敲除phoP基因的地衣芽胞杆菌菌株及构建方法和应用与流程

本发明涉及地衣芽孢杆菌菌株改造领域，尤其是一种敲除phop基因的地衣芽胞杆菌菌株及其构建方法和应用。

背景技术：

地衣芽胞杆菌是公认的具有生物安全性（gras）的重要工业微生物菌株，其广泛存在于自然界中。由于地衣芽胞杆菌遗传背景清晰，工业应用价值高等特点，因此其近年来被广泛研究。目前，地衣芽胞杆菌主要用于发酵生产聚γ-谷氨酸、杆菌肽、乙偶姻、2,3-丁二醇、地衣素等生物化工产品。

杆菌肽又名枯草菌素，是由12种氨基酸组成的一种不稳定多肽。其可以抑制或杀灭某些致病菌，强烈抑制革兰氏阴性菌，并与其它抗生素如青霉素、庆大霉素等具有协同效应。

地衣芽胞杆菌中存在着众多与菌株代谢产物的合成息息相关的基因，而，杆菌肽的产量与何种基因相关仍然是个未知数，通过何种基因改造的方式得到高产杆菌肽的工程菌也有待进一步的研究。

转录因子phop是原核生物中广泛存在的全局性转录调控因子。现有研究结果表明，phop不仅可以直接调控磷代谢相关基因（phop、phoa、phob、phoc、psts、phou、phod等）的表达，其还对氮代谢转录因子及基因（glnr、urea、nrga、gltb、gltp、glna、glnii）、细胞分化相关转录因子及基因（sige、sigu、chpc、blda、bldc、bldd、bldk、bldm）、磷壁酸合成相关基因（taua、taga和tagd）及抗生素（阿维菌素、匹马霉素、链霉素、土霉素、头孢菌素c等）的合成均具有调节作用。此外，细胞内的氧化磷酸化、硝酸盐呼吸、铁代谢、氧化应激、淀粉水解等途径相关基因也都受到phop的直接调控。

地衣芽胞杆菌中存在着众多与菌株代谢产物的合成息息相关的基因，而，杆菌肽的产量与何种基因相关仍然是个未知数，通过何种基因改造的方式得到高产杆菌肽的工程菌也有待进一步的研究。

技术实现要素：

本发明的目的之一在于提供一种敲除碳代谢转录因子phop的基因—phop的地衣芽胞杆菌菌株的构建方法，成功得到缺失了phop基因的地衣芽胞杆菌菌株。

敲除phop的地衣芽胞杆菌（bacilluslicheniformis）的构建方法，包括以下步骤：

（1）以地衣芽胞杆菌dw2的基因组dna为模板，pcr扩增出phop基因的上游同源臂和下游的同源臂；

（2）通过重叠延伸pcr将phop基因的上游同源臂和phop基因的下游同源臂连接到一起，构成目的基因片段；

（3）采用xbai和saci限制性内切酶对目的基因片段进行双酶切得到酶切敲除片段；

（4）准备质粒t2(2)-ori，并采用xbai和saci限制性内切酶对质粒t2(2)-ori进行双酶切得到线性质粒片段；

（5）将步骤（3）得到的酶切敲除片段和步骤（4）得到的线性质粒片段经dna连接酶进行连接，得到敲除质粒t2(2)-δphop；

（6）将敲除质粒t2(2)-δphop转入地衣芽胞杆菌dw2中，以卡那青霉素作为筛选标记，筛选得到阳性转化子；

（7）将阳性转化子在45℃条件下转接培养数次后，进行菌落pcr检测，得到phop基因的上游同源臂或phop基因的下游同源臂与地衣芽胞杆菌dw2基因组dna产生单交换的阳性单交换结合子菌株；

（8）挑选phop基因的上游同源臂与地衣芽胞杆菌dw2基因组dna产生单交换的阳性单交换结合子菌株与phop基因的下游同源臂与地衣芽胞杆菌dw2基因组dna产生单交换的阳性单交换结合子菌株混合接种于37℃、不含有卡那青霉素的培养基中经过数次转接培养，pcr法筛选得到敲除了phop基因的地衣芽胞杆菌dw2δphop（简称：bacilluslicheniformisdw2δphop）；

其中，所述的地衣芽胞杆菌dw2已于2011年10月12日保藏于位于武汉的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctccno：m2011344；

所述地衣芽胞杆菌dw2的基因组dna序列中的phop基因为sequencelisting中所示。

本发明人通过构建敲除负责转录碳代谢转录因子phop的基因—phop基因的地衣芽胞杆菌dw2δphop，成功得到了缺失phop基因的地衣芽胞杆菌菌株，为提高杆菌肽产量提供了一种新策略。

本发明的目的之二在于根据上述敲除phop的地衣芽胞杆菌的构建方法构建得到的地衣芽胞杆菌dw2δphop。

本发明的目的之三在于上述地衣芽胞杆菌dw2δphop在抗菌肽生产中的应用，其应用步骤包括：a种子发酵，b生产发酵。

所述种子发酵的培养基配方为：8～10g/l蛋白胨，3～6g/l酵母浸出粉，7～10g/l氯化钠，ph7.0～7.2。

所述生产发酵的培养基配方为：80～100g/l豆粕；15～40g/l玉米淀粉；4～8g/lcaco3和0.5～2g/l(nh4)2so4。

与地衣芽胞杆菌dw2相比，通过本发明构建得到的地衣芽胞杆菌dw2δphop的杆菌肽产量提高了15%以上。本发明的研究结果表明：敲除地衣芽孢杆菌dw2基因组dna中的碳代谢转录因子基因phop是一种十分有效的提高杆菌肽产量的方法。

附图说明

图1为步骤（1）得到的phop基因上游同源臂和下游同源臂的琼脂糖凝胶图；其中，泳道1为dnamarker，泳道2为phop基因上游同源臂，泳道3为phop基因下游同源臂；

图2为步骤（8）得到的地衣芽孢杆菌dw2δphop菌株的验证条带，泳道1为为dnamarker，泳道2为成功敲除phop的地衣芽孢杆菌dw2δphop菌株的验证条带，泳道3为野生菌株dw2的pcr验证条带；

其中，上述dnamarker泳道中从上到下的条带对应的分子量依次为：5000bp，3000bp，2000bp，1500bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp。

具体实施方式

现根据附图具体阐述本发明的较佳实施方式：

敲除phop的地衣芽胞杆菌（bacilluslicheniformis）的构建方法，包括以下步骤：

（1）以地衣芽胞杆菌dw2的基因组dna为模板，pcr扩增出phop基因的上游同源臂和下游的同源臂；

（2）通过重叠延伸pcr将phop基因的上游同源臂和phop基因的下游同源臂连接到一起，构成目的基因片段；

（3）采用xbai和saci限制性内切酶对目的基因片段进行双酶切得到酶切敲除片段；

（4）准备质粒t2(2)-ori，并采用xbai和saci限制性内切酶对质粒t2(2)-ori进行双酶切得到线性质粒片段；

（5）将步骤（3）得到的酶切敲除片段和步骤（4）得到的线性质粒片段经dna连接酶进行连接，得到敲除质粒t2(2)-δphop；

（6）将敲除质粒t2(2)-δphop转入地衣芽胞杆菌dw2中，以卡那青霉素作为筛选标记，筛选得到阳性转化子；

（7）将阳性转化子在45℃条件下转接培养数次后，进行菌落pcr检测，得到phop基因的上游同源臂或phop基因的下游同源臂与地衣芽胞杆菌dw2基因组dna产生单交换的阳性单交换结合子菌株；

（8）挑选phop基因的上游同源臂与地衣芽胞杆菌dw2基因组dna产生单交换的阳性单交换结合子菌株与phop基因的下游同源臂与地衣芽胞杆菌dw2基因组dna产生单交换的阳性单交换结合子菌株混合接种于37℃、不含有卡那青霉素的培养基中经过数次转接培养，pcr法筛选得到敲除了phop基因的地衣芽胞杆菌dw2δphop（简称：bacilluslicheniformisdw2δphop）；

其中，所述的地衣芽胞杆菌dw2已于2011年10月12日保藏于位于武汉的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctccno：m2011344；

所述地衣芽胞杆菌dw2的基因组dna序列中的phop基因为sequencelisting中所示。

敲除phop的地衣芽胞杆菌的构建方法的具体实施方式如下：

1、步骤（1）的具体操作步骤为：

根据地衣芽胞杆菌dw2基因组dna序列中的phop基因的基因序列，设计phop基因的上游同源臂引物（phop-f1、phop-r1）和下游同源臂引物phop-f2、phop-r2）；并以地衣芽胞杆菌dw2的基因组dna为模板，分别以phop基因的上游同源臂引物、下游同源臂引物进行pcr扩增得到phop基因的上游同源臂（523bp）和phop基因的下游同源臂（546bp）；

其中，phop-f1、phop-r1和phop-k2、phop-r2的序列为：

phop-f1：gctctagacaggtgctcagttatttgaggg、

phop-r1：gctttttgcggagtctttgaaattcctgaagaaccgttattgac、

phop-f2：caataacggttcttcaggaatttcaaagactccgcaaaaagc、

phop-r2：cgggatcctgcctacttttgtgccttca；

2、步骤（2）的具体操作步骤为：

以phop基因的上游同源臂和phop基因的下游同源臂为模板，上游同源臂引物phop-f1、下游同源臂引物phop-r2为引物，通过重叠延伸pcr将phop基因的上游下游同源臂和phop基因的下游同源臂连接到一起，得到目的基因片段（1069bp）；

3、步骤（3）的具体操作步骤为：

采用xbai和saci限制性内切酶对目的基因片段进行双酶切得到酶切敲除片段（1063bp）

4、步骤（4）的具体操作步骤为：

准备质粒t2(2)-ori（其中，质粒t2(2)-ori的构建方法为：将来自pe194质粒的194-ori、来自于pdg780质粒的卡那霉素抗性基因、来自质粒pbluescriptiisk(+)-x52328的puc-ori通过pcr反应扩增，并回收、酶切。按照194-ori，卡那霉素抗性基因，puc-ori的顺序连接。此构建方法参考文献：郭兴华,熊占等(1991)枯草杆菌-大肠杆菌多功能穿梭载体的构建.生物工程学报7(3):224-229和彭清忠,张惟材等(2002)短小芽孢杆菌-大肠杆菌穿梭分泌表达载体的构建.生物工程学报18(4):438-441），并采用xbai和saci限制性内切酶对质粒t2(2)-ori进行双酶切得到线性质粒片段（4259bp）；其中，所述的限制性内切酶xbai和saci限制性内切酶均购自北京全式金生物技术有限公司；

5、步骤（5）的具体操作步骤为：

将步骤（3）得到的酶切敲除片段和步骤（4）得到的线性质粒片段经dna连接酶（通常为t4dna连接酶，但也可以为其他常用的dna连接酶）进行连接，得到连接产物；通过氯化钙转化法将该连接产物转入大肠杆菌dh5α，在37℃的条件下经含有卡那青霉素抗性的培养基进行筛选，筛选得到转化子，对转化子挑质粒进行菌落pcr验证（所用引物为：t2-f和t2-r）。若转化子的pcr验证结果为：在1315bp处出现电泳条带，说明敲除载体构建成功，上述转化子为阳性转化子(命名为：敲除载体t2(2)-δphop)；

t2-f：atgtgataactcggcgta、

t2-r：gcaagcagcagattacgc；

6、步骤（6）的具体操作步骤为：

将敲除载体t2(2)-δphop转入地衣芽胞杆菌dw2中，在37℃的条件下经含有卡那青霉素抗性的培养基进行筛选，筛选得到转化子，对转化子挑质粒进行菌落pcr验证（所用引物为：t2-f和t2-r）。若转化子的pcr验证结果为：在1315bp处出现电泳条带，证明：敲除载体t2(2)-δphop成功转入地衣芽胞杆菌dw2中，此时，该转化子为阳性转化子（即转入了敲除载体t2(2)-δphop的地衣芽胞杆菌dw2）；

7、步骤（7）的具体操作步骤为：

将步骤（6）得到的阳性转化子在45℃条件下、含有卡那青霉素抗性的培养基上转接培养3次，每次培养12h，并以t2-f和phop-kyr为引物（或以t2-r与phop-kyf为引物）进行菌落pcr检测单交换菌株，扩增出1408bp或1924bp长度的条带，即证明为单交换菌株；

其中，phop-kyf和phop-kyr的序列为:

phop-kyf：aaaaacatcgtcgatgcacaca、

phop-kyr：tcttgacttgtgaggtggcatct；

8、步骤（8）的具体操作步骤为：

将步骤（7）得到的pcr检测出现1408bp条带的单交换菌株和步骤7）得到的pcr检测出现1924bp条带的单交换菌株混合接种培养，在37℃、不含有卡那青霉素的培养基中经过数次转接培养，挑转化子进行菌落pcr验证（引物为phop-kyf和phop-kyr）。若转化子的pcr验证结果为：在1902bp处出现电泳条带时，说明基因回复突变，该转化子为地衣芽胞杆菌dw2；在1408bp处出现电泳条带时，说明dw2的基因组上的phop基因成功敲除，该转化子为阳性转化子。随后针对阳性转化子进行dna测序进一步验证，得到双交换成功的phop缺失菌株（即地衣芽胞杆菌dw2δphop）。

本发明人还根据上述敲除phop的地衣芽胞杆菌的构建方法构建得到的地衣芽胞杆菌dw2δphop。

本发明人还提供了上述地衣芽胞杆菌dw2δphop在杆菌肽生产中的应用，其应用步骤包括：a种子发酵，b生产发酵。

本发明人根据上述地衣芽胞杆菌dw2δphop在杆菌肽生产中的应用步骤提供了14种实施例，并在表1中分别列举了实施例1-实施例14的种子培养基和发酵培养基的配方：

表1

其中，上述实施例中均采用dw2δphop菌株；种子发酵的具体步骤为：先将地衣芽胞杆菌活化，即从甘油管以体积百分比1%接种于装有5mllb培养基中，180～300r/min、温度37℃，培养10～14小时，然后将菌种活化后的菌液以体积百分比按1%接种量接种于种子发酵的培养基后于180～300r/min、37℃中培养10～12小时，得到种子培养的菌液；生产发酵的具体步骤为：向500ml三角瓶中装入25～150ml的生产发酵的培养基，然后将种子培养的菌液以接种量为2%（体积百分比），转速180～300r/min，温度37℃，发酵培养48小时，得到生产发酵的菌液。上述种子发酵的具体步骤和生产发酵的具体步骤均为现有技术。

本发明人采用高效液相色谱(hplc)方法对上述实施例中生产发酵的菌液中杆菌肽的产量进行测定。测定条件具体为：使用agilent1200液相色谱仪检测；色谱柱为hypersilbdsc18(5μm,4.6mm×250mm)；流动相为a:b＝35:65(a相：100mlph6.0磷酸盐缓冲液到300ml水中混合均匀；b相：520ml甲醇与40ml乙腈混合均匀)；流速：1.0ml/min；柱温30°c；紫外检测器波长：254nm；进样量20μl。根据杆菌肽标准品制作的标准曲线计算出生产发酵的菌液中杆菌肽的产量（见表2）。

表2

从表2可看出，在相同的种子发酵和生产发酵的条件下，相对于现有技术的地衣芽胞杆菌dw2来说，采用本发明的地衣芽胞杆菌dw2δphop的生产发酵的菌液中杆菌肽效价有了大幅提升（提高15~21%），说明：本发明的技术方案在提高地衣芽胞杆菌杆菌肽产量方面具有重大应用价值。

此外，本发明也研究了phop缺失对地衣芽胞杆菌中其他次级代谢产物的影响。具体如下：本发明人采用地衣芽胞杆菌dw2和dw2△phop进行脂肽类次级代谢产物—地衣素的发酵研究，研究phop缺失对地衣素合成的影响。种子培养基：lb培养基（10g/l蛋白胨，5g/l酵母粉，10g/lnacl，ph7.20）；种子培养条件：培养温度为30～37°c，250ml三角瓶中装液量为30～50ml，摇床转速180～230r/min，培养时间为8～10h。发酵培养基的配方为：30g/l葡萄糖，5g/l硝酸铵，60mmol/lkh2po4，80mmol/lna2hpo4，0.4mmol/lfeso4·7h20，0.4mmol/lmnso4·h20，0.8mmmol/lmgso4·7h20，7umol/lcacl2，4umol/lna2-edta，ph7.0；发酵培养条件：培养温度为30～37°c，250ml三角瓶中装液量为30～50ml，摇床转速180～230r/min，培养时间为32h。发酵结果为：地衣芽孢杆菌dw2的发酵液中地衣素的产量为0.34g/l，而地衣芽孢杆菌dw2△phop的产量仅为0.27g/l，相比于对照菌株-地衣芽孢杆菌dw2下降了21%。

另外，本发明人也研究了phop缺失对其他菌株（解淀粉芽胞杆菌lx-12）中的次级代谢产物的影响。具体如下：本发明人以解淀粉芽胞杆菌lx-12（所述的解淀粉芽胞杆菌lx-12已于2015年4月15日保藏于位于武汉的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctccno：m2015234）作为野生菌株，将其基因组中的磷代谢转录因子基因phop进行敲除，并同时检测脂肽类次级代谢产物-伊枯草菌素（简称“iturina”）的产量。首先，设计引物ba-phop-f1、ba-phop-r1和ba-phop-f2、ba-phop-r2，扩增用于基因phop敲除的上游同源臂和下游同源臂。解淀粉芽胞杆菌基因phop的上、下游同源臂的大小分别为608bp和612bp。随后，将上、下游同源臂经重叠延伸pcr连接到一起，并通过xbai、saci双酶切插入到敲除载体t2(2)-ori中，得到phop敲除载体t2-ba-phop。其中，ba-phop-f1、ba-phop-r1、ba-phop-f2、ba-phop-r2的序列具体为：

ba-phop-f1：gccgagctcgacatggttcctctcgtccgttat、

ba-phop-r1：gacgcacacggactttattcatgctgcgccctccgctgtcta、

ba-phop-f2：tagacagcggagggcgcagcatgaataaagtccgtgtgcgtc、

ba-phop-r2：gctctagaaccgctgtaggagcgggcgtcat；

将敲除质粒t2-ba-phop转入解淀粉芽胞杆菌lx-12中，以卡那青霉素作为筛选标记，筛选得到阳性转化子；将阳性转化子在45℃条件下转接培养数次后，进行菌落pcr检测，得到phop基因的上游同源臂或phop基因的下游同源臂与解淀粉芽胞杆菌lx-12基因组dna产生单交换的阳性单交换结合子菌株；挑选phop基因的上游同源臂与解淀粉芽胞杆菌lx-12基因组dna产生单交换的阳性单交换结合子菌株与phop基因的下游同源臂与解淀粉芽胞杆菌lx-12基因组dna产生单交换的阳性单交换结合子菌株混合接种于37℃、不含有卡那青霉素的培养基中经过数次转接培养，pcr法筛选得到敲除了phop基因的解淀粉芽胞杆菌lx-12δphop（简称：

bacillusamyloliquefaciensdw2δphop），所用引物为ba-phop-kyf、ba-phop-kyr，双交换验证菌落pcr凝胶图中野生菌株的在1689bp处出现条带，缺失菌株在1342bp处出现条带。

其中，ba-phop-kyf、ba-phop-kyr的序列具体为：

ba-phop-kyf：gtgaccggttttgttcttggcgga、

ba-phop-kyr：tccgtcgccacttttgtcgcgg；

然后，分别对解淀粉芽胞杆菌lx-12和解淀粉芽胞杆菌lx-12δphop进行发酵培养，其中种子培养基的配方为：lb培养基（10g/l蛋白胨，5g/l酵母粉，10g/lnacl，ph7.20）；种子培养条件：培养温度为30~37°c，250ml三角瓶中装液量为30~50ml，摇床转速180~230r/min，培养时间为8~10h；发酵结果为：解淀粉芽胞杆菌lx-12的发酵液中地衣素产量为0.53g/l，而phop缺失菌株lx-12△phop的发酵液中地衣素产量仅为0.40g/l，相比于对照菌株-解淀粉芽胞杆菌lx-12，下降了25%。由此可知，phop的缺失对于菌株的次级代谢产物的提高并没有普适性。

序列表

<110>绿康生化股份有限公司

<120>敲除phop基因的地衣芽胞杆菌菌株及构建方法和应用

<130>ds-p18276

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>702

<212>dna

<213>地衣芽孢杆菌dw2(bacilluslicheniformis)

<400>1

atggaaaaaacaaaaatactgattattgaagatgatgaagcaattgctgatttgctttca60

tacgggctgacgtccgaaggctttgaaacgtgcacggtcaataacggttcttcaggaatg120

aggaaactagatcagttcaaacctgaccttctgctcctcgattggatgctgccggactgc180

agcggattggatatttgcaaaaaagtgaccgaaagctgtaatattccaatactgatgatt240

accgcaaaatcagatatcacggataaaatactggggttggaattcggggccgatgactat300

attacaaagccgtttgatctgcgcgaagttgtcgcgagaatacgcacgatccttcggcgt360

ctggaacaagcccatcatgtgaacgaacgggaaacggaaaaagtggatgagatccggttt420

aaaaatattgtgatcgttccgggcgaaagactggtgaaaaaagacggggcagccgtcgaa480

ttaactcctaaagaatatgatctgctaatgactttggttgaccatcggggaaaagttttt540

acccgttcagagcttttggaattcatctggggatacgattttttcggtgacacccgtaca600

gtcgatacccatattcaaagactccgcaaaaagcttgatgcaagcgacttgattaaaaca660

gtgttcggcatcggatataaattcgagaagcaggaggagtag702