一种基于分子信标的荧光环介导等温扩增方法与流程

本发明涉及一种基于分子信标的荧光环介导等温扩增方法。

背景技术

环介导等温扩增技术是由notomi在2001年建立的一种新型体外核酸扩增检测技术。它使用4-6条引物去鉴定6-8段特异性的核酸片段。dna聚合酶具有链置换功能，在它的帮助下，目的基因可以在很短的时间内，恒温的条件下，得到高效、特异的扩增。与此同时，反应析出大量的白色焦磷酸镁沉淀，利用这个特点，实验人员可以通过观察反应体系的浑浊程度来判断结果是阴性还是阳性。由于lamp反应是在恒温条件下进行的，所以一个稳定的热源(例如水浴或者金属浴)就能满足实验条件的要求，与此同时，实验的仪器费用也大大降低了。由于上述lamp的诸多优点，它已经在微生物检测，例如细菌，真菌，病毒以及基因疾病检测，婴儿早期性别诊断等方面得到了普遍的应用。

pcr是利用两条引物特异地识别目的片段的两个区域，而lamp是识别了6-8个独立的基因片段，因此从理论上讲，lamp应该比pcr具有更高的特异性，但是事实却并非如此。因为引物数目较多，所以lamp更容易遇到由非特异扩增而带来的假阳性问题，这一点已经被数位研究者所证实。而更重要的是，由于传统的检测方法都是间接地对反映产物进行检测，所以不能从真实的结果当中分辨出这种假阳性。传统的检测方法原理大致如下：

1、电泳法：利用传统的凝胶电泳法对lamp的反映产物进行条带分析。但是由于lamp扩增出来的片段大小是不规则的，所以电泳结果呈弥漫状态。无论哪一系列引物或者模版参与反应，电泳的结果都几乎相似，所以我们不能根据条带的形状和大小判定是否有假阳性的结果产生。同时电泳的方式很容易产生气溶胶污染，这将会影响lamp的实验结果。

2、sybrgreenⅰ染色法：sybrgreenⅰ在结合到dna双链结构上以后，可被紫外光激发而发光。利用这种特性，在lamp反应结束以后向产物中滴加sybrgreenⅰ，我们就可以在紫外光下根据绿色荧光而判读实验结果。但是，除了扩增产物，sybrgreenⅰ可以结合所有的双链dna而发光，从而造成了结果不易判读、高荧光背景值的情况。除此之外，由于sybrgreenⅰ需要在反应结束后打开反应管再加入，这样反映就不能在一个密闭体系内进行，从而会发生气溶胶污染的情况。

3、沉淀法：lamp反应过程中会产生焦磷酸镁沉淀，而且产生的量比较大，反应完成后通过离心的作用，可以把所有沉淀聚集在一起，通过肉眼观察便可以判断结果，但由于焦磷酸镁在溶液体系中具有非常好的分散性，离心聚集后可以瞬间再次分散到反应溶液中，这样就容易产生假阴性。

4、羟基萘酚蓝染色(hnb)：羟基萘酚蓝染色是一种金属离子指示剂，它能根据溶液中mg²⁺的不同而显示出不同的颜色，由于lamp反应中产生焦磷酸镁沉淀，会大量消耗mg²⁺，这样hnb的颜色就会改变，但hnb不稳定，不容易保存，需要现用现配，使用起来不方便，另一个问题是hnb的颜色反应不明显，不容易察觉颜色变化，虽然目前很多研究者在使用本方法，但并没有获得大家的认可。

5、浊度法：浊度法是目前研究lamp反应获得认可最多的方法，它通过实时浊度仪检测反应体系浊度的变化，并绘制曲线以反映反应结果，由于全程由仪器来监测，排除了人为判断的干扰，结果可信，再者这种方法可以真实再现lamp反应的时间点，反应效率等参数，在对于最佳引物筛选实验、最佳温度实验具有非常好的指导意义，是研发lamp试剂盒必不可少的仪器。

6、钙黄绿素/mn²⁺染色：钙黄绿素本身是金属离子指示剂，可根据溶液中金属离子的多少而发出荧光，mn²⁺可以和钙黄绿素螯合，进而淬灭其荧光，在lamp反应过程中会产生焦磷酸镁沉淀，如果反应溶液中含有mn²⁺的话，那么生成的便是焦磷酸锰沉淀，这样就会释放出与钙黄绿素螯合的mn²⁺，钙黄绿素的荧光也就被激发出来。

7、复合探针法：根据荧光能量转移原理，陈苏红等设计及合成了一种新的复合探针，该探针由一条长的荧光杂交探针和短的淬灭探针构成，其中荧光探针5’端接一荧光素分子，3’端接一延伸阻断分子磷酸，淬灭探针3’端连接一个淬灭分子对甲基红，淬灭探针与荧光探针5’端互补，无模板时，该探针杂交形成复合探针，无荧光产生，当有模板时，荧光探针与模板杂交，荧光不能被淬灭，产生的荧光与模板量成正比。复合探针虽然引入了探针，但其仍不是对产物的直接检测。

这些间接检测方法均无法对扩增产物进行直接的判定，如果产生了非特异扩增，将无法识别，这也是lamp技术遭遇的一个大的问题。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种基于分子信标的荧光环介导等温扩增方法。

本发明首先保护一种用于荧光环介导等温扩增的引物探针组合，由lamp引物组合和分子信标探针lbp组成；所述lamp引物组合由前引物f3、后引物b3、前内引物fip、后内引物bip和加速引物lb组成；

将加速引物lb人为划分为lb-a区段和lb-b区段；分子信标探针lbp自上游至下游依次包括：lbp-b1区段、lbp-a区段和lbp-b2区段；lbp-a区段的核苷酸序列与lb-a区段的核苷酸序列相同；lbp-b1区段和lbp-b2区段反向互补；lbp-b1区段或lbp-b2区段的核苷酸序列与lb-b区段的核苷酸序列相同；

所述分子信标探针lbp，一个末端连接有荧光基团，另一个末端连接有荧光淬灭基团。

所述lbp-b1区段由6个核苷酸组成；所述lbp-a区段由12-13个核苷酸组成。

所述lbp-a区段具体可由13个核苷酸组成。

所述荧光基团具体可位于分子信标探针的5’末端。

所述有荧光淬灭基团具体可位于分子信标探针的3’末端。

所述荧光基团具体可为荧光基团fam。

所述荧光淬灭基团具体可为荧光淬灭基团dabcyl。

所述引物探针组合具体可为引物探针组合甲，所述引物探针组合甲中，

所述前引物f3为如下(a1)或(a2)；

(a1)序列表的序列1所示的单链dna分子；

(a2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的dna分子；

所述后引物b3为如下(a3)或(a4)；

(a3)序列表的序列2所示的单链dna分子；

(a4)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的dna分子；

所述前内引物fip为为如下(a5)或(a6):

(a5)序列表的序列3所示的单链dna分子；

(a6)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的dna分子；

所述后内引物bip为如下(a7)或(a8):

(a7)序列表的序列4所示的单链dna分子；

(a8)将序列4经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的dna分子；

所述加速引物lf为如下(a9)或(a10):

(a9)序列表的序列5所示的单链dna分子；

(a10)将序列5经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列5具有相同功能的dna分子；

所述加速引物lb为如下(a11)或(a12):

(a11)序列表的序列6所示的单链dna分子；

(a12)将序列6经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列6具有相同功能的dna分子；

所述分子信标探针lbp为如下(b1)或(b2):

(b1)序列表的序列7所示的单链dna分子；

(b2)将序列7经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列7具有相同功能的dna分子。

本发明还保护以上任一所述的引物探针组合在制备试剂盒中的应用；所述试剂盒的功能为(c1)或(c2)：

(c1)检测待测样本是否为目标物；

(c2)检测待测样本中是否含有目标物。

本发明还保护含有以上任一所述引物探针组合的试剂盒；所述试剂盒的功能为(c1)或(c2)：

(c1)检测待测样本是否为目标物；

(c2)检测待测样本中是否含有目标物。

本发明还保护所述试剂盒的制备方法，包括将各条引物探针单独包装的步骤。

本发明还保护一种检测待测样本是否为目标物的方法，包括如下步骤：以待测样本的基因组dna或cdna为模板，采用以上任一所述的引物探针组合进行荧光环介导等温扩增，监测荧光信号，如果显示阳性扩增曲线、待测样本为或候选为目标物，如果不显示阳性扩增曲线、待测样本为或候选为非目标物。

本发明还保护一种检测待测样本中是否含有目标物的方法，包括如下步骤：以待测样本的总dna或待测样本的总rna反转录得到的cdna为模板，采用以上任一所述的引物探针组合进行荧光环介导等温扩增，监测荧光信号，如果显示阳性扩增曲线、待测样本含有或疑似含有目标物，如果不显示阳性扩增曲线、待测样本不含有或疑似不含有目标物。

以上任一所述荧光环介导等温扩增的反应体系中，所述分子信标探针lbp的浓度可为2-10pmol，具体可为2pmol、4pmol、6pmol、8pmol或10pmol，最优选为8pmol。

以上任一所述荧光环介导等温扩增的反应温度可为60-66℃，具体可为60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃或66℃)，最优选为63℃。

以上任一所述荧光环介导等温扩增的反应体系具体可为：模板2μl，tris-hcl(ph＝8.8)20mm，kcl10mm，(nh4)2so410mm，甜菜碱0.8m，mgso48mm，dntp1.4mm，tween200.25μl，bstdna聚合酶8u，引物hl-f35pmol，引物hl-b35pmol，引物hl-fip40pmol，引物hl-bip40pmol，引物hl-lf20pmol，引物hl-lb20pmol，分子信标探针lbp8pmol。

以上任一所述荧光环介导等温扩增的反应条件具体可为63℃恒温反应60min。

以上任一所述目标物具体可为霍乱弧菌。当所述目标物为霍乱弧菌时，以上任一所述方法中采用引物探针组合甲进行荧光环介导等温扩增。

本发明将分子信标引入到lamp技术，建立了基于分子信标的荧光环介导等温扩增方法，并将其命名为mb-lamp，从而实现了对扩增产物的直接检测，从根本上解决了lamp方法非特异扩增的问题，具有巨大的应用价值和商业价值。

附图说明

图1为实施例1步骤二的2的检测结果。

图2为实施例1步骤三的检测结果。

图3为实施例1步骤四的检测结果。

图4为实施例2中mb-lamp反应的检测结果。

图5为实施例2中lamp反应的检测结果。

图6为实施例3中lamp反应的检测结果。

图7为实施例3中mb-lamp反应的检测结果。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

puc57载体：北京天一辉远生物科技有限公司。

lamp的浊度和mb-lamp的荧光值分别由loopampturbidimeter(la-320c；eikenchemicalco.,ltd.)和cfxconnectreal-timepcrdetectionsystem(cfxconnect；bio-radco.,ltd,california,usa)检测从而获得数据进行分析。

霍乱弧菌阳性质粒：将序列表的序列8所示的双链dna分子插入puc57载体的ecorv和bamhⅰ酶切位点之间，得到的重组质粒。

实施例1、引物探针的设计合成及检测方法优化

一、引物的设计与合成

经过大量序列分析、比对得到了用于鉴定霍乱弧菌的一套引物组合。引物组合包括前引物(hl-f3)、后引物(hl-b3)、前内引物(hl-fip)、后内引物(hl-bip)和两条加速引物(hl-lf、hl-lb)。引物序列如下所示(5’→3’)：

hl-f3(序列表的序列1)：cctaaatgtagcaaattgatttcct；

hl-b3(序列表的序列2)：gtcattaggtactaccgagg；

hl-fip(序列表的序列3)：tccttttttgtagggctatgttgttgtttgtgtgatttttgtgtgc；

hl-bip(序列表的序列4)：accatttgcctagccgtactacaataaagtcaccttcttgg；

hl-lf(序列表的序列5)：tgtgttgcgcgcacagta；

hl-lb(序列表的序列6)：tgcagccctactagccgct。

二、分子信标的设计与筛选

1、针对步骤一得到的引物组合设计配套的分子信标探针。

共设计了如下几套分子信标探针(5’→3’)：

(1)lbp：agcggctgcagccctactagccgct；

(2)lbp-1：caaatatgcagccctactagccgctcctgtatttg；

(3)lbp-2：agggcttgcagccct。

上述探针中，下划线部分为环颈部，非下划线部分为臂部。

在每个分子信标探针的5’末端连接荧光基团fam，3’末端连接荧光淬灭基团dabcyl。

2、以霍乱弧菌阳性质粒为模板，采用分子信标引物组合进行mb-lamp反应。

分子信标引物组合ⅰ：步骤一的引物组合+步骤二的1的分子信标(1)；

分子信标引物组合ⅱ：步骤一的引物组合+步骤二的1的分子信标(2)；

分子信标引物组合ⅲ：步骤一的引物组合+步骤二的1的分子信标(3)；

mb-lamp反应体系：(25μl)：模板2μl(dna含量为100ng)，tris-hcl(ph＝8.8)20mm，kcl10mm，(nh4)2so410mm，甜菜碱0.8m，mgso48mm，dntp1.4mm，tween200.25μl，bstdna聚合酶8u，引物hl-f35pmol，引物hl-b35pmol，引物hl-fip40pmol，引物hl-bip40pmol，引物hl-lf20pmol，引物hl-lb20pmol，分子信标探针均为8pmol。每个分子信标引物组合设置三个重复。

mb-lamp反应条件：63℃恒温反应60min。

结果如图1所示。图1中，横坐标为反应循环数，纵坐标为相对荧光单位rfu。结果表明，环颈部长度为3bp和23bp的探针在扩增反应过程中，荧光值在基线附近摆动而得不到显著的扩增。最优结构具有13bp的环颈部结构和6bp的臂部结构，其荧光值在反应过程中可达到7000rfu，可以很好的检测到反应的进行。

综合以上结果，筛选出用于mb-lamp的最佳分子信标探针(5’→3’)：

lbp(序列表的序列7)：agcggctgcagccctactagccgct。

hl-f3、hl-b3、hl-fip、hl-bip、hl-lf、hl-lb、lbp组成引物探针组合。

三、分子信标探针含量优化

以霍乱弧菌阳性质粒为模板，采用步骤二的引物探针组合进行mb-lamp反应。

mb-lamp反应体系：(25μl)：模板2μl(dna含量为100ng)，tris-hcl(ph＝8.8)20mm，kcl10mm，(nh4)2so410mm，甜菜碱0.8m，mgso48mm，dntp1.4mm，tween200.25μl，bstdna聚合酶8u，引物hl-f35pmol，引物hl-b35pmol，引物hl-fip40pmol，引物hl-bip40pmol，引物hl-lf20pmol，引物hl-lb20pmol，分子信标探针lbp。

根据分子信标探针在反应体系中的含量不同，分为如下体系(每个反应体系设置三次重复)：

反应体系1：分子信标探针lbp在反应体系中的含量均为2pmol；

反应体系2：分子信标探针lbp在反应体系中的含量均为4pmol；

反应体系3：分子信标探针lbp在反应体系中的含量均为6pmol；

反应体系4：分子信标探针lbp在反应体系中的含量均为8pmol；

反应体系5：分子信标探针lbp在反应体系中的含量均为10pmol。

mb-lamp反应条件：63℃恒温反应60min。

结果如图2所示。图2中，横坐标为反应循环数，纵坐标为相对荧光单位rfu(10³)，从底部到顶部的五簇曲线分别依次对应反应体系1-5得到的扩增曲线。结果显示，荧光信号值随着分子信标的含量上升而上升，但第四和第五簇曲线的差异并不明显，所以选择8pmol作为分子信标最终的含量。

四、反应温度优化

以霍乱弧菌阳性质粒为模板，采用步骤二的引物探针组合进行mb-lamp反应。

mb-lamp反应体系：(25μl)：模板2μl(dna含量为100ng)，tris-hcl(ph＝8.8)20mm，kcl10mm，(nh4)2so410mm，甜菜碱0.8m，mgso48mm，dntp1.4mm，tween200.25μl，bstdna聚合酶8u，引物hl-f35pmol，引物hl-b35pmol，引物hl-fip40pmol，引物hl-bip40pmol，引物hl-lf20pmol，引物hl-lb20pmol，分子信标探针均为8pmol。

mb-lamp反应条件：恒温反应60min。设置不同的反应温度(60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃)，每个温度设置三次重复。

结果如图3所示。图3中，横坐标为反应循环数，纵坐标为相对荧光单位rfu。结果显示，在较高的65、66℃条件下，反应曲线不稳定，基线并没有被压至阈值线以下。在59到64℃之间，ct值随着温度的升高先下降后上升，63℃时对应ct值最小即反映效率最高。

实施例2、特异性

待测样本为：bacilluscereusatcc14579(蜡样芽孢杆菌)、pseudomonasaeruginosaatcc15692(绿脓杆菌)、enterococcusfaeciumatcc6569(屎肠球菌)、streptococcusdysgalactiaeatcc27957(停乳链球菌)、escherichiacoliatcc25922(大肠杆菌)、streptococcusuberisatcc9927(乳房链球菌)、streptococcuspneumoniaatcc49619(肺炎链球菌)、salmonellaentericaatcc14028(肠道沙门氏菌)、yersiniaenterocoliticaatcc9610(结肠炎耶尔森杆菌)、yersiniaenterocoliticaatcc9610(结肠炎耶尔森杆菌)、vibrioparahemolyticusatcc17802(副溶血性弧菌)、staphylococcusaureusatcc25923(金黄色酿脓葡萄球菌)、shigellaflexneriatcc12022(弗累克斯讷氏杆菌)、staphylococcusepidermidisatcc12228(表皮葡萄球菌)、enterococcusfaecalisatcc29212(粪肠球菌)和vibriocholeraatcc11561(霍乱弧菌)。

1、以待测样本的总dna为模板，采用实施例1步骤二的引物探针组合进行mb-lamp反应。

mb-lamp反应体系(25μl)：模板2μl(dna含量为100ng)，tris-hcl(ph＝8.8)20mm，kcl10mm，(nh4)2so410mm，甜菜碱0.8m，mgso48mm，dntp1.4mm，tween200.25μl，bstdna聚合酶8u，引物hl-f35pmol，引物hl-b35pmol，引物hl-fip40pmol，引物hl-bip40pmol，引物hl-lf20pmol，引物hl-lb20pmol，分子信标探针lbp8pmol。

mb-lamp反应条件：63℃恒温反应60min。

结果如图4所示。图4中，横坐标为反应循环数，纵坐标为相对荧光单位rfu。结果表明，除了霍乱弧菌能扩增出扩增曲线外，其余菌株均未得到扩增曲线，显示了很好的特异性。

2、以待测样本的总dna为模板，采用实施例1步骤一的引物组合进行lamp反应。

lamp反应体系(25μl)：模板2μl(dna含量为100ng)，tris-hcl(ph＝8.8)20mm，kcl10mm，(nh4)2so410mm，甜菜碱0.8m，mgso48mm，dntp1.4mm，tween200.25μl，bstdna聚合酶8u，引物hl-f35pmol，引物hl-b35pmol，引物hl-fip40pmol，引物hl-bip40pmol，引物hl-lf20pmol，引物hl-lb20pmol。

lamp反应条件：63℃恒温反应60min。

结果如图5所示。结果表明，使用普通lamp反应检测，后期会出现一定量的非特异扩增来干扰实验结果。

综合以上结果表明，普通lamp反应检测后期会出现一定量的非特异扩增来干扰实验结果，而mb-lamp反应不会受非特异扩增产物的影响。

实施例3、敏感性

1、用无菌水10倍梯度稀释霍乱弧菌阳性质粒，得到各稀释液。

2、以步骤1得到的各稀释液为模板，采用实施例1的步骤一的引物组合进行lamp反应。

lamp反应体系(25μl)：模板2μl，tris-hcl(ph＝8.8)20mm，kcl10mm，(nh4)2so410mm，甜菜碱0.8m，mgso48mm，dntp1.4mm，tween200.25μl，bstdna聚合酶8u，引物hl-f35pmol，引物hl-b35pmol，引物hl-fip40pmol，引物hl-bip40pmol，引物hl-lf20pmol，引物hl-lb20pmol，分子信标探针lbp8pmol。

lamp反应条件：63℃恒温反应60min。

由于采用的稀释度不同，形成如下不同的反应体系：

反应体系l1中，质粒dna的初始含量为：20ng；

反应体系l2中，质粒dna的初始含量为：2ng；

反应体系l3中，质粒dna的初始含量为：200pg；

反应体系l4中，质粒dna的初始含量为：20pg；

反应体系l5中，质粒dna的初始含量为：2pg；

反应体系l6中，质粒dna的初始含量为：200fg；

反应体系l7中，质粒dna的初始含量为：20fg；

反应体系l8中，质粒dna的初始含量为：2fg；

反应体系l9中，质粒dna的初始含量为：0.2fg；

反应体系l10中，用等体积的蒸馏水替代质粒dna。

结果如图6所示。图6中，横坐标为时间(分钟)，纵坐标为浊度(650nm)。结果表明，lamp反应的最低检测下限为2fg。

3、以步骤1得到的各稀释液为模板，采用实施例1的步骤二的引物探针组合进行mb-lamp反应。

mb-lamp反应体系：(25μl)：模板2μl，tris-hcl(ph＝8.8)20mm，kcl10mm，(nh4)2so410mm，甜菜碱0.8m，mgso48mm，dntp1.4mm，tween200.25μl，bstdna聚合酶8u，引物hl-f35pmol，引物hl-b35pmol，引物hl-fip40pmol，引物hl-bip40pmol，引物hl-lf20pmol，引物hl-lb20pmol，分子信标探针lbp8pmol。

mb-lamp反应条件：63℃恒温反应60min。

由于采用的稀释度不同，形成如下不同的反应体系：

反应体系m1中，质粒dna的初始含量为：20ng；

反应体系m2中，质粒dna的初始含量为：2ng；

反应体系m3中，质粒dna的初始含量为：200pg；

反应体系m4中，质粒dna的初始含量为：20pg；

反应体系m5中，质粒dna的初始含量为：2pg；

反应体系m6中，质粒dna的初始含量为：200fg；

反应体系m7中，质粒dna的初始含量为：20fg；

反应体系m8中，质粒dna的初始含量为：2fg；

反应体系m9中，质粒dna的初始含量为：0.2fg；

反应体系m10中，用等体积的蒸馏水替代质粒dna。

结果如图7所示。图7中，横坐标为反应循环数，纵坐标为相对荧光单位rfu。图7中从左至右依次对应反应体系m1-m9得到的扩增曲线，ct值依次为26、29、33、37、40、44、48、52，反应体系m9和m10未得到扩增曲线。结果表明，mb-lamp反应的最低检测下限同样为2fg。

序列表

<110>中国人民解放军疾病预防控制所

<120>一种基于分子信标的荧光环介导等温扩增方法

<160>8

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>25

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

cctaaatgtagcaaattgatttcct25

<210>2

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

gtcattaggtactaccgagg20

<210>3

<211>46

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

tccttttttgtagggctatgttgttgtttgtgtgatttttgtgtgc46

<210>4

<211>41

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

accatttgcctagccgtactacaataaagtcaccttcttgg41

<210>5

<211>18

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>5

tgtgttgcgcgcacagta18

<210>6

<211>19

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>6

tgcagccctactagccgct19

<210>7

<211>25

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>7

agcggctgcagccctactagccgct25

<210>8

<211>1031

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>8

agagtattgaagatgttgcaaaagtgtagcaagttgcaaacacattattaatgtgcctaa60

atgtagcaaattgatttcctacaagtttgtgtgatttttgtgtgctactgtgcgcgcaac120

acaaagataacaacatagccctacaaaaaaggaaaacgtcatgaaacaaaccatttgcct180

agccgtacttgcagccctactagccgctcctgtatttgctcaccaagaaggtgactttat240

tgtgcgcgcgggtattgcctcggtagtacctaatgacagtagcgataaagtgttaaacac300

tcaaagtgagttggcagttaatagcaatacccacttagggttaacgcttggctatatgtt360

tactgacaacatcagttttgaagtcctcgctcgtacgccattttcacataagatttctac420

ctctggtggtgagttaggtagccttggtgatattggtgaaacaaaacatttgccacctac480

ctttatggtccaatactactttggtgaagctaattcgacaaaccgtccatatgttggtgc540

gggtttgaattacaccactttctttgatgaaagctttaatagtacgggtactaataatgc600

attgagtgatttaaaactggacgactcatggggacttgctgctaacgttggctttgatta660

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