一种高通量测定抗衰老的方法与流程

本发明属于免疫学领域，主要涉及一种高通量测定抗衰老的方法。

背景技术：

卡路里限制(cr)是指一种营养俱全，但是含能较低的营养条件，在后续的生物研究中证实cr均有延缓衰老和延长寿命的效应。研究表明cr已经被发现用于延长从酵母到灵长类动物的平均寿命和最长寿命，并且还可以延缓癌症等多种年龄相关疾病，这预示着cr在人类寿命延长过程中也可能有重要作用。

酵母是最常见的一种微生物，具有基因组小、遗传操作简单、易培养等优点。并且与许多动植物存在相似的生理生化机制，因此在现代分子和细胞生物学中，作为一种模式生物倍广泛应用。酵母的衰老模型与人类的衰老模型间具有高度的保守性和相似性，因此，是一种适宜的衰老研究模型。在衰老研究方面由于哺乳动物寿命长而耗时，无脊椎动物有机体作为模型的使用对于遗传和环境操纵来说更加快速和简单，大多数研究都使用了果蝇，蠕虫或酵母。但是芽殖酵母具有更短的寿命，可以普遍适用于高通量筛选。

在酵母模型中已经建立了两种常见的老化测定：酵母老化的复制寿命(rls)和时间寿命(cls)，这两种老化模式是相关联的。它们可以比较增殖细胞和非增殖细胞的衰老过程，对于影响长寿的遗传因素也提供了大量信息。然而，它们受限于繁琐的常规测定。最近开发了一种测量cls的高通量方法——hts测定法，它用于测量正常和cr条件下出芽酵母的cls。本方法的优点是可以同时培养生长和定量cls的高容量，经过充分研究和商业化获得的野生型菌株，通过使用组合振荡器与培养箱监测光密度，基于测量营养丰富的液体培养基中老化细胞的生长来量化存活率。本发明根据该方法提供一种高通量测定抗衰老，具有高通量筛选(hts)测定以及定量测量数百个独立老化培养物的cls，具有高灵敏度、运行时间短、可量化数据和数据分析简单的特点。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种高通量测定抗衰老的方法，达到全方位，快速高效测定抗衰老的目的。

本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的：

1、一种高通量测定抗衰老的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

(1)制备老化培养物，将冷冻的酵母菌株原种取出，转移到ypd培养基上；

(2)将培养基在一定的温度条件下温育2天，直到菌落出现，随后挑取单个菌落，接种到5ml小瓶中，瓶内含有一定体积的ypd液体培养基，并放入恒温振荡培养箱中，在适宜的条件下培养2天；

(3)用高压灭菌水将温育2天的培养物进行稀释处理，并在4℃冰箱中储存至少24h；

(4)4℃温育24h之后，将一定体积的稀释培养物转移到1.0mlsd培养基中，在适宜的条件下连续搅拌2周或更长的时间；

(5)在sd培养基中培养2天后，细胞达到稳定期，并且迎来第一次年龄点，每2-4天增长一次年龄点；

(6)到达每个年龄点时，在96孔微孔板中加入一定体积的混合培养物。并加入一定体积的ypd培养液，用酶标仪在660nm处，每5min或10min检测一次细胞群的吸光值(od值)，持续时间为12-24h。

2、根据权利要求1所述的一种高通量测定抗衰老的方法，其特征在于，步骤(1)所述的ypd培养基的配方为1-2％酵母提取物，2-3％蛋白胨，2-3％葡萄糖。

3、根据权利要求1所述的一种高通量测定抗衰老的方法，其特征在于，步骤(2)所述的温育条件为28-30℃，ypd的体积为1-1.5ml，在恒温振荡培养箱中培养的温度条件为28-30℃，转速为180-200rpm。

4、根据权利要求1所述的一种高通量测定抗衰老的方法，其特征在于，步骤(3)所述的稀释处理的倍数为8-10倍。

5、根据权利要求1所述的一种高通量测定抗衰老的方法，其特征在于，步骤(4)所述的sd培养基的成分为：葡萄糖18-22g/l，酵母氮碱1.7-1.9g/l，硫酸铵4-5g/l，腺嘌呤70-80mg/l，尿嘧啶100-110mg/l，l-精氨酸30-40mg/l，l-天冬氨酸100-110mg/l，l-谷氨酸100-110mg/l，l-组氨酸100-110mg/l，l-亮氨酸300-310mg/l，l-赖氨酸140-150mg/l，l-蛋氨酸80-90mg/l，l-苯丙氨酸50-60mg/l，l-丝氨酸400-410mg/l，l-苏氨酸200-210mg/l，l-酪氨酸40-50mg/l，l-缬氨酸150-160mg/l；稀释培养物的体积为3-5μl，培养条件为30-35℃，转速180-240rpm。

6、根据权利要求1所述的一种高通量测定抗衰老的方法，其特征在于，步骤(6)所述的向96孔板中加入的混合培养物体积为3.0-5.0μl，ypd培养液体积为100-110μl。

一种高通量测定抗衰老的方法属于免疫学领域，该方法包括以下步骤：以酵母作为衰老模型，结合使用振荡器，培养箱和酶标仪等仪器，在660nm处检测吸光度，来测量液体培养基中老化细胞的生长，从而量化存活率。根据酵母时间老化模型开发了高通量筛选技术，这一种新型的高通量筛选抗衰老的方法，可以自动高效的提供可量化数据，具有高灵敏度、运行时间短、可量化数据和数据分析简单的特点。

附图说明

附图为本工艺技术路线图。

具体实施方式

实施例1：

(1)制备老化培养物，ypd培养基的配方为1-2％酵母提取物，2-3％蛋白胨，2-3％葡萄糖，将冷冻的酵母菌株原种取出，转移到ypd培养基上；

(2)将培养基在温育条件为28-30℃下温育2天，直到菌落出现，随后挑取单个菌落，接种到5ml小瓶中，瓶内含有1-1.5ml体积的ypd液体培养基，并放入恒温振荡培养箱中，在28-30℃，转速为180-200rpm的条件下培养2天；

(3)用高压灭菌水将温育2天的培养物进行稀释处理，稀释倍数为8倍，并在4℃冰箱中储存至少24h；

(4)于4℃温育24h之后，将3-5μl的稀释培养物转移到1.0mlsd培养基中，在30-35℃，转速为180-240rpm的条件下连续搅拌2周或更长的时间；

(5)在sd培养基中培养2天后，细胞达到稳定期，并且迎来第一次年龄点，每2-4天增长一次年龄点；

(6)到达每个年龄点时，在96孔微孔板中加入3.0-5.0μl的混合培养物，并加入100-110μl的ypd培养液，用酶标仪在660nm处，每5min或10min检测一次细胞群的吸光值(od值)，持续时间为12-24h。

实施例2：

(1)制备老化培养物，ypd培养基的配方为1-2％酵母提取物，2-3％蛋白胨，2-3％葡萄糖，将冷冻的酵母菌株原种取出，转移到ypd培养基上；

(2)将培养基在温育条件为28-30℃下温育2天，直到菌落出现，随后挑取单个菌落，接种到5ml小瓶中，瓶内含有1-1.5ml体积的ypd液体培养基，并放入恒温振荡培养箱中，在28-30℃，转速为180-200rpm的条件下培养2天；

(3)用高压灭菌水将温育2天的培养物进行稀释处理，稀释倍数为9倍，并在4℃冰箱中储存至少24h；

(4)于4℃温育24h之后，将3-5μl的稀释培养物转移到1.0mlsd培养基中，在30-35℃，转速为180-240rpm的条件下连续搅拌2周或更长的时间；

(5)在sd培养基中培养2天后，细胞达到稳定期，并且迎来第一次年龄点，每2-4天增长一次年龄点；

(6)到达每个年龄点时，在96孔微孔板中加入3.0-5.0μl的混合培养物，并加入100-110μl的ypd培养液，用酶标仪在660nm处，每5min或10min检测一次细胞群的吸光值(od值)，持续时间为12-24h。

实施例3：

(1)制备老化培养物，ypd培养基的配方为1-2％酵母提取物，2-3％蛋白胨，2-3％葡萄糖，将冷冻的酵母菌株原种取出，转移到ypd培养基上；

(2)将培养基在温育条件为28-30℃下温育2天，直到菌落出现，随后挑取单个菌落，接种到5ml小瓶中，瓶内含有1-1.5ml体积的ypd液体培养基，并放入恒温振荡培养箱中，在28-30℃，转速为180-200rpm的条件下培养2天；

(3)用高压灭菌水将温育2天的培养物进行稀释处理，稀释倍数为10倍，并在4℃冰箱中储存至少24h；

(4)于4℃温育24h之后，将3-5μl的稀释培养物转移到1.0mlsd培养基中，在30-35℃，转速为180-240rpm的条件下连续搅拌2周或更长的时间；

(5)在sd培养基中培养2天后，细胞达到稳定期，并且迎来第一次年龄点，每2-4天增长一次年龄点；

(6)到达每个年龄点时，在96孔微孔板中加入3.0-5.0μl的混合培养物，并加入100-110μl的ypd培养液，用酶标仪在660nm处，每5min或10min检测一次细胞群的吸光值(od值)，持续时间为12-24h。