一种人工合成的Bt抗虫基因JBT-AA及其应用的制作方法

本发明属于抗虫基因工程育种领域，具体涉及一种人工合成的bt抗虫基因jbt-aa及其应用。

背景技术：

玉米是世界上最重要的粮食作物之一，在我国大部分地区广泛种植，是主要的粮食作物与经济作物，其对保持农业结构稳定乃至粮食安全具有重要作用。玉米也是遭受虫害最严重的农作物之一，现有玉米种质缺少抗虫资源，传统抗性育种途径亦很难取得突破。基因工程技术可将杀虫基因转化入玉米，从而获得新的抗虫玉米品种。但是随着转基因抗虫玉米种植规模不断扩大，转基因抗虫玉米仍然存在很多问题。抗虫范围相对较小，而危害玉米的害虫极多，玉米害虫逐渐对抗虫玉米产生抗性。

苏云金芽孢杆菌bt(bacillusthurngiensis)，是一种革兰氏阳性菌，广泛存在于土壤、水域、植物、昆虫尸体中。bt杀虫蛋白是苏云金芽孢杆菌在形成芽孢时所产生的一种蛋白质，对鳞翅目、同翅目、鞘翅目、双翅目等昆虫具有高度特异毒杀活性，被广泛应用于制备生物农药和植物基因工程。cry类基因是bt基因中最早被鉴定、分离并公布序列的一类基因，也是被发掘出最多新基因型，研究最彻底的一类bt基因。cry蛋白家族的三维结构典型特征是含有明显能区分出来的三个domain，即domainⅰ、domainⅱ、domainⅲ。

抗虫基因虽然对人畜无毒，不破坏环境，但目前普遍存在获得的转基因植物抗虫效率低的问题。抗虫基因大多来源于细菌等微生物，其密码子与植物有较大差异，因此，对天然bt基因进行改造，合成新的抗虫基因，使抗虫基因适合在植物受体细胞中表达，从而提高转基因植株的杀虫性是目前急需解决的问题。

技术实现要素：

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种可在转基因玉米中稳定遗传和表达，所得转基因玉米抗虫性好的人工合成的bt抗虫基因jbt-aa。

本发明的第二个目的是提供一种人工合成的bt抗虫基因jbt-aa的应用。

本发明的技术方案概述如下：

一种人工合成的bt抗虫基因jbt-aa，所述bt抗虫基因jbt-aa的核苷酸序列用seqidno1所示。

上述人工合成的bt抗虫基因jbt-aa在制备抗虫植物中的应用。

本发明的优点：

人工合成的bt抗虫基因jbt-aa较其密码子优化前更容易获得稳定表达的转基因植株，所得转基因玉米抗虫性好。本发明获得高效适合用于玉米遗传转化的bt抗虫基因jbt-aa，创制出抗虫效果好的转基因玉米，为抗虫玉米新品种培育提供新种质资源。

附图说明

图1为jbt-aa基因设计过程。

图2为jbt-aa基因的植物表达载体。

图3为转jbt-aa基因的玉米rt-pcr检测结果。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。

下述实施例中所用方法如果没有特别的说明，均为常规方法，所用术语和缩写均是本领域技术人员通用的术语和缩写。

天塔五号玉米种子购自天津科润津丰种业有限责任公司。本申请以玉米种为例，实验证明，其它植物也可以用于本发明。

c58农杆菌感受态购自武汉淼灵生物科技有限公司。

含有基因bar的质粒pcambia3301购自武汉淼灵生物科技有限公司。

实施例1jbt-aa基因的设计改造

根据苏云金芽孢杆菌cry1ac蛋白和cry4aa蛋白不同区域的活性分析及玉米基因组特点，我们对两种蛋白对应的密码子及编码框进行了优化改造，分别命名为cry1ac-j和cry4aa-j。接着将cry1ac-j的domainⅰ和domainⅱ与cry4aa-j的domainⅲ进行融合(见图1)，获得一条新的基因，命名为jbt-aa。基因jbt-aa中g的含量为22.86％；c的含量为24.35％；t的含量为26.77％，a的含量为26.02％。bt抗虫基因jbt-aa(简称jbt-aa基因)的核苷酸序列如seqidno：1所示。

实施例2jbt-aa基因的植物表达载体构建

按照实施例1的方案我们合成了jbt-aa基因，同时在基因的5’端添加了bamhi的酶切位点，3’端添加了sali的酶切位点。用bamhi、sali对jbt-aa基因进行酶切，并回收jbt-aa基因片段，然后与bamhi、sali酶切过得的已有植物表达载体pcambia3301进行连接，得到含有jbt-aa基因的植物表达载体pcambia3301-jbt-aa(见图2)。

实施例3jbt-aa基因转化农杆菌。

实验中所用的农杆菌为c58菌株，重组质粒载体pcambia3301-jbt-aa上构建有筛选基因bar。将保存的c58农杆菌感受态从-80℃冰箱拿出100μl，放在冰上，取出3μlpcambia3301-jbt-aa质粒与c58农杆菌100μl混匀，冰浴15min，放入冰上预冷的电击杯中，1500v，电击转化。将菌液吸入1.5ml离心管中，加入400μlyep液体培养基，于28℃振荡培养3h，6000r/min，28℃，离心收集菌体，弃300μl上清，重悬菌体，涂板于28℃暗培养2天，筛选出转化成功的转化用农杆菌单菌落。

实施例4农杆菌侵染液的制备

从平板上挑取转化用农杆菌单菌落接种于yep液体培养基中(含100mg/l卡那霉素)，28℃、180r/min振荡培养过夜，当农杆菌生长至对数生长期时(od600为0.6，20℃，5000r/min离心7min收集菌体，用等体积侵染培养基重悬菌体，得到农杆菌侵染液。

yep培养基：10g/l蛋白胨+10g/l酵母提取物+5g/lnacl，ph为7.0。

侵染培养基：1/2ms+65g/l蔗糖+36.5g/l葡萄糖+150μmol/l乙酰丁香酮，ph为5.3。

实施例5转抗虫基因jbt-aa玉米的获得。

1玉米芽尖的转化。选取整齐饱满的天塔五号玉米种子，70％酒精浸泡1min，0.1％升汞消毒12min，无菌水清洗3次后接入发芽培养基，26℃，黑暗条件下培养。待苗长至4-6cm时，在无菌条件下切除幼叶和胚芽鞘以露出芽尖生长点，并用灭过菌的手术刀轻轻划伤用于侵染。将玉米芽尖浸泡在农杆菌侵染液中(含有150μmol/l乙酰丁香酮)，并置于真空干燥器中，在50kpa压力下侵染20分钟，侵染完后弃去菌液，用无菌滤纸吸去玉米芽尖表面多余的菌液，继续放入发芽培养基中培养3天，得到玉米小苗。

发芽培养基：1/2ms+30g/l蔗糖+7.5g/l琼脂，ph为5.7。

2转化苗的移栽和筛选。洗去玉米小苗根部的培养基，移入装有珍珠岩、蛭石、营养土的体积比为1:2:2的花盆中，放于温室培养。待小苗长到5-7cm时将250mg/l的草胺膦水溶液，10ml/株，喷洒在叶片上进行抗性苗的筛选。

3抗性植株的rt-pcr分子检测。用非转基因对照植株叶片和转基因植株叶片(本实施例步骤2获得的叶片)提取总rna，反转录合成的cdna作为模板，用jbt-aa特异性引物进行扩增，扩增出的片段大小为1737bp(seqidno：1)。扩增反应程序为:94℃3min；(94℃30s，58℃30s，72℃30s，32个循环)；72℃延伸7min。引物为上游:atgattgatatctctttatc(seqno.2)；下游:gaccgggatgaactcaattt(seqno.3)。产物经0.9％琼脂糖凝胶电泳检测。如图3所示，泳道1为marker，泳道2-8为转基因植株，泳道9为非转基因对照，泳道10为质粒pcambia3301-jbt-aa阳性对照。rt-pcr检测结果表明，jbt-aa基因已经成功整合入玉米植物基因组中，表明成功获得了转jbt-aa基因玉米植株。

实施例6转jbt-aa基因玉米植株抗虫性鉴定

将获得的转基因苗种植于温室，并且全生育期不施农药，花后16天观察植株抗虫性，以非转基因的植株作为阴性对照。田间观察时，只要植株上出现叶片有横排小虫孔、苞叶、花丝被蛀食、茎秆、穗柄、穗轴被蛀食等，均认为不抗虫。植株无明显虫害，植株健壮，认为抗虫。统计结果见下表。

注：“+”代表检测为阳性；“-”代表检测为阴性；“有”代表植株上能看到虫的危害症状，如叶片有横排小虫孔、苞叶、花丝被蛀食、茎秆、穗柄、穗轴被蛀食；“无”代表植株没有玉米螟的危害症状。

上述结果表明：25株转jbt-aa基因玉米植株中抗虫植株为20株，抗虫率为80％，与非转基因玉米植株相比，转jbt-aa基因玉米植株表现为抗虫，且抗虫效果好。

序列表

<110>天津大学

<120>一种人工合成的bt抗虫基因jbt-aa及其应用

<160>3

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1737

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

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<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

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