下反应体系进行冻干微芯片rt-pcr体系配制：

荧光定量pcr的ariaysb微芯片(北京亿森宝生物科技有限公司)的整个冻干微芯片上样孔为30个，将上述荧光定量pcr体系(包含h9和h6亚型低致病性禽流感病毒2套引物探针)，每个微芯片孔加入1.2μl。

将包被有pcr试剂的微芯片先于-80℃冷冻1h。设备冻干条件为：预冻阶段，隔板温度下降到-55℃，预冻时保持时间为1h，然后设备进行抽真空，保持冷冻干燥1h；解析干燥阶段，再将隔板温度升至-25℃保持1h，然后将隔板温度升至37℃并保持2h，最后将隔板降至25℃并保持1h。

4、冻干微芯片特异性验证

将10×buffer稀释液加入24μl无核酸酶水振荡混匀后，每孔加入0.6μl，在微芯片表面加入600μl矿物油，待其覆盖所有上样孔后。再分别加入0.6μl禽流感h9n2亚型病毒、禽流感h6n1亚型病毒、禽流感h5n1亚型病毒、禽流感h7n9亚型病毒、甲型流感h1n1亚型病毒、甲型流感h3n2亚型病毒、新城疫病毒、禽传染性支气管炎、传染性法氏囊、禽脑脊髓炎病毒、禽传染性喉气管炎病毒、鸡传染性贫血病毒、鸡滑液囊支原体、鸡毒支原体单、禽腺病毒、沙门氏菌核酸提取物，最后一孔加入0.6μl无核酸酶水作为阴性对照。

冻干微芯片荧光rt-pcr反应条件如下：50℃10min，为第一步循环；95℃1min，为第二步循环；95℃5s，60℃15s，为第三步40个循环，所述第三步每个循环的延伸结束时进行荧光信号检测。

该发明探针标记的荧光报告基团为2种，即fam荧光报告基团和rox荧光报告基团，使用荧光pcr软件分析结果时可以分别选择相应的荧光报告基团显示结果，例如fam荧光报告基团探针即禽流感h9亚型病毒的探针，它只显示禽流感h9亚型病毒这一套引物探针的检测结果。rox探针(通道)即禽流感h6亚型病毒的探针，它只显示禽流感h6亚型病毒这一套引物探针的检测结果。2种荧光报告基团的结果是可以分别显示的。

实验结果如图，冻干微芯片包被的是h9和h6亚型低致病性禽流感病毒双重荧光rt-pcr试剂，图1结果显示低致病性禽流感h9亚型病毒通道检测禽流感h9n2亚型病毒rna为阳性扩增，ct值为19.82，有扩增曲线。禽流感h6n1亚型病毒、禽流感h5n1亚型病毒、甲型流感h1n1亚型病毒、禽流感h7n9亚型病毒、甲型流感h3n2亚型病毒、新城疫病毒、禽传染性支气管炎、传染性法氏囊、禽脑脊髓炎病毒、禽传染性喉气管炎病毒、鸡传染性贫血病毒、鸡滑液囊支原体、鸡毒支原体单、禽腺病毒、沙门氏菌以及阴性对照样品无非特异性扩增。图2结果显示，禽流感h6亚型病毒通道检测禽流感h6n1亚型病毒rna为阳性扩增，ct值为22.94，有s形扩增曲线。禽流感h9n2亚型病毒、禽流感h5n1亚型病毒、禽流感h7n9亚型病毒、甲型流感h1n1亚型病毒、甲型流感h3n2亚型病毒、新城疫病毒、禽传染性支气管炎、传染性法氏囊、禽脑脊髓炎病毒、禽传染性喉气管炎病毒、鸡传染性贫血病毒、鸡滑液囊支原体、鸡毒支原体单、禽腺病毒、沙门氏菌以及阴性对照样品无非特异性扩增。所得结果与预期完全吻合。从所有样本的扩增曲线上可以看到，在扩增的前期，特别是在荧光临界值(threshold)附近，曲线重合性较好。

实验例2、h9和h6亚型低致病性禽流感病毒冻干微芯片荧光rt-pcr检测试剂盒与常规荧光rt-pcr试剂敏感性验证和比较

将浓度为1×10⁷tcid50/ml的禽流感h9n2亚型病毒液进行10倍梯度稀释。提取1×10⁶tcid50/ml～1×10⁰tcid50/ml各梯度浓度禽流感h9n2亚型病毒的基因组rna作为模板，无核酸酶水作为阴性对照，进行冻干微芯片荧光rt-pcr试剂和常规荧光rt-pcr试剂检测禽流感h9n2亚型病毒通用敏感性检测。

冻干微芯片荧光rt-pcr体系按实施例1进行制备，将10×buffer稀释液加入24μl无核酸酶水振荡混匀后，每孔加入0.6μl，在微芯片表面加入600μl矿物油，待其覆盖所有上样孔后。在孔中分别加入1×10⁶tcid50/ml～1×10⁰tcid50/ml各梯度浓度h9n2病毒的基因组rna，最后1孔加入0.6μl无核酸酶水作为阴性对照。

冻干微芯片荧光rt-pcr反应条件如下：50℃10min，为第一步循环；95℃1min，为第二步循环；95℃5s，60℃15s，为第三步40个循环，所述第三步每个循环的延伸结束时进行荧光信号检测。

常规荧光rt-pcr试剂体系配制：

常规荧光rt-pcr如下：50℃30min，为第一步循环；95℃5min，为第二步循环；95℃15s，60℃45s，为第三步40个循环，所述第三步每个循环的延伸结束时进行荧光信号检测。

图3结果显示，冻干微芯片荧光rt-pcr，最低检测样本浓度为1×10¹tcid50/ml，ct值为32.88，因此反应循环数40可大大满足最低检测要求。从不同浓度起始模板的扩增曲线可以看出，曲线基线平整，指数区明显，斜率较大，这些均说明在该条件下模板的扩增是较为理想的。图4结果显示，常规荧光rt-pcr最低检测样本浓度1×10²tcid50/ml，ct值为33.33。结果表明，冻干微芯片荧光rt-pcr检测的敏感性比常规荧光rt-pcr检测的敏感性高(约高10倍左右)。由于ct值与起始模板的对数存在线性关系，可利用ct值和模板其实浓度制作标准曲线，列出线性关系方程。图5和图6结果显示，冻干微芯片荧光rt-pcr扩增效率为101.12％，常规荧光rt-pcr扩增效率为83.01％，冻干微芯片荧光rt-pcr扩增效率更高。两者的标准曲线公式及相关系数都较为接近。冻干微芯片荧光rt-pcr的相关系数为0.998，常规荧光rt-pcr相关系数为0.992，所以冻干微芯片荧光rt-pcr的相关性更好一些。冻干微芯片荧光rt-pcr反应体系为1.2μl，常规荧光rt-pcr体系为25μl，冻干微芯片荧光rt-pcr反应体系缩小了20多倍。冻干微芯片荧光rt-pcr反应运行时间不到40分钟，常规荧光rt-pcr反应时间为120分钟，运行时间缩短2/3。

实验例3：h9和h6亚型低致病性禽流感病毒冻干微芯片荧光rt-pcr检测试剂盒的制备及检测

1、试剂盒的制备：

冻干微芯片的制备：

按照如下反应体系进行冻干微芯片rt-pcr体系配制：

荧光定量pcr的ariaysb微芯片(北京亿森宝生物科技有限公司)的整个冻干微芯片上样孔为30个，将上述荧光定量pcr体系(包含h9和h6亚型低致病性禽流感病毒2套引物探针)，每个微芯片孔加入1.2μl。

将包被有pcr试剂的微芯片先于-80℃冷冻1h。设备冻干条件为：预冻阶段，隔板温度下降到-55℃，预冻时保持时间为1h，然后设备进行抽真空，保持冷冻干燥1h；解析干燥阶段，再将隔板温度升至-25℃保持1h，然后将隔板温度升至37℃并保持2h，最后将隔板降至25℃并保持1h。

试剂1：稀释液taqbuffer(10×)(thermoscientific，货号b650060)，6μl

试剂2：矿物油(sangonbiotech，货号a630217)1ml

试剂3：阳性对照(禽流感h6亚型病毒、禽流感h9亚型病毒基因组cdna混合物)30μl；

试剂4：阴性对照(无核酸酶)30μl。

试剂5：无核酸酶水50μl。

2、试剂盒的重复性分析

选取3个已知阳性的样品，分别进行批内重复检测和批间重复检测。批内重复检测：将3个已知阳性样品在同一批实验中进行，每个样品设置3个重复。批间重复实验：将3个已知阳性样品分批次检测，每个样品单独检测，每个样品设置3个重复。

每孔冻干微芯片荧光rt-pcr反应体系为1.2μl：试剂1使用前需吸取24μl试剂5加入试剂1内振荡混匀后，每孔加入0.6μl。在微芯片表面加入600μl试剂2，待其覆盖所有上样孔后。每孔再分别加入阳性样品、试剂3(阳性对照)或试剂4(阴性对照)各0.6μl。

冻干微芯片荧光rt-pcr反应条件如下：50℃10min，为第一步循环；95℃1min，为第二步循环；95℃5s，60℃15s，为第三步40个循环，所述第三步每个循环的延伸结束时进行荧光信号检测，并记录实验结果。

从表1中的检测结果可以看出，批内变异系数在0.87％～1.22％之间，批间变异系数在0.47％～1.87％之间，说明本试剂盒重复性良好。

表1试剂盒重复性分析

由于采用了以上技术方案，本发明通过设计特异性引物和探针并优化微芯片冻干条件，发展了能够快速、有效地检测h9和h6亚型低致病性禽流感病毒的微芯片荧光定量pcr检测的反应体系，同时制备了基于该方法的检测试剂盒，所述检测方法准确性、特异性和敏感性高，所述检测试剂盒重复性好。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，本领域技术人员利用上述揭示的技术内容做出些许简单修改、等同变化或修饰，均落在本发明的保护范围内。

sequencelisting

<110>北京亿森宝生物科技有限公司

中国动物疫病预防控制中心

<120>用于鉴别低致病性禽流感h9和h6亚型病毒的冻干微芯片、试剂盒及方法

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