Mhp非特异性核酸酶及其编码基因与应用的制作方法

本发明涉及生物技术领域，具体地说，涉及mhp非特异性核酸酶及其编码基因与应用。

背景技术：

核酸酶是一种可以降解核酸底物、催化磷酸二酯键水解的一类酶，可以分为dna酶、rna酶和非特异性核酸酶三类。其中非特异性核酸酶是一类高活性的水解酶，能非特异性地降解几乎所有形式的核酸，包括单链、双链、线状、环状和超螺旋形式的dna和rna，且对核酸的序列没有要求。非特异性核酸酶具有许多重要功能，例如，参与dna复制、重组和修复，rna的剪接、成熟、降解和干扰，细胞的营养生长、细胞凋亡、炎性反应、血管血栓及宿主防御等过程，因而在癌症等疾病的诊断和治疗方面具有重要的应用价值；作为基因杀手用于控制改造微生物有机体的自行毁灭；用于清除重组蛋白药物中的外源核酸，减少过敏反应和致癌风险，提高生物制品的安全性；用于pcr、lamp等核酸扩增产物的降解，以避免扩增产物对核酸扩增实验室或操作台的污染，减少或消除非特异性扩增；用于研制新型的环保生物消毒剂，其能作用于细菌和病毒的遗传物质，裂解dna或rna，从而达到杀灭细菌和病毒的目的，与化学消毒剂相比，在理论上对机体无任何毒副作用，不污染环境，是一种理想的潜在的绿色环保抗病毒制剂。

目前，国内外使用的非特异性核酸酶主要来源于merck公司的benzonaseendonuclease，benzonase核酸酶是来自serratiamarcescens，经基因工程改进的核酸内切酶，在广泛条件范围下都能保持很高的活性：在ph6-10及0-42℃保持较高的活性；在1.0mmpmsf、1.0mmedta及尿素中保持活性。但该重组蛋白具有信号肽，部分以包涵体形式存在，复性困难，导致其价格昂贵，使其大规模应用受到限制。因此有必要开发新型的非特异性核酸酶并建立相配套的生产工艺。

技术实现要素：

本发明的目的是提供mhp非特异性核酸酶及其编码基因与应用。

为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种来源于猪肺炎支原体(mycoplasmahyopneumoniae)(简称mhp)的mhp非特异性核酸酶，所述mhp非特异性核酸酶为：

(a)由seqidno:2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或

(b)seqidno:2所示序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等功能的由(a)衍生的蛋白质。

由于氨基酸序列的特殊性，任何含有seqidno:2所示氨基酸序列的多肽的片段或其变体，如其保守性变体、生物活性片段或衍生物，只要该多肽的片段或多肽变体与前述氨基酸序列同源性在95％以上，均属于本发明保护范围之列。具体的，所述改变可包括氨基酸序列中氨基酸的缺失、插入或替换；其中，对于变体的保守性改变，所替换的氨基酸具有与原氨基酸相似的结构或化学性质，如用亮氨酸替换异亮氨酸，变体也可具有非保守性改变，如用色氨酸替换甘氨酸。

第二方面，本发明提供编码所述mhp非特异性核酸酶的基因。核苷酸序列为：

i)seqidno:1所示的核苷酸序列；

ii)seqidno:1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列；

iii)在严格条件下与seqidno:1所示序列杂交且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列，所述严格条件为在含0.1％sds的0.1×sspe或含0.1％sds的0.1×ssc溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜；或

iv)与i)、ii)或iii)的核苷酸序列具有90％以上同源性且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列。

第三方面，本发明提供含有所述mhp非特异性核酸酶编码基因的生物材料，所述生物材料包括但不限于重组dna、表达盒、转座子、质粒载体、噬菌体载体、病毒载体或工程菌。

进一步地，本发明提供含有所述mhp非特异性核酸酶编码基因的重组表达载体，所述重组表达载体的出发载体是可以在真核表达系统、或原核表达系统中表达目的蛋白的载体。

优选所述出发载体选自pet系列、puc系列或pbr322载体等。

更优选所述重组表达载体是在质粒pet28a的ncoi和xhoi酶切位点之间插入所述mhp非特异性核酸酶的编码基因得到的重组表达载体pet28a-nuc。

进一步地，本发明提供一种重组基因工程菌，所述工程菌为大肠杆菌，并携带表达所述mhp非特异性核酸酶的表达载体。

在本发明的一个具体实施方式中，所述重组基因工程菌是用重组表达载体pet28a-nuc转化大肠杆菌得到的工程菌，命名为大肠埃希氏菌(escherichiacoli)bl21/mhp-nuc，现已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏编号为cgmccno.16353，保藏日期2018年8月29日。

第四方面，本发明提供mhp非特异性核酸酶的截短蛋白，所述截短蛋白为：

(a)由seqidno:3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或

(b)seqidno:3所示序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等功能的由(a)衍生的蛋白质。

第五方面，本发明提供所述mhp非特异性核酸酶、编码所述mhp非特异性核酸酶的基因、含有所述基因的生物材料或所述mhp非特异性核酸酶的截短蛋白的以下任一应用：

1)在降解核酸中的应用；

2)在制备核酸降解剂中的应用。

其中，所述核酸包括但不限于双链dna、单链dna、质粒dna、rna或反义rna/dna。

第六方面，本发明提供一种核酸降解剂，其有效成分为所述mhp非特异性核酸酶、所述mhp非特异性核酸酶的截短蛋白和/或它们n端c端连接标签得到的融合蛋白。

进一步地，本发明提供所述mhp非特异性核酸酶编码基因在制备mhp非特异性核酸酶中的应用，所述应用为：构建含有所述mhp非特异性核酸酶基因的重组载体，将所述重组载体转化至大肠杆菌中，获得的重组基因工程菌进行诱导培养(以iptg为诱导剂)，培养液分离得到含有mhp非特异性核酸酶的菌体细胞。

本发明所述mhp非特异性核酸酶核苷酸序列的获取及高产菌株的构建，具体包括以下步骤：

(1)利用已知猪肺炎支原体非特异性核酸酶基因设计引物，以mhp基因组为模板，通过pcr技术扩增出mhp非特异性核酸酶的基因片段，连接克隆载体进行测序。因为tga密码子在猪肺炎支原体中表达色氨酸，而在大肠杆菌表达系统中为终止密码子，因此通过设计突变引物，采用重叠延伸pcr的方法将mhp非特异性核酸酶基因内部的tga密码子突变成tgg，得到mhp非特异性核酸酶的核苷酸序列，如seqidno:1所示。突变后的基因序列对应的氨基酸序列如seqidno:2所示。

(2)将mhp非特异性核酸酶基因用ncoi和xhoi进行双酶切，并与同样双酶切的pet28a(+)连接，转化至大肠杆菌e.colitransetta(de3)表达载体，构建基因工程菌，在培养基中加入iptg诱导表达重组蛋白，即得产mhp非特异性核酸酶的菌体细胞。

本发明所述mhp非特异性核酸酶的酶学性质研究主要包括：用ni-ntaresin亲和层析分离纯化mhp非特异性核酸酶，以双链dna、单链dna、质粒dna和rna为底物，研究mhp非特异性核酸酶的底物特异性、降解时间、最适温度、不同离子温度对其活性的影响。研究结果表明：mhp非特异性核酸酶无底物特异性，可降解各种核酸底物，且解降解反应极为迅速，混匀即可完成降解反应；酶活性极强，192ngmhp非特异性核酸酶即可将1μg核酸底物彻底降；具有耐热性，17-57℃温度范围内均可发挥较强的核酸酶活性；低浓度的钙离子或镁离子即可使该核酸酶发挥活性，其它离子如铜离子，亚铁离子、三价铁离子几乎不能使该核酸酶发挥降解活性。

借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

本发明提供了来源于猪肺炎支原体的非特异性核酸酶及其编码基因，并构建了mhp非特异性核酸酶的高产菌株。mhp非特异性核酸酶不仅具有非特异性，而且具有广泛的适用性，如降解反应迅速、酶活高、耐高温、所需离子浓度低等，可广泛应用于生物制药、生物试剂研发、工业化等领域。

mhp非特异性核酸酶能够有效降解中性粒细胞陷阱，降低中性粒细胞对病原微生物的诱捕和杀伤，下调干扰素表达，增强病原微生物的感染和发病作用，可配合病原用于动物传染病发病模型的建立，也可作为抗原制备疫苗，用于奶牛乳房炎等传染病的免疫预防。

附图说明

图1为本发明实施例2中mhp非特异性核酸酶sds-page检测结果；其中，m：蛋白marker；mhp597：mhp非特异性核酸酶。

图2为本发明实施例3中mhp非特异性核酸酶活性鉴定结果；其中，a:mhp非特异性核酸酶在不同时间内对dsdna的降解；b:mhp非特异性核酸酶在不同时间内对ssdna的降解；c:mhp非特异性核酸酶在不同时间内对质粒dna的降解；d:mhp非特异性核酸酶在不同时间内对rna的降解；e:不同浓度的mhp非特异性核酸酶对核酸底物的降解；f:不同的温度对mhp非特异性核酸酶核酸酶活性的影响；g:不同浓度的ca²⁺对mhp非特异性核酸酶核酸酶活性的影响；h:不同浓度的mg²⁺对mhp非特异性核酸酶核酸酶活性的影响；i:不同浓度的cu²⁺对mhp非特异性核酸酶核酸酶活性的影响；j:不同浓度的fe²⁺对mhp非特异性核酸酶核酸酶活性的影响；k:不同浓度的fe³⁺对mhp非特异性核酸酶核酸酶活性的影响。dsdna为小牛胸腺dna,ssdna为m13phagedna,质粒dna为puc19质粒dna,rna从pk15细胞中提取获得。c:control,核酸底物没做任何处理。

图3为本发明实施例3中rmhp597^δtm和rmhp597^δ315-377蛋白的核酸酶活性分析结果；其中，a:不同时间内1μgrmhp597^δtm对1μgdsdna的降解作用；b:不同时间内1μgrmhmhp597^δ315-377对1μgdsdna的降解作用。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如sambrook等分子克隆实验手册(sambrookj&russelldw,molecularcloning:alaboratorymanual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

实施例1mhp非特异性核酸酶核苷酸序列的获取和点突变

利用已知猪肺炎支原体(mhp)非特异性核酸酶基因(基因登录号为aaz53943.1)设计引物，mhp597-f’(5’-atgaaaattaaaaaattatttcttttt-3’)和mhp597-r’(5’-ttaattctgactgttttggcct-3’)，以mhp全基因组为模板，进行pcr扩增，将获得的序列连接克隆载体并送美吉生物科技有限公司测序。将测序结果使用dnastar软件翻译成蛋白序列，找到mhp非特异性核酸酶的基因片段内部的tga终止密码子，通过设计突变引物，突变引物列表如表1，采用重叠延伸pcr的方法进行点突变，将基因内部的tga突变成tgg，即得到mhp非特异性核酸酶的核苷酸序列，结果如seqidno:1所示，其对应的氨基酸序列如seqidno:2所示。

pcr扩增体系及条件如下：

25μlpcr反应体系为：dna模板2.0μl，10μm上游引物0.5μl，10μm下游引物0.5μl，2×taqpcrstarmix12.5μl，ddh2o9.5μl。

pcr循环程序：94℃预变性5.0min；94℃变性30sec，56℃退火30sec，72℃延伸1min，共35个循环；72℃延伸5.0min。

表1mhp597突变引物

实施例2表达mhp非特异性核酸酶工程菌株的构建

1、mhp非特异性核酸酶基因的扩增

根据修饰后的mhp非特异性核酸酶基因序列特征设计引物，上游引物mhp597-f含ncoi位点mhp597-f(5’-catgccatgggcaccggactcggagcttattt-3’)，不扩增原始信号肽(1-18个氨基酸切除，总长为54bp)，下游引物mhp597-r含xhoi位点mhp597-r(5’-ccgctcgagattctgactgttttggcct-3’)，mhp非特异性核酸酶基因(seqidno:1所示)为模板，进行pcr扩增。pcr扩增体系及条件同实施例1。

2、mhp非特异性核酸酶基因的克隆

采用北京天跟生化科技有限公司的普通琼脂糖凝胶dna回收试剂盒回收步骤(1)pcr扩增产物，连接北京全式金生物技术有限公司的peasy-t1克隆载体，即peasy-t1-nuc。克隆载体的连接及产物转化感受态大肠杆菌trans-t1的方法为：准确吸取peasy-t1cloningvector1μl、基因片段胶回收产物4μl放入pcr反应管中，用小枪头轻轻混匀后将反应管置于pcr仪中25℃反应15min，置于冰上备用；从-80℃取出1管50μl装的trans1-t1大肠杆菌感受态细胞，置于冰上待其融化，大约8min左右感受态细胞融化，将上述反应产物全部加入感受态细胞，手指轻弹混匀，置冰上30min，然后放入42℃水浴锅中热激45s，迅速放在冰上，置2min；加入500μllb无抗性培养基，37℃200rpm摇床中培养1h；取100μl细菌培养液，用灭菌的三角棒均匀涂在氨苄青霉素(amp+)抗性的的lb固体培养基上，37℃倒置16h。用小枪头挑取培养基上的单菌落，培养至氨苄青霉素抗性的液体lb培养基中，37℃200rpm恒温摇床中培养10h。

3、mhp非特异性核酸酶表达载体的构建

将peasy-t1-nuc和pet28a(+)经ncoi和xhoi双酶切，将双酶切得到的mhp非特异性核酸酶基因片段和pet28a(+)载体经t4dna连接酶连接。连接产物转化感受态大肠杆菌transetta(de3)表达菌，将转化菌株接种在含终浓度100μg/ml卡那霉素的lb琼脂平板上，37℃培养过夜，随机挑取单菌落，37℃振摇培养12h，用北京天跟生化科技有限公司的质粒小提试剂盒提取质粒，送美吉生物科技有限公司测序，表明seqidno:1所示核苷酸序列已经重组至表达载体pet28a(+)中，获得含mhp非特异性核酸酶基因的大肠杆菌transetta(de3)。连接产物转化感受态大肠杆菌transetta(de3)的方法为：从-80冰箱取出一管50μl装的transetta(de3)感受态细胞，冰上放置大概8min待其融化，吸取5μl上述连接产物至感受态细胞，轻弹混匀后在冰上放置30min；将感受态细胞放42℃水浴中热激45s，迅速转移到冰上。放置2min；加入500μl无抗性lb培养基，在摇床中37℃200rpm培养1h；吸取100μl菌液放在卡那霉素抗性的lb固体培养基上，用灭菌的三角棒涂抹均匀，在37℃培养箱中倒置培养16h。用灭菌小枪头挑取6个长势均匀的单菌落，接种于含卡那霉素抗性的lb液体培养基中，每管5ml，37℃200rpm培养10h。

4、mhp非特异性核酸酶的诱导表达

将步骤3中序列鉴定正确(即含seqidno:1所示核苷酸序列)的菌体接种至lb液体培养基，37℃振荡培养至od600约为4h时，加入终浓度1.0mm的iptg，37℃继续振荡培养12h，离心(4℃，8000rpm，5min)，收集沉淀，获得含seqidno:1所示核苷酸序列编码mhp非特异性核酸酶的菌体细胞，命名为大肠埃希氏菌(escherichiacoli)bl21/mhp-nuc。送至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，保藏编号为cgmccno.16353。

5、mhp非特异性核酸酶的分离纯化

将上述表达菌用80mlpbs重悬，使用超声破碎仪破碎处理40min；4℃12000rpm离心10min，收集上清，加入饱和硫酸铵至终饱和度为40％，轻轻吹吸混匀，室温放置20min；4℃12000rpm离心10min，收集上清，加入饱和硫酸铵至终饱和度为55％，室温放置20min；4℃12000rpm离心10min，收集沉淀，用80mlpbs重悬沉淀，彻底溶解后放入透析袋，将透析袋在3lpbs中透析去除，6h换液一次，24h后将蛋白液取出用于ni柱亲和层析。

取样进行12％聚丙烯酰胺凝胶电泳分析发现ni柱亲和层析可以纯化得到非常纯净的核酸酶蛋白(图1)。

实施例3mhp非特异性核酸酶的酶学性质研究

1、mhp非特异性核酸酶对不同核酸底物的降解作用

将dsdna(小牛胸腺dna)、ssdna、plasmiddna、rna作为底物，加入1μgmhp597蛋白，放入含有10mmca²⁺、100mmmg²⁺的缓冲液中(表2)，分别反应0.25min、1min、2min、3min、4min、5min，然后将反应体系跑1％的琼脂糖凝胶电泳。结果表明1μgmhp非特异性核酸酶可彻底降解1μg双链dna(dsdna)、单链dna(ssdna)、质粒dna和rna，且降解反应时间极短，混匀即可完成降解反应(图2a，图2b，图2c，图2d)。

表2mhp非特异性核酸酶对不同核酸底物的降解

2、蛋白浓度对mhp非特异性核酸酶活性的影响

为了探究不同浓度的mhp非特异性核酸酶对底物降解作用的影响，分别取终浓度为12ng/ml、24ng/ml、48ng/ml、96ng/ml、192ng/ml的mhp非特异性核酸酶用于核酸降解实验，反应体系见表3，然后将反应体系跑1％的琼脂糖凝胶电泳，检测结果。结果表明mhp非特异性核酸酶具有很强的核酸酶活性，彻底降解1μgdsdna所需蛋白浓度192ng/ml，即ng级的蛋白量即可发挥强大的核酸降解能力，说明rmhp597蛋白是一种极为高效的核酸酶(图2e)。

表3蛋白浓度对mhp非特异性核酸酶活性的影响

3、反应温度对mhp非特异性核酸酶活性影响

温度条件对酶活性具有重要影响，为了探究温度对mhp非特异性核酸酶核酸降解活性的影响，按照反应体系配好核酸底物和反应buffer的混合液，将此混合液和重组mhp非特异性核酸酶同时分别放入17℃、27℃、37℃、47℃、57℃、67℃的金属浴中孵育5min，然后将1μgmhp非特异性核酸酶加入混合液中，反应30min，见表4，然后将反应体系跑1％的琼脂糖凝胶电泳，检测结果。结果表明mhp非特异性核酸酶是耐热核酸酶，当温度达到57℃时，仍然具有很强的核酸酶活性(图2f)。

表4反应温度对mhp非特异性核酸酶活性的影响

4、金属离子对mhp非特异性核酸酶活性的影响

很多蛋白酶发挥其活性需要金属离子的辅助，为了探究mhp非特异性核酸酶降解核酸底物是否具有金属离子依懒性，将重组mhp非特异性核酸酶、不同浓度的(0.1m、0.2m、0.4m、0.8m、1.6m)金属离子(ca²⁺、mg²⁺、cu²⁺、fe²⁺、fe³⁺)及核酸底物按照表5体系混合均匀，置37℃孵育30min，然后将反应体系跑1％的琼脂糖凝胶电泳，检测结果。结果表明在ca²⁺或mg²⁺存在的条件下，mhp非特异性核酸酶可发挥核酸酶活性，而在cu²⁺、fe²⁺、fe3+存在的条件下，mhp非特异性核酸酶不可发挥核酸酶活性(图2g、图2h、图2i、图2j、图2k)。

表5金属离子对mhp非特异性核酸酶活性的影响

5、mhp非特异性核酸酶的功能区

结构分析发现mhp597n端有一个23aa大小的跨膜区，c端有大小的21aa大小的强碱性极性区，分别截短表达去除这两个特殊肽段的蛋白并分析其生物学功能。结果显示去除n端跨膜区的蛋白(rmhp597^δtm)仍然具有极高的核酸酶活性，而去除强碱性极性区的蛋白(rmhp597^δ315-377)无核酸酶活性(图3)。

mhp非特异性核酸酶的截短蛋白rmhp597^δtm的氨基酸序列如seqidno:3所示。

6、mhp非特异性核酸酶的酸碱稳定性

经测定，mhp非特异性核酸酶在ph6.5-8.5的条件下酶活性稳定。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110>中国农业大学

<120>mhp非特异性核酸酶及其编码基因与应用

<130>khp181115577.6

<160>3

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1077

<212>dna

<213>猪肺炎支原体(mycoplasmahyopneumoniae)

<400>1

accggactcggagcttatttaatttatcaaacatcaacaaataaatcaaattcaacaaca60

gttgcccttaatcaaactgaaaaattaaattcaacaagtaatttagaaaatactaattta120

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ttgcttgataaagaagaaaaaacttcactttcaaatacttttggcaaatattcaaattcc840

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ttttcaatttttaaaaaaaatattgctaatgtagaaaaatatgatgagcttcggaaaaaa960

gatggtcgctcaatgaattataaaattaatcaattaggggaaataaacagaattaaagga1020

atttccgatcatacaatggtttattttgatcttgaattaggccaaaacagtcagaat1077

<210>2

<211>359

<212>prt

<213>猪肺炎支原体(mycoplasmahyopneumoniae)

<400>2

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151015

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