用于检测PRRSV-N基因的特异性引物和探针及其试剂盒与使用方法与流程

本发明涉及分子生物学和体外诊断试剂技术领域，尤其是用于检测prrsv-n基因的特异性引物和探针及其试剂盒与使用方法。

背景技术：

猪繁殖与呼吸综合征(porcinereproductiveandrespiratorysyndrome，prrs)也称猪蓝耳病，其病原为猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus，prrsv)。prrsv具有高度传染性，既可水平传播，也可通过胎盘垂直传播感染胎儿，仔猪及成年猪感染prrsv后，临床症状主要表现为呼吸困难、肺炎、生长速度减慢。由于prrsv本身的高致病性及因其感染造成的免疫抑制极可能出现其他病毒或细菌的继发性感染，因此死亡率很高，给世界养猪业带来极大的威胁。prrsv有两个基因型，即lv株为代表的欧洲型和vr-2332株为代表的美洲型。prrsv是单股正链rna病毒，其基因组包含至少9个开放阅读框(openreadingframe，orf)，其中orf1a和orf1b约占整个基因组全长的2/3，编码14个非结构蛋白，其余基因编码8个病毒结构蛋白。核衣壳蛋白n是prrsv的结构蛋白之一，由orf7基因编码，为碱性蛋白，具有良好的抗原性，既执行结构蛋白的功能，又执行非结构蛋白的功能，是功能最为复杂的蛋白。由于prrsv的高度变异性及其抗体依赖性增强作用，给其预防带来了极大的挑战。pcr技术作为一种分子生物学工具，可以选择性体外扩增dna或rna片段，操作简单、特异性强、快速、敏感性高等特点。taqman探针法检测特异性强，灵敏度高，方便优化反应条件，能够用于prrsv-n的快速检测。pcr技术作为一种分子生物学工具，可以选择性体外扩增dna或rna片段，操作简单、特异性强、快速、敏感性高等特点。taqman探针法检测特异性强，灵敏度高，方便优化反应条件，能够用于prrsv-n基因的快速检测。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是提供一种用于检测prrsv-n基因的特异性引物和探针及其试剂盒与使用方法，它能广泛应用于prrsv-n基因检测，且具有快速、灵敏、特异性好的特点，能对prrsv-n基因含量进行定性、定量分析，而且使用简单方便。

本发明是这样实现的：用于检测prrsv-n基因的特异性引物和探针，探针序列为：5'cccaacaaaaccagtccagaggcaagg3'；特异性引物为下述序列或为下述序列的互补链序列：上游引物序列为5'gtgccaaatgctgggtaagat3'；下游引物序列为5'ccgctcactgggggtaaa3'。

所述的探针5’端标记的荧光报告基团为fam，3’端标记的荧光淬灭基团为bhq。

prrsv-n基因的实时荧光定量pcr试剂盒，该试剂盒的组成包括所述的特异性引物与探针；采用25μl反应体系：上下游引物各0.4μl，探针引物0.4μl；试剂盒中还包括系列浓度标准品和阳性对照；其中，系列浓度标准品是将prrsv-n基因与载体连接，转化至感受态细胞中诱导表达，提取重组质粒，将重组质粒定量后稀释，得到系列浓度标准品。

所述的实时荧光定量pcr试剂盒的使用方法，分别以系列浓度标准品和待测样品dna为模板，利用试剂盒中特异性引物和探针进行实时荧光定量pcr，绘制标准曲线，通过标准曲线和待测样品的ct值判定结果。

所述实时荧光定量pcr的反应条件为：42℃5min；95℃10s；95℃5s，退火30s收集荧光，并循环40次。

与现有技术相比，本发明发现了适合作检测prrsv-n基因的特异性引物和探针，并采用基因克隆技术，将prrsv-n基因片段插入到载体pmd18-t中，获得含有prrsv-n基因片段的重组质粒，以此作为标准品，并组合得到pcr检测试剂盒，通过优化pcr反应条件，建立以实时荧光定量聚合酶链反应为平台的检测方法，并对所建立的方法进行评估。能定性或定量检测或辅助检测prrsv-n基因；制备定性或定量检测或辅助检测prrsv-n基因产品。对判prrsv-n基因的含量以至于后续研究具有重要意义。

附图说明

图1为prrsv-n基因总rna提取图谱。

图2为prrsv-n基因荧光定量pcr动力学曲线；

图3为本发明标准品的标准曲线。

具体实施方式

本发明的实施例：以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。所用引物、探针和所用序列测定工作均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成和完成。

1、引物设计

通过primer5.0、primerselect等软件设计prrsv病毒e11105株n基因基因荧光定量扩增引物和taqman探针引物，引物由生工生物(上海)股份有限公司合成，taqman探针引物5’端加fam报告基团，3’端加bhq淬灭基团。引物见下表：

表1-1所需引物

2、prrsv病毒的扩增

将长满的细胞，用2ml不含胎牛血清的高糖dmem洗2遍，倒出洗液后，加入1ml病毒液，吸附1h后加入6ml含3％澳洲胎牛血清的高糖dmem维持液，观察细胞病变。72h后将细胞放入-80℃冻融3次，收取病毒液。

3、病毒tcid50的测定

将marc145细胞接到96孔细胞培养板，每空100μl，细胞密度控制在大约24h能长满孔，待细胞长满孔后，每孔用100μl无血清dmem洗两遍，吸出dmem，把按10^-1、10^-2、10^-3……10^-8等比稀释后的病毒稀释液100μl接种到细胞培养板中，5％co2细胞培养箱37℃吸附1h后吸出病毒液，换上100μl维持液，培养48h后数出各个稀释度出现cpe的孔数，参照reed-muench方法计算tcid50。reed-muench法计算公式为：

lgtcid50＝高于50％cpe的病毒稀释度的对数+距离比例值×稀释倍数的对数。

距离比例值＝(高于50％cpe比率-50％)/(高于50％cpe比率-低于50％的cpe比率)。

4、细胞总rna的提取

(1)取培养48h的淋巴细胞培养瓶，倒出培养液，用无菌1×pbs缓冲液清洗。

(2)向瓶中加入3ml的rnaisoplus裂解液，均匀的晃动培养瓶，以确保裂解液能在瓶底的细胞表面均匀分布。

(3)将瓶内裂解液移至1.5ml离心管中，用移液枪反复吹打至裂解液中沉淀不明显为止。

(4)在室温下(15～30℃)静置5min。

(5)向上述步骤2.3.1中含匀浆裂解液的离心管中加入氯仿200μl，盖紧离心管盖，充分混合均匀，使其管内溶液呈明显的乳白色。并在室温下静置5min。

(6)启用冷冻离心机中，设置条件在12000×g、4℃下离心15min，小心取出离心管，可见此时的匀浆分为三层，其中无色上清层为实验所需的rna层。

(7)用移液枪吸取无色上清层转移至另一新的无菌干净1.5ml离心管中。

(8)向离心管中加入1ml异丙醇，上下颠倒1.5ml离心管进行充分混匀后，室温静置10min。

(9)设置条件在12000×g、4℃下离心10min，此时可见管底部出现rna沉淀。

(10)弃掉管中上清，勿触及沉淀，加入75％的乙醇1ml，轻轻上下颠倒以洗涤离心管壁，在7500×g、4℃条件下离心5min，小心弃掉上清，勿触及沉淀。

(11)在室温下静置5min干燥管内沉淀，向管内加入1ml的rnasefree水溶解沉淀。

5、反转录

以提取的总rna作为模版，逆转录合成cdna。反应体系：rna1μg，oligo(dt)151μl，18srrna下游引物1μl，70℃的水浴锅作用5min后，取出置于冰上，再加入5×m-mlvbuffer6μl、核酸酶抑制剂10u、dntpmix(10mm)2μl、m-mlv反转录酶100u、补h2o至30μl。反转录条件：42℃水浴1h，75℃灭活15min，置于-20℃保存备用。

6、标准质粒的制备

将新提取的rna反转录为cdna后，采用表2-1中tlr1q～tlr10q引物进行pcr扩增，采用25μl反应体系：2×taqpcrmastermix12.5μl，上下游引物各1μl，cdna2μl，补水至25μl。扩增产物经胶回收纯化、载体连接转化、质粒提取及鉴定、测序等步骤(具体操作方法同第一章2.3)获得prrsv-n基因的标准质粒，pcr扩增参数见表3-2。

表1-2prrsv-n基因pcr扩增反应参数

7、标准质粒拷贝数计算

使用分光光度计测定步骤2.7获得的prrsv-n基因标准质粒的浓度及纯度，利用公式计算质粒拷贝数，计算公式为：质粒拷贝数(copies/μl)＝6.02×10²³×质粒浓度(g/μl)/质粒的分子量(g/mol)。

8、反应体系的建立与条件优化

将prrsv-n标准质粒进行稀释，使用10-3倍稀释为模版，建立20μl反应：2×onesteprt-pcrbufferiii10μl，takaraextaqhs0.4μl，primescriptrtenzymemixⅱ0.4μl，上下游引物各0.4μl，探针引物0.4μl，模版2μl，rnasefreedh2o6μl，将引物和探针配制成50μmol/l、25μmol/l和10μmol/l进行优化，分别设置56℃、58℃、60℃、62℃退火进行退火温度优化。

9、prrsv-n基因taqman荧光探针标准曲线的建立

将prrsv-n标准品稀释成整数倍，再按10倍梯度进行稀释，选取其中5个梯度进行标准曲线的绘制，即10⁷～10³为模版，同时设立阴性对照，采用优化好的扩增条件进行实时荧光定量pcr。以实时荧光定量pcr扩增所得的ct值为纵坐标，以标准品拷贝数的对数值为横坐标，绘制动力学曲线。

10、重复性试验

将稀释的标准品各浓度梯度(10⁵～10⁷)使用建立的prrsv-n基因taqman探针法实时荧光定量pcr进行重复检测，批内批间各3次。对ct值进行统计学分析，验证所建标准曲线的稳定性。重复性试验结果显示，本次所建的prrsv-n基因mrna表达量检测标准曲线批内和批间重复性均较好，cv％值均小于2％，说明具有较好的重复性和稳定性，具体数据见表1-3。

表1-3prrsv-n基因荧光定量pcr重复性试验结果

序列表

<110>贵州大学

<120>用于检测prrsv-n基因的特异性引物和探针及其试剂盒与使用方法

<160>3

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>21

<212>dna

<213>猪(bostaurus)

<400>1

gtgccaaatgctgggtaagat21

<210>2

<211>18

<212>dna

<213>猪(bostaurus)

<400>2

ccgctcactgggggtaaa18

<210>3

<211>27

<212>dna

<213>猪(bostaurus)

<400>3

cccaacaaaaccagtccagaggcaagg27