厚壳贻贝金属硫蛋白基因在海洋重金属污染监测中的应用的制作方法

本发明涉及生物科学技术领域，尤其是涉及厚壳贻贝金属硫蛋白基因在海洋重金属污染监测中的应用。

技术背景

厚壳贻贝（mytiluscoruscus）是一种常见的经济型双壳贝类，属于贻贝目（mytiloida）贻贝科（mytilidae）贻贝属（mytilus），分布广泛，最北从辽宁大连、渤海、黄海、东海到福建沿海区域均有分布痕迹，其中属浙江沿海的资源最为丰富。可是随着沿海城市工业化的快速发展，海洋环境进一步遭到破坏，给厚壳贻贝生存繁殖的海域带来了极大的破坏，海水水质、环境条件一步步恶化，污染严重。软体动物中的双壳贝类，对海洋环境中重金属具有较强的生物富集作用，常常用它来监测海洋环境污染情况，成为实时监测海洋环境的典型生物指示物之一。而作为典型的滤食性潮间带生物之一的厚壳贻贝，因具有个体较大，活动性差，容易采集，生活史较长，对环境污染物（例如重金属、病原微生物等）具有很强的耐受性等特征，成为监测海区环境变化指示物的重要一员。

金属硫蛋白（metallothionein，mt）的化学名为金属硫组氨酸三甲基内盐，普遍存在于生物体内，其低分子量（6-7kda），富含半胱氨酸，具有热稳定性，是一类可诱导型的非酶蛋白。mt普遍存在于各种生物体中，分布广泛，在人体、动植物以及微生物体内均有其分布痕迹，且理化性质基本一致，尤其是在肝脏和肾脏中有丰富的含量，它也可被应激激素、重金属、化学药品、电离辐射、激素等多种因素诱导表达合成。作为环境中主要的污染源，重金属给周围环境所带来的破坏以及对人体所造成的危害一直是人类在环境科学研究领域中异常重视的部分。mt最重要的一个特点就是在转录水平上被环境中的重金属所诱导合成，同时重金属的浓度也跟这次诱导有一定的相关性，可以同样反映环境中的重金属含量水平。生活在海水域中的无脊椎动物，由于具有非常敏感的外界环境感知力，并且容易富集重金属离子，常常被选作指示生物来检测重金属污染的水生态毒理学。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种从分子水平上预测其受重金属暴露的状况和重金属的污染压力，特异性强，mt基因的表达量与生物体内重金属浓度具有明显的正相关性，作为养殖水体环境污染预警标记提供指导厚壳贻贝金属硫蛋白基因在海洋重金属污染监测中的应用。

本发明针对背景技术中提到的问题，采取的技术方案为：

厚壳贻贝金属硫蛋白基因，采用基因克隆技术获得，基因的核苷酸序列为seqidno.7，序列全长位314bp。金属硫蛋白mt是一类普遍存在于生物体内的低分子量、富含半胱氨酸、热稳定性、可诱导型非酶蛋白，具有稳定调节细胞内金属水平，参与生物体内必须金属元素的调节和非必需金属的解毒功能。

作为优选，基因克隆包括如下步骤：

1）总rna的提取；

2）cdna第一条链的合成；

3）厚壳贻贝mt核心序列的扩增；

4）序列信息分析。

进一步优选，扩增用引物为：

mt-f：5'-atgsctgttccttgtaacccaaty-3'；

mt-r：5'-tcacacgcaggaatancctggtkc-3'。

作为优选，基因的核心片段为222bp，编码73个氨基酸，分子量为7.21kda，等电点为7.75。本发明克隆获得厚壳贻贝mt分子cdna核心序列的分子量为7.21kd，与其他贝类相近，氨基酸序列与多种贝类同源性均较高（90%以上），同时本发明得到厚壳贻贝金属硫蛋白基因表达的氨基酸序列中富含半胱氨酸(cys)达18.9%，cys是金属结合位点，其巯基能共价结合金属离子，cys富集也是软体动物mts的重要特征之一，因此认为所得到的序列为厚壳贻贝mt分子。

作为优选，金属硫蛋白基因在肝脏中的表达水平量最高。厚壳贻贝mt基因在肝脏中表达量中最高，而肝脏表达比较稳定，并且肝脏是软体动物体内主要的解毒器官，其中大量能做变形运动的（肝）巨噬细胞有活跃的吞噬能力，毒物在肝脏内通过氧化、还原或水解过程转化成无毒、低毒易溶的代谢物排出体外，在该过程中会产生大量的超氧阴离子自由基，另外，当重金属污染胁迫时，重金属离子由鳃进入血液作用到很多的靶组织细胞，这些被伤害的组织细胞产生的代谢紊乱产物又汇集到肝脏，所以可选取肝脏作为环境胁迫监测的靶组织。

本发明还公开上述厚壳贻贝金属硫蛋白基因在海洋重金属污染监测中的应用。金属硫蛋白具有维持厚壳贻贝体内金属含量动态平衡和重金属解毒作用双重机制，在转录水平上易被环境中的重金属所诱导，而且这种诱导与重金属浓度具有相关性，可以反映环境中的重金属含量水平，因此，通过监测厚壳贻贝体内mt含量变化，可从分子水平上预测其受重金属暴露的状况和重金属的污染压力，特异性强，为厚壳贻贝的大规模健康养殖及正确运用贝类mt分子作为养殖水体环境污染预警标记提供指导。

作为优选，金属硫蛋白酶基因监测海洋重金属污染的方法为：

1）提取受到重金属污染厚壳贻贝肝脏中的rna；

2）cdna合成；

3）用荧光定量技术检测金属硫蛋白酶在肝脏中的相对表达量，即可。在生物体遭受重金属暴露后，mt被认为是最先参与重金属解毒和代谢的生物大分子，mt基因的表达量与生物体内重金属浓度具有明显的正相关性。

进一步优选，所需引物为：

qmt-f：5'-atgcctgcaccttgtaactg-3'；

qmt-r：5'-ggtcccgtacatcctcctt-3'；

β-actin-f：5'-atgaaaccacctacaacagt-3'；

β-actin-r：5'-tagacccaccaatccagacg-3'。

与现有技术相比，本发明的优点在于：1）本发明克隆获得厚壳贻贝mt分子cdna核心序列的分子量为7.21kd，氨基酸序列与多种贝类同源性均较高（90%以上）；2）本发明厚壳贻贝mt基因在肝脏中表达量中最高，当重金属污染胁迫时，重金属离子由鳃进入血液作用到很多的靶组织细胞，这些被伤害的组织细胞产生的代谢紊乱产物又汇集到肝脏，可选取肝脏作为环境胁迫监测的靶组织；3）本发明用通过监测厚壳贻贝体内mt含量变化，可从分子水平上预测其受重金属暴露的状况和重金属的污染压力，特异性强，mt基因的表达量与生物体内重金属浓度具有明显的正相关性，为厚壳贻贝的大规模健康养殖及正确运用贝类mt分子作为养殖水体环境污染预警标记提供指导。

附图说明

图1为本发明实施例1中厚壳贻贝mt基因的orf序列；

图2为本发明实施例1中厚壳贻贝mt基因氨基酸序列同源性比对；

图3为本发明实施例1中厚壳贻贝mt基因与其他物种mt基因之间的进化分析；

图4为本发明实施例3中厚壳贻贝mt基因的差异性表达图；

图5为本发明实施例4中cu²⁺胁迫下mt的相对表达量图；

图6为本发明实施例4中pb²⁺胁迫下mt的相对表达量图。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明方案作进一步说明：

实施例1：

厚壳贻贝金属硫蛋白基因，采用基因克隆技术获得，基因的核苷酸序列为seqidno.7，序列全长位314bp。金属硫蛋白mt是一类普遍存在于生物体内的低分子量、富含半胱氨酸、热稳定性、可诱导型非酶蛋白，具有稳定调节细胞内金属水平，参与生物体内必须金属元素的调节和非必需金属的解毒功能。

上述基因克隆包括如下步骤：

1）总rna的提取：

a)取干净的1.5ml离心管（rnaasefree），用无rnaase枪头加入500μltrizol(4℃)，用depc处理过的镊子夹取约30mg肝组织样浸入trizol，使用电动匀浆机器匀浆30s，补加500μltrizol；

b)轻轻摇晃离心管，使组织充分溶解到trizol中，室温静置5分钟；

c)在离心管中加入200μl的氯仿，剧烈震荡15s后，室温静置5分钟；

d)4℃、12000rpm离心15min，离心后，离心管内分为3层，取最上层的上清液于新离心管中；

e)向离心管中加500μl的异丙醇，摇匀，室温静置10分钟；

f)离心机中4℃、12000rpm离心10min，离心后，除去上清液，保留沉淀；

g)加入1ml的75%的乙醇，用枪头吹吸沉淀；

h)离心机中4℃、7500rpm离心5min，用枪头吸除液体部分，保留沉淀；

i)室温静置约20分钟待rna呈半干的透明状态，用depc水溶解后备用（按析出沉淀质量大小加入适量的depc水）。

提取的总rna必须要测定其吸光度r值，一般r值在1.8-2.0之间说明提取出的rna为有效的总rna，可以继续为后续实验使用，如果小于1.8则表明提取出的rna含有较多的杂质，会影响实验的准确性，所以不能使用；如果r值大于2.0则说明提取出来的rna已经降解，也不能使用；本实施例测定完其吸光度值之后吸光度值在1.8-2.0之间，说明提取出的rna可能有效，继续进行电泳检测，取3μl的rna液将其点样到1%的琼脂糖凝胶上，在200v，150ma的电泳仪下跑胶15min，取出胶在uvp紫外凝胶成像中分析rna条带情况，如果能够看到一条清晰的28s、18s且比例约为2:1，则说明提取出的rna效果很好可以满足进一步实验的需求；

2）cdna第一条链的合成：

a)0.2ml离心管中加入以下反应体系：

总rna5.0μl

oligodt1.0μl；

b)混匀反应体系，离心，将离心管置于pcr仪内，70℃孵育10min后立刻冰上静置2min；

c)在上述离心管中加入以下反应体系：

depc处理水1.0μl

dntpmixture(10mm)0.5μl

5×m-mlvbuffer2.0μl

rnaaseinhibitor(40u/μl)0.25μl

m-mlvrtase(200u/μl)0.25μl；

d)混匀反应体系，离心，将离心管置于pcr仪内，42℃孵育1h，70℃孵育15min后，迅速冰上静置15min；

e)将合成的cdna置于-20℃冰箱保存备用。

3）厚壳贻贝mt核心序列的扩增：

根据已发表贝类的mt基因序列设计引物，以肝脏cdna为模板，pcr扩增厚壳贻贝mt基因核心序列；

pcr扩增反应体系：20μl反应体系，ddh2o14.4μl，10×pcrbuffer2μl，模板cdna0.8μl，dntps0.8μl，mt-f0.8μl，mt-r0.8μl，taqdna聚合酶（takara）0.4μl。

pcr反应条件：94℃预变性4min，94℃变性1min，59.4℃退火30s，72℃延伸1min，循环30次；72℃延伸10min。

以1.5%琼脂糖电泳检测pcr产物，以dl2000marker为标记，选取预期大小条带，以琼脂糖胶纯化试剂盒（tiangen，china）纯化后送上海生工直接测序，结果如图1所示，图中代表起始密码子，*代表终止密码子，可发现通过pcr扩增技术获得mt全长序列为314bp，其中核心片段222bp，编码73个氨基酸，在线预测其分子量为7.21kda，等电点为7.75，进一步通过blastp比对发现，目标分子与其他贝类mt基因相似度达90%，与贻贝属紫贻贝的相似度最高；

4）序列信息分析：

将测序获得的orf序列以blastp（http://www.ncbi.nlm.gov/blast/）进行序列同源性比对，expasy-protparam（http://www.expasy.org/tools/protparam.html）推测蛋白的理论分子量和等电点；应用clustalw软件对基因氨基酸序列进行同源比对(http://www.genome.jp/tools/clustalw/)，如图2所示，结果显示厚壳贻贝mt基因与紫贻贝（mytilusedulis，caa07546.1）的相似性最高（75.82%），与bathymodiolusazoricus(caf34421.1)相似度为74.73%；与mytilusgalloprovincialis(adv56674.1)相似度为54.95%。同时采用mega5程序，以邻位相连法（neighbor-joining）构建进化树，设定bootstrap值为1000，结果显示厚壳贻贝先与同属于双壳类的紫贻贝亲缘关系最近，并与其他扇贝等双壳类软体动物亲缘性较近（如图3）。

其中，扩增用引物为：

mt-f：5'-atgsctgttccttgtaacccaaty-3'；

mt-r：5'-tcacacgcaggaatancctggtkc-3'。

上述基因的核心片段为222bp，编码73个氨基酸，分子量为7.21kda，等电点为7.75。克隆获得厚壳贻贝mt分子cdna核心序列的分子量为7.21kd，与其他贝类相近，氨基酸序列与多种贝类同源性均较高（90%以上），同时本发明得到厚壳贻贝金属硫蛋白基因表达的氨基酸序列中富含半胱氨酸(cys)达18.9%，cys是金属结合位点，其巯基能共价结合金属离子，cys富集也是软体动物mts的重要特征之一，因此认为所得到的序列为厚壳贻贝mt分子。

上述金属硫蛋白基因在肝脏中的表达水平量最高。厚壳贻贝mt基因在肝脏中表达量中最高，而肝脏表达比较稳定，并且肝脏是软体动物体内主要的解毒器官，其中大量能做变形运动的（肝）巨噬细胞有活跃的吞噬能力，毒物在肝脏内通过氧化、还原或水解过程转化成无毒、低毒易溶的代谢物排出体外，在该过程中会产生大量的超氧阴离子自由基，另外，当重金属污染胁迫时，重金属离子由鳃进入血液作用到很多的靶组织细胞，这些被伤害的组织细胞产生的代谢紊乱产物又汇集到肝脏，所以可选取肝脏作为环境胁迫监测的靶组织。

厚壳贻贝金属硫蛋白基因在海洋重金属污染监测中的应用，厚壳贻贝金属硫蛋白基因在监测海洋重金属污染的应用。金属硫蛋白具有维持厚壳贻贝体内金属含量动态平衡和重金属解毒作用双重机制，在转录水平上易被环境中的重金属所诱导，而且这种诱导与重金属浓度具有相关性，可以反映环境中的重金属含量水平，因此，通过监测厚壳贻贝体内mt含量变化，可从分子水平上预测其受重金属暴露的状况和重金属的污染压力，特异性强，为厚壳贻贝的大规模健康养殖及正确运用贝类mt分子作为养殖水体环境污染预警标记提供指导。

金属硫蛋白酶基因监测海洋重金属污染的方法为：

1）提取受到重金属污染厚壳贻贝肝脏中的rna；

2）cdna合成；

3）用荧光定量技术检测金属硫蛋白酶在肝脏中的相对表达量，即可。在生物体遭受重金属暴露后，mt被认为是最先参与重金属解毒和代谢的生物大分子，mt基因的表达量与生物体内重金属浓度具有明显的正相关性。

上述荧光定量技术所需引物为：

qmt-f：5'-atgcctgcaccttgtaactg-3'；

qmt-r：5'-ggtcccgtacatcctcctt-3'；

β-actin-f：5'-atgaaaccacctacaacagt-3'；

β-actin-r：5'-tagacccaccaatccagacg-3'。

实施例2：

厚壳贻贝金属硫蛋白基因，采用基因克隆技术获得，的进一步优化方案为：

总rna提取采用trizolregent、磷酸胍和硫脲进行提取，trizolregent中含有0.03%磷酸胍和0.01%硫脲。trizolregent、磷酸胍和硫脲能够发挥增益作用，一方面可迅速渗入组织，灭活内源rna酶，不会引起rna的降解，便于rna的后续提取，并且具有极强的裂解能力，可在短时间内裂解细胞和组织样本，能够使细胞释放出的蛋白质迅速发生变性并抑制细胞释放出的rna酶活性，有效抑制样本中rna的降解，保持rna的完整性；另一方面协助变性的蛋白质等物质溶解于后续加入的氯仿，使得rna能快速分布在上层水相中，提高总rna的得率和纯度。

实施例3：

厚壳贻贝mt基因组织特异性表达分析

具体步骤为：

1）不同组织总rna提取：

随机选取3只厚壳贻贝，提取其肝脏、外套膜、血清、闭壳肌、鳃、性腺6种组织，提取rna，为厚壳贻贝做组织特异性实验做准备，按takala公司的trizoltotalrna提取试剂盒推荐方法进行，获得的总rna以1.5%非变形琼脂糖凝胶电泳检测，并置于紫外分光光度计（bio-rad，usa）下检测其浓度及a260/a280值；

2）cdna模板合成

使用takara公司生产的m-mlv（rnaaseh^-）反转录试剂盒，将采集的各组织总rna反转录成cdna，一次反转3份，完成后置于-80℃超低温冰箱保存，再使用美国thermo公司生产的nanodrop2000型核酸蛋白检测仪对cdna浓度和质量进行测定，用灭菌水将不同组织的cdna均稀释至50ng/μl；

3）组织特异性分布表达：

根据已获得的厚壳贻贝mt基因测序结果，使用primer5.0软件设计mt基因荧光定量pcr所需引物，筛选出能特异扩增厚壳贻贝mt基因的引物，采用荧光定量pcr法，以β-actin为内参，分析cat基因在各组织（肝脏、外套膜、血清、闭壳肌、鳃、性腺）中的差异表达以及重金属应激下的基因表达情况，20μlpcr扩增反应体系：ddh2o7.2μl，2×sybr®premixextaqtmⅱ（takara）10μl，primer-f0.8μl，primer-r0.8μl，cdnasample（100ng/μl）0.8μl，roxii0.4μl。反应采用两步法进行（abi-7500型荧光定量pcr仪），即95℃预变性1min，95°c变性10s，65℃延伸45s，共40个循环，反应结束后，温度从55℃缓慢升到95℃，制备熔解曲线。实验设置无模板对照和阴性对照，每个反应3个重复，其中mt基因荧光定量pcr实验中使用的引物为：

qmt-f：5'-atgcctgcaccttgtaactg-3'；

qmt-r：5'-ggtcccgtacatcctcctt-3'；

β-actin-f：5'-atgaaaccacctacaacagt-3'；

β-actin-r：5'-tagacccaccaatccagacg-3'。

4）数据分析：

标准曲线，ct值等由abi7500realtimepcr仪自带的abi7500realtimepcrsystemdetection软件自带完成。所有基因的相对表达量按照2^-△△ct的方法计算，利用spss13.0进行单因子显著性差异分析（anova），分别标记显著差异（p＜0.05）和特别显著性差异（p＜0.05），使用excel2010软件，进行数据的统计和分析，使用软件sigmaplotⅰ2.5来制作相关柱形图，如图4，可看出厚壳贻贝mt在所有检测的肝脏、外套膜、血清、闭壳肌、鳃、性腺这6种组织中均有表达，其中在肝脏中的表达水平量最高。

实施例4：

厚壳贻贝mt基因在重金属胁迫后的表达分析

实验材料

（1）实验动物

实验所用的厚壳贻贝成贝采购于舟山南珍市场，在实验室暂养两天后进行实验，养殖密度为40个/21l，期间持续充氧。每日投喂1次螺旋藻粉，每24h换水1/2（在晚上投喂饲料前），实验海水为人工配置盐度为30‰的海水。实验期间每天换水一次，同时添加相应浓度的重金属污染物，使各组水体中重金属浓度保持设定浓度。每组放置厚壳贻贝40只，在设计的重金属下连续暴露15天，于第0、1、3、5、7、10、15天分别取样，每组取体型大小相近的3只取样。

（2）实验试剂

cuso4•5h2o配置成150mg/ml的cuso4母液，pb（no3）2配置为30mg/ml的pb（no3）2母液。根据双壳类相近物种近江牡蛎，设置重金属质量浓度，两种重金属分别设置低、中、高质量浓度组（cu²⁺：0.1、0.5、1.5mg/l；pb²⁺：0.2、1.0、3.0mg/l）。

具体步骤为：

1）总rna提取：

选取肝脏组织作为实验组织，按trizoltotalrna试剂盒（takara，china）推荐方法提取总rna，获得的总rna以1.5%非变形琼脂糖凝胶电泳检测，并置于紫外分光光度计（bio-rad，usa）下检测其浓度及a260/a280值；

2）cdna合成：

按照m-mlvrtasecdnasynthesiskit试剂盒（takara，china）推荐方法对rna进行反转录，获得相应cdna，一次反转3份，完成后置于-80℃超低温冰箱保存，使用美国thermo公司生产的nanodrop2000型核酸蛋白检测仪对cdna浓度和质量进行测定，用灭菌水将不同组织的cdna均稀释至50ng/μl；

3）荧光定量pcr与数据处理

根据所有厚壳贻贝mt基因的组织差异性表达结果，以相同的的荧光定量pcr引物，各自选取最高的表达组织，采用qrt-pcr法（同样以厚壳贻贝β-actin作为内参），分析mt基因在受到重金属铜和铅的胁迫后0、1、3、5、7、10、15天的差异表达情况，该实验的反应体系与组织差异性表达一致，每次反应都设置阴性对照和无模板对照，每个反应3个重复孔，所有基因的相对表达量按照2^-△△ct的方法计算，以spss13.0进行单因子显著性差异分析（anova），如图5和图6所示，可发现在cu²⁺胁迫下，肝脏中mt基因表达呈明显的时间依赖型效应，其各组表达量随着时间的延长逐渐升高，到5d时，低、高浓度（0.1mg/l和1.5mg/l）组达到最高，最高表达量分别为对照组16倍、37倍，中浓度（0.5mg/l）组在7d时达到最高，最高表达量为对照组42倍，其中中、高浓度组变化最为明显，随后逐渐下降，到15d已基本恢复到原始水平；在pb²⁺胁迫下，低浓度组（0.2mg/l）mt基因的表达先升高，在3d时达到最高，最高表达量分别为对照组2.5倍，到7d后才逐渐降低，中浓度组（1.0mg/l）表现为先升高后降低，在7d达到峰值，最高表达量为对照组88倍，随后下降。高浓度组（3.0mg/）变化明显，在3d即达到峰值，最高表达量为对照组40倍，随后降低到略高于空白组；上述结果说明，mt基因参与了重金属的解毒过程，但是对不同的重金属mt基因的解毒作用稍有不同。

本发明操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知，在此不进行赘述。

以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>浙江海洋大学

<120>厚壳贻贝金属硫蛋白基因在海洋重金属污染监测中的应用

<160>6

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>24

<212>dna

<213>引物(artificialsequence)

<400>1

atgsctgttccttgtaacccaaty24

<210>2

<211>24

<212>dna

<213>引物(artificialsequence)

<400>2

tcacacgcaggaatancctggtkc24

<210>3

<211>20

<212>dna

<213>引物(artificialsequence)

<400>3

atgcctgcaccttgtaactg20

<210>4

<211>19

<212>dna

<213>引物(artificialsequence)

<400>4

ggtcccgtacatcctcctt19

<210>5

<211>20

<212>dna

<213>引物(artificialsequence)

<400>5

atgaaaccacctacaacagt20

<210>6

<211>20

<212>dna

<213>引物(artificialsequence)

<400>6

tagacccaccaatccagacg20

<210>7

<211>314

<212>dna

<213>mytiluscoruscus

<400>7

tctacacgatgcaatccacattdatgcctgcaccttgtaactgcatcgaaacaaatgttt60

gtatctgtgacactgggtgcagcggtcagggttgtcgctgtggtgacgcttgcaagtgtt120

cgggcgatgactgtaaatgttctggatgtaaagtagtttgcaagtgttcaggtacttgtg180

cgtgtgaaggaggatgtacgggacctaaaacgtgtaaatgtgcccccggctgccctgcaa240

gtgaattatgtattaggacttacagaactgcatcaataaagtccaactaaaaaaaaaaaa300

aaaaaaaaaaaaaa