使用单分子多次通过纳米孔达到精密测序的基因测序仪的制作方法

本发明涉及dna测序领域，具体涉及一种使用多分子多次通过纳米孔达到精密测序的基因测序仪。

背景技术：

dna(deoxyribonucleicacid，脱氧核糖核酸)序列是生命的蓝图，蕴含着整个生物体的遗传信息。快速准确的解读这些遗传信息对生命科学的进步和生物环境的发展具有重要的意义。然而生物体的基因多样性高、容量巨大，要正确解读生物体的遗传信息就需要快速、精准的dna探测技术。近年来，单分子检测已发展为令人瞩目的研究领域，其中纳米孔单分子检测技术是一种新型的单分子检测技术，这种检测方法十分简单却很可靠，不需对分子预先做标记或固定，只要有一个待测分子就可提供一个可观的电流信号，检测灵敏度达到了化学分析的理想极限。目前纳米孔检测技术已被广泛应用于dna测序、疾病检测、药物筛选和环境监测领域。

中国发明专利cn102099668b为了更快地提供更多的定序信息，公开了一种纳米孔装置，说明书中具体公开了“结合第一和第二室描述了本发明，但本发明不限于两个室，因为可存在经由第三、第四、第五或第n个纳米孔(所有的纳米孔均受到相同的电势)连接到输入室的第三、第四、第五或第n个室”。中国实用新型专利cn207318400u公开了提出一种噪音影响小、检测灵敏度高、检测时间短、待检测物穿孔速度低的双层纳米孔装置，具体公开了“所述装置包括由顶部至底部顺次连通的第一腔室、第二腔室和第三腔室，所述第一腔室与所述第二腔室由第一纳米孔道连通，所述第二腔室与所述第三腔室由第二纳米孔道连通，所述第一纳米孔道为固态纳米孔道，所述第二纳米孔道为生物纳米孔道。”

以pacificbiosciences和oxfordnanopores为代表，可以将测序长度增加到超过10k，测序时间降低到2小时之内，具有巨大的意义。但其方法最大的问题，是其精确度太低。目前的标准，比如oxfordnanopores的序列质量，可以达到85％。距离第二代测序仪的序列平均质量q30(出错率1/1000)有很大的差距。该测序仪，只能用于确定细菌、病毒、病原体的身份，也可以用来加速基因组测序的组装。但不能作为序列报告变异的依据，尤其不能在癌症变异的序列中发现这些变异。因此开发一台高效和低成本的dna测序仪是实现精准化生命科学研究和生物医药发展创新的必由之路，方可真正实现dna测序广泛的应用价值。

技术实现要素：

为解决现有技术中纳米孔测序仪精度较低的问题，本发明提供了一种使用单分子多次通过纳米孔达到精密测序的基因测序仪，大大提升了dna序列的测序质量，具体技术方案如下：

一种使用单分子多次通过纳米孔达到精密测序的基因测序仪，所述仪器包括纳米孔测序系统、数据采集分析系统和中央控制系统；纳米孔测序系统实现单个碱基的识别；数据采集分析系统对纳米孔中的离子电流信息进行数据采集，并进行实时地数据处理和分析，测量出长链dna的序列；中央控制系统通过反馈控制系统电路对各个系统进行实时控制，确保各个系统在亚微秒的同步时间下进行协同工作。

具体地，所述纳米孔测序系统包括在水溶液中设置纳米孔和被嵌入纳米孔的脂肪膜；所述脂肪膜两侧设置有用于施加电压的电极；所述脂肪膜的一侧称为a室，另一侧称为b室；所述数据采集系统将多次收集到的电流信号信息进行综合分析，得到去除噪音后的精确测序数据。

根据所述的测序仪可通过以下步骤进行测序：

(1)将待测dna序列和多核苷酸结合蛋白加入到所述纳米孔测序系统的a室中，所述多核苷酸结合蛋白附着在待测dna序列的一端形成待测dna序列的前导段；

(2)通过中央控制系统，所述待测dna序列的前导段在外电场的作用下被纳米孔捕获，进而穿过纳米孔，同时数据采集系统开始采集待测dna序列产生的电流信号信息；

(3)一次测序结束后，由中央控制系统发出指令停止测序或者从新开始测序。

具体地，所述步骤(1)中多核苷酸结合蛋白包括解旋酶或聚合酶。

具体地，所述步骤(1)中，待测dna序列的一端含有胆固醇标记的退火引物；所述胆固醇标记附着在脂肪膜表面，能够丰富脂肪膜表面的基质。

所述步骤(2)中还包括(由于金属二价离子和ntp底物的作用，)所述多核苷酸结合蛋白沿着待测dna序列移动，能够促进待测dna序列缓慢通过纳米孔；所述待测dna序列完全穿过纳米孔后与多核苷酸结合蛋白脱离。

优选地，所述步骤(1)中，将待测dna序列添加barcode，再将带有barcode的待测dna序列加入到所述纳米孔测序系统的a室中。

优选地，所述步骤(1)中，将待测dna序列添加barcode后线性放大成多个串联的相同dna序列，再将放大后的待测dna序列加入到所述纳米孔测序系统的a室中。

优选地，所述步骤(2)中的纳米孔为纳米孔阵列，所述纳米孔阵列为生物纳米孔和/或固体纳米孔；所述生物纳米孔包括α-hemolysin(αhl)、mspa和phi29；所述固态纳米孔包括石墨烯、氮化硅、二氧化硅、氮化硼和二硫化钼。

所述纳米孔检测系统中纳米孔是双向可流动的，所述多核苷酸结合蛋白加入到a室和b室中，所述b室中的多核苷酸结合蛋白附着在经过一次测序后进入b室的待测dna序列的一端形成待测dna序列的前导端，在外电场的作用下待测dna序列由纳米孔从b室进入a室。

优选地，所述待测dna序列区别于附着有多核苷酸结合蛋白的前导端的另一端连接直径大于纳米孔的分子基团，所述分子基团为纳米级别的蛋白、多肽分子、多糖或具有2级结构的dna序列。

优选地，所述脂肪膜中嵌入多个垂直设置的纳米孔阵列。

本发明具有以下有益效果：

一、数据采集分析系统中通过算法可以去除噪音，最终达到需求的精度序列。

二、对添加barcode后的dna序列进行线性放大成多个串联的相同序列，可以将来自于同一个barcode的序列信号合并。从而达到提升精度的目标。

三、对于现有的测序仪几乎不需要做多少改进就可以进行，节约测序成本。

四、使用垂直设置的纳米孔阵列，形成一个三维的结构。因为不同的纳米孔对于不同的序列具有不同的分辨能力，将采集的信号综合一起可以高效地实现高分辨率的目标。

五、采用可双向流动的纳米孔，使待测dna序列不仅可以从a室进入b室，也可以反过来，从b室进入a室，只需通过改变电压，就可多次获得待测dna序列的电流信号。

附图说明

图1为本发明中各系统连接图

具体实施例

实施例1

一种使用单分子多次通过纳米孔达到精密测序的基因测序仪，所述仪器包括αhl纳米孔测序系统、数据采集分析系统和中央控制系统；纳米孔测序系统实现单个碱基的识别；数据采集分析系统对αhl纳米孔中的离子电流信息进行数据采集，并进行实时地数据处理和分析，测量出长链dna的序列；中央控制系统通过反馈控制系统电路对各个系统进行实时控制，确保各个系统在亚微秒的同步时间下进行协同工作。

具体地，所述αhl纳米孔测序系统包括在水溶液中设置αhl纳米孔和被嵌入纳米孔的脂肪膜；所述水溶液中盐浓度范围为0.3m-1m；所述脂肪膜两侧设置有用于施加电压的电极；所述脂肪膜的一侧称为a室，另一侧称为b室；所述数据采集系统将多次收集到的电流信号信息进行综合分析，得到去除噪音后的精确测序数据。

根据所述的测序仪可通过以下步骤进行测序：

(1)将待测dna序列和多核苷酸结合蛋白加入到所述αhl纳米孔测序系统的a室中，所述待测dna序列的一端含有胆固醇标记的退火引物；所述胆固醇标记附着在脂肪膜表面，能够丰富脂肪膜表面的基质；所述多核苷酸结合蛋白附着在待测dna序列的一端形成待测dna序列的前导段，所述多核苷酸结合蛋白包括解旋酶或聚合酶；

(2)通过中央控制系统，所述待测dna序列的前导段在外电场的作用下被αhl纳米孔捕获，进而穿过αhl纳米孔，同时数据采集系统开始采集待测dna序列产生的电流信号信息；由于金属二价离子和ntp底物的作用，所述多核苷酸结合蛋白沿着待测dna序列移动，能够促进待测dna序列缓慢通过αhl纳米孔；所述待测dna序列完全穿过纳米孔后与多核苷酸结合蛋白脱离；

(3)一次测序结束后，由中央控制系统发出指令停止测序或者从新开始测序。

实施例2

与实施例1相比，该实施例的区别在于，所述纳米孔测序系统为石墨烯纳米孔测序系统以及所述步骤(1)中，将待测dna序列添加barcode，再将带有barcode的待测dna序列加入到所述纳米孔测序系统的a室中。

实施例3

与实施例1相比，该实施例的区别在于，所述纳米孔测序系统为石墨烯纳米孔测序系统以及所述步骤(1)中，将待测dna序列添加barcode后线性放大成多个串联的相同dna序列，再将线性放大后的dna序列加入到所述纳米孔测序系统的a室中。

实施例4

与实施例1-3相比，该实施例的区别在于，所述纳米孔检测系统中纳米孔是双向可流动的，所述多核苷酸结合蛋白加入到a室和b室中，所述b室中的多核苷酸结合蛋白附着在经过一次测序后进入b室的待测dna序列的一端形成待测dna序列的前导端，在外电场的作用下待测dna序列由纳米孔从b室进入a室。将该实施例中的过程重复多次后，可以得到同一条待测dna序列的多次电流信号信息，经数据采集系统进行去噪处理后得到最终的精确序列数据。

实施例5

与实施例4相比，该实施例的区别在于，所述待测dna序列区别于附着有多核苷酸结合蛋白的前导端的另一端连接直径大于纳米孔的分子基团，所述分子基团为纳米级别的蛋白、多肽分子、多糖或具有2级结构的dna序列。所述分子基团可以与待测dna序列之间有一定长度的链接序列。该分子基团能够阻挡待测dna序列从a室完全进入b室，在改变电压方向后，可以实现所述待测dna序列在同一个纳米孔中多次测序。

实施例6

与实施例1-4相比，该实施例的区别在于，所述脂肪膜中嵌入多个垂直设置的纳米孔阵列，形成多个层次的纳米孔阵列。一个dna序列按照这个阵列，从第一层的纳米孔穿过，再从第二层的纳米孔穿过，再从第三层的纳米孔穿过。这样，可以快速地获得同一段dna序列通过不同纳米孔的电流信号。在提升纳米孔测序的精度的同时，达到使用的测序时间不会太长。

上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。