本发明属于核酸检测领域，特别是一种快速检测目的基因的方法。
背景技术：
：：λ干扰素(interferon-λ，ifn-λ)是2003年由sheppard等发现的一种新的iii型干扰素，其家族成员包括ifn-λ1、ifn-λ2、ifn-λ3和ifn-λ4。在细胞中，由于不同ifn-λ基因结构和转录调节因子的差异，ifn-λ1比其他三种ifn-λ的表达要早，因此，ifn-λ1在早期抑制病毒增殖过程中起了重要作用。目前的研究发现，ifn-λ1在抗病毒方面有良好的疗效，如ilyushina,nataliaa等发现在连续传代的人肺上皮细胞系(calu-3)中，增加ifn-λ1的表达量会强烈抑制甲型h1n1流感病毒的增殖；中国农业科学院哈尔滨兽医研究所发现猪源iii型干扰素ifn-λ1对猪流行性腹泻病毒有较强的抑制作用，因为其作用于肠粘膜上皮细胞，抗病毒作用比之前的ⅰ型干扰素更具靶向优势，为进一步开发新的抗病毒药物提供了新思路。从江香猪是贵州省地方小型猪种，因其基因高度纯合，并且和人类的基因组高度相似，因此在医学领域有较高的研究价值。技术实现要素：本发明的目的是：提供一种从江香猪ifn-λ1基因扩增方法，旨在为后续研究ifn-λ1的抗病毒活性以及抗病毒类药物研发奠定工作基础。本发明是这样实现的：从江香猪ifn-λ1基因扩增方法，包括以下步骤：(1)确定待测的目标，进行序列的下载比对，设计特异性引物，并在上游下游引物的5’端加入酶切位点；(2)将设计的分子标记引物加入到pcr扩增体系中，混合pcr反应体系，置于pcr仪上，经过一定的循环后，得到扩增反应产物；(3)将pcr反应产物通过琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像仪观察结果；所述的引物为：poifn-f：5'-ccaagcttatggctacagcttggatcgtggtgc-3'，下游引物poifn-r：5'-ccctcgagtcagatgtgcaagtctccactggtaacac-3'，下划线处为xhoi、hindiii酶切位点。所述的pcr扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，56℃退火40s，72℃延伸1min，30个循环；最后72℃延伸10min，4℃保存。所述的琼脂糖凝胶电泳检测是应用体积百分比为1.2％的琼脂糖凝胶电泳进行检测；1.2％琼脂糖凝胶配制：称量1.2g琼脂糖，加100ml1×tbe缓冲液，加热溶解于250ml锥形瓶中，加入10μlgoldviewⅰ型核酸染色剂摇匀，冷却待用。将得到从江香猪ifn-λ1基因进行克隆、测序以及相关遗传进化分析。还包括对基因的蛋白结构预测、同源性分析。由于采用了以上技术方案，本发明采用淋巴细胞分离法分离淋巴细胞，并提取细胞总rna，通过rt-pcr扩增出目的基因，克隆、测序完成以后对ifn-λ1基因进行相关遗传进化分析，以探寻ifn-λ1基因与其他哺乳动物之间的相关性，为进一步研究ifn-λ1基因的抗病毒活性提供依据。本研究首次成功克隆了从江香猪ifn-λ1基因，序列比对分析发现从江香猪与野猪ifn-λ1基因的相似性最高(为100.0％)，而与拉布拉多白足鼠的相似性最低(72.7％)，这与ifn-λ1基因系统进化树结果相一致，表明亲缘关系越近，其相似性越高。ifn-λ1氨基酸序列分析表明所选的物种完全相同的氨基酸位点为p74，而其他位点有不同程度变异，可能是由于物种差异造成的，这些变异是否对ifn-λ1蛋白功能产生影响有待研究。在从江香猪ifn-λ1二级结构预测中，肽链中的α螺旋和无规则卷曲占了90.05％，构成了该蛋白质二级结构的主要原件，推测这两种空间构象是从江香猪ifn-λ1肽链中构成配体-受体结合的活性部位；而从江香猪ifn-λ1蛋白质三级结构中包含6个α螺旋，与人的ifn-λ1蛋白质三级结构α螺旋数一致。附图说明图1为从江香猪淋巴细胞分离结果；图2为总rna片段扩增结果；图3为ifn-λ1基因rt-pcr扩增结果；图4为从江香猪ifn-λ1蛋白三级结构预测图；图5为从江香猪ifn-λ1基因同源性分析；图6为从江香猪ifn-λ1遗传进化分析。具体实施方式本发明的实施例：从江香猪ifn-λ1基因扩增方法1、淋巴细胞分离取edta抗凝管采集从江香猪前腔静脉血液10ml，按照淋巴细胞分离液操作说明进行分离，具体步骤如下：(1)取2支10ml离心管(灭菌)，取edta新鲜抗凝血3ml与pbs液(灭菌)按1:1加入离心管，轻轻吹吸，使其充分混匀。另取干净无菌的4支10ml离心管，先加入3ml分离液，再吸取上述混合液3ml沿管壁小心加于分离液之上，设置离心机温度为22℃，以1500r/min离心15min。(2)离心结束后，可看到细胞在离心管中分为四层(第二层为淋巴细胞层或单核细胞层，呈乳白色环状)，用1ml/2.5ml注射器小心吸取第二层转入新的离心管。(3)向步骤(2)中收集的淋巴细胞层的离心管中加入无菌pbs液5ml，反复吹打使其充分混匀后，以1500r/min离心10min，温度为22℃，离心后弃去上清液。(4)以同样方法取3ml无菌pbs液重复洗涤2次，以1500r/min离心10min，温度22℃，弃去上清。(5)弃尽上清后将离心管移到细胞培养室操作，无菌条件下加入6ml含有10％胎牛血清的rpmi-1640培养基和终浓度为100μg/ml青链霉素、20μg/mlcona悬浮细胞，置于37℃含5％co2培养箱中培养48h，收集淋巴细胞培养物。2、引物设计与合成根据genbank中登录的猪ifn-λ1基因序列(fj455508)，利用primerpremier5.0软件设计从江香猪ifn-λ1基因cds区的特异性引物，上游引物poifn-f：5'-ccaagcttatggctacagcttggatcgtggtgc-3'，下游引物poifn-r:5'-ccctcgagtcagatgtgcaagtctccactggtaacac-3'，下划线处为xhoi、hindiii，退火温度为56℃，预期扩增片段大小为576bp。引物由昆明硕擎生物技术有限公司合成。3、猪淋巴细胞总rna的提取(1)取培养48h的淋巴细胞培养瓶，倒出培养液，用无菌1×pbs缓冲液清洗。(2)向瓶中加入3ml的rnaisoplus裂解液，均匀的晃动培养瓶，以确保裂解液能在瓶底的细胞表面均匀分布。(3)将瓶内裂解液移至1.5ml离心管中，用移液枪反复吹打至裂解液中沉淀不明显为止。(4)在室温下(15～30℃)静置5min。(5)向上述步骤2.3.1中含匀浆裂解液的离心管中加入氯仿200μl，盖紧离心管盖，充分混合均匀，使其管内溶液呈明显的乳白色。并在室温下静置5min。(6)启用冷冻离心机中，设置条件在12000×g、4℃下离心15min，小心取出离心管，可见此时的匀浆分为三层，其中无色上清层为实验所需的rna层。(7)用移液枪吸取无色上清层转移至另一新的无菌干净1.5ml离心管中。(8)向离心管中加入1ml异丙醇，上下颠倒1.5ml离心管进行充分混匀后，室温静置10min。(9)设置条件在12000×g、4℃下离心10min，此时可见管底部出现rna沉淀。(10)弃掉管中上清，勿触及沉淀，加入75％的乙醇1ml，轻轻上下颠倒以洗涤离心管壁，在7500×g、4℃条件下离心5min，小心弃掉上清，勿触及沉淀。(11)在室温下静置5min干燥管内沉淀，向管内加入1ml的rnasefree水溶解沉淀。4、猪ifn-λ1基因的rt-pcr扩增4.1cdna链合成取提取的淋巴细胞总rna为模板，采用hifiscriptcdnasynthesis试剂盒两步法rt-pcr合成cdna第一条链，具体操作如下：(1)将rna模板、primermix、dntpmix、dtt、rtbuffer、hifisript和rna-freewater溶解置于冰上，建立20μl反应体系(见表1)。表1反转录第一步反应体系table1reversetranscriptionreactionsystem(2)预先调至70℃的恒温水浴锅，将其孵育10min后迅速冰浴2min，瞬时离心，再继续向上述反应中加入以下试剂，建立20μl反应体系(见表2)。表2反转录第二步反应体系table2reversetranscriptionreactionsystem将上述反应管置于50℃恒温水浴中孵育30min，80℃孵育5min，反应结束后短暂离心，置于冰上冷却后，合成cdna第一链，可直接使用或-80℃保存备用。4.2猪ifn-λ1基因的pcr扩增以合成的cdna为模板，设置pcr扩增的反应体系和反应参数(见表3)，pcr扩增产物吸取10μl用1.2％琼脂糖凝胶电泳进行检测。表3猪ifn-λ1基因pcr扩增的反应体系和反应参数table3pcramplificationofpigifn-λ1geneanditsreactionparameters4.3琼脂糖凝胶电泳(1)1.2％琼脂糖凝胶配制：称量1.2g琼脂糖，加100ml1×tbe缓冲液，加热溶解于250ml锥形瓶中，加入10μlgoldviewⅰ型核酸染色剂摇匀，冷却待用。(2)将琼脂糖凝胶倒入胶槽，冷却凝固后将pcr扩增产物点入加样空，倒上1×tbe缓冲液，以110v，80ma的条件电泳40min，在凝胶成像系统观察结果。5、目的基因dna纯化(1)在紫外灯下把含有目的dna片段的琼脂糖凝胶切下，吸干凝胶表面的液体，装入1.5ml离心管中，并称量其重量，按100mg＝100μl的重量作为一个凝胶体积。(2)在上述离心管中加3倍凝胶体积的buffered-a，充分混合均匀后，置于75℃恒温水浴锅中进行加热，在每隔2min拿出上下混合一次，使胶块完全熔化。(3)再向离心管中加0.5个bufferde-a体积的bufferde-b，混合均匀。(4)吸取步骤(3)中的液体转移到胶回收试剂盒内提供的dna制备管(置于2ml离心管)中，在离心机中12000×g离心1min。弃去滤液。(5)将制备管重新置回离心管，加入500μlbufferw1，于离心机中12000×g离心30s，弃去滤液。(6)将制备管再置回离心管中，加入700μlbufferw2，于离心机中12000×g离心30s，弃去滤液。以同法再加700mlbufferw2洗涤，12000×g离心1min。(7)再将制备管置回离心管中，空管以12000×g离心1min。(8)将制备管置于新的1.5ml灭菌离心管中，在制备膜的中央加25μl加热至65℃的去离子水，室温静置1min。12000×g离心1min洗脱dna。重复将1.5ml离心管中的去离子水吸取加入制备膜中，室温静置1min。12000×g离心1min洗脱收集dna。6、猪ifn-λ1基因的克隆6.1感受态细胞dh5α的制备(cacl2法)(1)菌种活化：从-80℃冰箱中取一管母液dh5α置于冰上溶解，无菌条件下，用接种针划线接种于lb琼脂平板上，于37℃恒温培养12h，活化菌种。(2)菌种前培养：从lb琼脂平板上挑取单一菌落，接种于5ml不含amp的lb液体培养基中，37℃振荡培养过夜(12h)至细菌对数生长期。(3)菌种的准备：吸取500μl过夜的菌悬液加入到50ml不含amp的lb液体培养基中，37℃振荡培养3h，测od600的值为0.5左右为宜。(4)感受态细胞的制备：将测得od600值的菌悬液分装于10ml离心管，冰浴30min，期间间断轻轻摇动。待冷却后，以3000r/min，4℃条件下离心10min，弃去上清。(5)向管内加入提前预冷的ddh2o，用移液枪轻轻吹吸混匀沉淀。在水上静置10min后，以3000r/min，4℃离心10min，弃去上清。(6)向管内加入提前预冷的0.1mol/lcacl24ml，轻轻吹吸重悬沉淀，在冰浴10min后在冷冻离心机上以3000r/min，4℃离心10min，弃去上清。(7)每10ml离心管中加入1ml含15％甘油cacl2(0.1mol/l)，重悬沉淀，在冰上以每管200μl分装于1.5ml离心管中，先放置于-20℃冷冻，再转入-70℃长期保存。6.2目的基因的连接将目的基因的纯化产物与pmd-19t载体进行连接，建立连接体系为10μl(见表4)，充分混合均匀，立即瞬时离心，在16℃恒温仪中连接12h。表4连接反应体系table4connectionreactionsystem6.3目的基因的转化取出e.coildh5α感受态细于冰浴中溶解，吸取50μl加入10μl连接产物中轻轻混匀，冰浴30min后在42℃的恒温水浴中热激90s，再迅速放回冰浴5min，并加入800μl不含amp的液体lb培养基。置于37℃恒温条件下200r/min振荡培养2h，以利于细菌抗性蛋白的表达。取出振荡培养后的菌液，以6000r/min离心8min，用移液枪吸取500μl上清弃掉，将菌液吹打混匀后吸取100μl涂布于含amp(100μg/ml)的lb固体平板上，在37℃的恒温培养箱中培养12h，取出观察有无阳性菌落。6.4质粒dna的提取无菌条件下，挑取单个的白色菌落接种于含有amp的lb液体培养基中，37℃振荡培养12h后，按照axy质粒dna提取试剂盒的操作说明进行质粒提取。具体步骤如下：(1)取2ml在lb液体培养基中培养12h的菌液，于离心机12000×g离心1min，弃掉上清。(2)加入250μlbuffers1，均匀悬浮细菌沉淀(确认buffers1中已加rnasea)。(3)再加入250μlbuffers2，上下翻转6次，此过程要温和并充分，混合菌液使菌体充分裂解，直至形溶液透亮(此步骤不宜超过5min，避免剧烈摇晃导致dna污染)。(4)向菌液加入350μlbuffers3，温和地上下翻转菌液8次，12000×g离心10min。(5)转移上清液至制备管(置于2ml离心管)中，12000×g离心1min，弃掉滤液。(6)将制备管置回离心管中，加入500μlbufferw1，12000×g离心1min，弃掉滤液。(7)将制备管置回离心管中，加入700μlbufferw2，12000×g离心1min，弃掉滤液；以同样的方法用700μlbufferw2再洗涤一次，弃掉滤液。(8)将制备管置回2ml离心管中，12000×g离心1min。(9)将制备管置于新的1.5ml离心管中，在制备膜的中央加70μl加热至65℃的去离子水，室温静置1min，12000×g离心1min。重新将1.5ml离心管中的液体吸取加入制备膜中央，室温静置1min，12000×g离心1min。6.5重组质粒双酶切鉴定将提取的质粒溶液进行pcr和双酶切鉴定，pcr扩增的反应体系和反应参数可参照2.4.2步骤进行，同时根据pmd-18t载体上的酶切位点，筛选xhoⅰ、hindiii对质粒进行双酶切鉴定，建立酶切反应体系20μl(见表6)，将酶切体系混合均匀后瞬时离心，置于37℃恒温水浴中孵育3h，之后将pcr产物和酶切产物用1.2％琼脂糖凝胶电泳检测。并挑选5个阳性克隆质粒送上海invitrogen公司测序。表5bamhⅰ和hindiii双酶切反应体系table5bamhiandhindiiidoubleenzymereactionsystems7、从江香猪ifn-λ1的遗传进化分析利用生物信息学软件protparam对从江香猪ifn-λ1基因编码的蛋白质进行理化性质分析；利用sopma软件对蛋白质二级结构进行预测分析；用swissmodel对蛋白质三级结构进行分析；从genbank下载已知各物种的ifn-λ1基因，用megalign软件进行核苷酸同源性分析；用bioedit7.0对氨基酸序列进行比对；经序列比对后用mega5.0软件对ifn-λ1基因构建分子系统进化树。序列表<110>贵州大学<120>从江香猪ifn-λ1基因的检测方法<160>2<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>33<212>dna<213>猪(bostaurus)<400>1ccaagcttatggctacagcttggatcgtggtgc33<210>2<211>37<212>dna<213>猪(bostaurus)<400>2ccctcgagtcagatgtgcaagtctccactggtaacac37当前第1页1 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