一种多重重金属耐性产吲哚乙酸的菌株及其应用的制作方法

本发明属于农业微生物领域，涉及一种多重重金属耐性产吲哚乙酸的菌株及其应用。

背景技术：

随着工农业生产的快速发展和城市化进程的不断加快，土壤的重金属污染已经成为对环境危害最大的污染之一。虽然植物正常生长发育必需一些重金属元素的参与，如某些重金属是很多酶和其它蛋白质的组成成分，但土壤中高浓度必需的和非必需的重金属可导致植物产生中毒症状，并抑制大多数植物的生长。

土壤中一些细菌能够产生促进植物生长的代谢物，如分泌生长素-吲哚乙酸(iaa)，可以对植物的生长、分化起着重要的调节控制作用，或是影响土壤中养分转化过程，促进植物对矿质营养元素的吸收和利用，甚至能产生一些拮抗物质抑制土壤其他有害微生物的生长，这类细菌称为植物促生细菌。

植物促生菌与植物在长期的共同进化中，已成为植物微生态系统的天然组成成份，它能促进植物对恶劣环境的适应，加强系统的生态平衡。研究表明促生菌的存在直接或间接促进植物生长，其促生作用在恶劣的环境条件下表现尤为突出，因而被认为是辅助植物在逆境中定植的关键性因素。此外也有研究发现，某些植物促生细菌可以减轻土壤污染物对植物的毒害作用，提高植物对重金属的吸收积累，从而促进植物对土壤重金属的修复作用。

而在重金属胁迫条件下，不适应生长的微生物数量会减少或绝灭，适应生长的微生物数量会增加或积累。一般情况下，重金属不能被微生物降解并且对它们具有毒害作用，但微生物对重金属又有一定的抗性和解毒作用，可以吸附和转化重金属。因此，在重金属的选择作用下，一些微生物不断增强自己的耐性、抗性。

因此筛选重金属耐性的植物促生菌能够进一步拓展重金属胁迫条件下对植物促生和定殖的作用，从而达到提高植物抗逆性，促进植物生长，甚至能够修复改善胁迫环境的目的。此外，土壤重金属污染往往出现多重元素复合的情况，因此筛选具有多重耐性的微生物十分必要。

技术实现要素：

本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一株多重重金属耐性产吲哚乙酸的菌株。

本发明的另一目的是提供该菌株的应用。

本发明的目的可通过以下技术方案实现：

基于1-氨基环丙烷-1-羧酸(acc)脱氨酶能够将植物乙烯合成的关键中间前体α-氨基环丙烷羧酸(acc)分解成α-丁酮酸和氨，进而降低乙烯浓度来促进植物生长，保护植物避免生物及非生物的胁迫，如重金属胁迫。本发明以土壤为材料，以acc为唯一氮源，通过富集培养并进行筛选，分离耐性菌株，然后将此菌株在不同高浓度重金属(镉、铜、铅和锌)暴露下，测定iaa产生的性能。由此筛选出一株具有多重重金属耐性，并能在重金属暴露下依然能够高产iaa的微生物菌株。

一株多重重金属耐性产吲哚乙酸的成团泛菌(pantoeaagglomerans)cdl29，于2018年3月28日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号cgmccno.15523。

该菌菌落较小为白色、隆起，边缘整齐，表面光滑湿润，不透明，不规则杆状排列。该菌生理生化特性是：革兰氏阴性，兼性厌氧，化能异养，氧化酶阴性，接触酶阳性，吲哚阴性，m-r可变，硝酸盐还原阳性，丙二酸利用阳性。形态特征观察和16srdna序列分析结果表明，该菌为一种成团泛菌(pantoeaagglomerans)。

本发明所述的成团泛菌(pantoeaagglomerans)cdl29制备的菌剂。

本发明所述的成团泛菌(pantoeaagglomerans)cdl29在重金属污染土壤中促进植物的生长和根系发育中应用。

所述的重金属优选镉、铜、铅、锌中的任意一种或多种。

所述的植物优选小麦。

本发明所述的菌剂在重金属污染土壤中促进植物的生长和根系发育中应用。

所述的重金属优选镉、铜、铅、锌中的任意一种或多种。

所述的植物优选小麦。

有益效果：

该菌株能在多种重金属浓度下生长(高浓度铜、锌、铅和锌)，且高产吲哚乙酸，在重金属污染土壤，接种该菌可以有效促进小麦生长和根系的发育。对于多重重金属污染的两种土壤，偏碱性的a土与偏酸性的b土，相比于未接菌处理，添加菌株cdl29后，均能明显促进小麦苗株高和生物量的增加，并能促进根系的生长。另外，发现相比偏碱性缓解，菌株cdl29的添加在偏酸性条件，更能显著促进小麦苗的生长，降低重金属镉的毒害胁迫。

附图说明

图1是本发明菌株cdl29的菌落图；

图2表示在lb液体培养基下cdl29菌株生长曲线及产iaa特性；

图3表示菌株cdl29在含不同重金属培养液中的生长曲线及产iaa特性；

图4表示菌株cdl29在不同重金属污染土壤中对小麦苗的促生效果。

生物样品保藏信息

cdl29,分类命名为成团泛菌pantoeaagglomerans，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2018年3月28日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏号cgmccno.15523。

具体实施方式

实施例1：耐性菌株的分离、纯化、鉴定

1、培养基①lb培养基：蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，琼脂20g，蒸馏水1000ml，ph7.0-7.2，121℃灭菌，20min。lb液体培养基：不加琼脂，其它条件同上。②df盐培养基：每升培养基中含na2hpo46.0g、kh2po44.0g、mgso4.7h2o0.2g、葡萄糖2g、葡萄糖酸2g、柠檬酸2g、(nh4)2so42g、组分1和组分2溶液各0.1ml、h2o1l，ph7.0-7.2。121℃灭菌，20min。组分1：将h3bo310mg、mnso4.h2o11.19mg、znso4.7h2o124.6mg、cuso4.5h2o78.22mg、moo310mg溶于100ml灭菌的蒸馏水中；组分2：feso4.7h2o100mg溶于10ml灭菌的蒸馏水中。③dfa液体培养基：将配制的0.5mol/lacc液体通过0.2μm的膜抽滤除菌后，将acc以终浓度为3.0mmol/l加入到不含(nh4)2so4的df盐培养基中。dfa固体培养基：每升dfa液体培养基中加入琼脂15-20g。

2、耐性菌株的富集、筛选和分离纯化：

新鲜土壤称取l0g置于盛有100ml灭菌水的250ml的三角瓶中，在摇床中，28℃，200r·min^-1振荡20min，静置10min，得到悬浮液。取1ml悬浮液重复振荡培养1次，以富集细菌。吸取第2次培养液1ml加入到50ml灭菌的df盐培养基中，在28℃、200r·min^-1条件下振荡培养24h并转接一次，吸取上述菌悬浮液1ml转移至50ml含3.0mmol/lacc的dfa液体培养基中，在28℃，200r·min^-1条件下筛选培养24h。重复转接3次后，将梯度稀释的菌悬液涂布于dfa固体培养基平板上进行分离纯化，28℃恒温培养，待长出单菌后，以含体积分数30％甘油的混悬液形式保存于-80℃冰箱中。

3、定性和定量测定筛选出可分泌吲哚乙酸的细菌：

定性测定：将分离纯化后的细菌接种于采用含有l-色氨酸(200mg/l)的lb液体培养基，28℃，200r·min^-1摇床培养1d。取50μl菌悬液滴于白色陶瓷板上，同时加50μlsalkowski比色液(50ml35％hclo4+1ml0.5mfecl3)。将加入50μl50mg/l吲哚乙酸的比色液作为阳性对照。白色陶瓷板于室温避光放置30min后观察，颜色变红者表示能够分泌吲哚乙酸。

定量测定：对初筛获得的分泌iaa的细菌进行定量测定，培养条件同上。首先用分光光度法测定菌悬液的od600值，然后将菌悬液以10000r·min^-1离心10min取上清液加入等体积salkowski比色液，避光静置30min，测定其od530值，明确iaa产生量。最后计算单位体积发酵液中吲哚乙酸的含量。标准曲线的绘制采用分析纯的吲哚乙酸梯度稀释制备。

把得到的产iaa菌进行耐重金属情况的筛选测定，将供试菌株接种于含有重金属的细菌液体培养基的150ml三角瓶，28℃，200r·min^-1培养，分时间段取样，然后将取得的培养液装入离心管4℃下10000r·min^-1离心，10min。取上清液加入等体积salkowski比色液，避光静置30min，测定其od530值，明确iaa产生量。最后计算单位体积发酵液中吲哚乙酸的含量。标准曲线的绘制采用分析纯的吲哚乙酸梯度稀释制备。

4、形态观察及鉴定

筛选出高产吲哚乙酸的耐性菌株，如图1所示，该菌株形成的菌落较小为白色、隆起，边缘整齐，表面光滑湿润，不透明，不规则杆状排列，株型命名为cdl29。

将上述方法筛选分离出的菌株，经南京思普金生物科技有限公司测序，根据16srdna的测序结果，在http://www.ncbi.nlm.nih.gov在线查询分析，利用blast软件在genbank中与其它的16srdna序列进行同源性比较，选择相近的序列与cdl29的序列用megaversion3软件构建cdl29的16srdna系统进化树。根据该菌株的生理生化特征，鉴定为成团泛菌(pantoeaagglomerans)，同源性为99％。将该菌株于2018年3月28日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号cgmccno.15523。

实施例2：不同浓度重金属胁迫下菌株的生长及产iaa特性

将含有l-色氨酸(200mg/l)的lb液体培养基100ml装于500ml的三角瓶中，调节液体培养基的ph为7.0，121℃灭菌，20min后，按1％(v/v)接种量接种处于对数生长期的cdl29后，置于28℃，200r·min^-1摇床培养，在培养的阶段，不定时的采取培养液，按定量测定的方法测定产iaa的量。结果如图2所示，表明在22.5h菌体的生长达到稳定期，在45h培养液中菌体分泌的iaa浓度达到最大值为107.74mg/l，此时菌体处于稳定生长，od值最大。

将上述培养基中添加不同浓度重金属，2.5mg/kg镉、300mg/kg铜，700mg/kg铅和400mg/kg锌，在培养的阶段，不定时的采取培养液，按定量测定的方法测定产iaa的量。结果如图3所示，表明该菌株在重金属镉、铜、铅、锌，浓度分别为(2.5、300、700、400mg/kg)的条件下，能够进行生长，并分泌iaa最高可分别达110.60mg/l、102.31mg/l、112.48mg/l以及42.06mg/l。

实施例3：不同重金属污染土壤，菌株对小麦苗的促生效应

小麦种子预先酒精灭菌处理后，放入盛有少许蒸馏水的培养皿中并放入培养箱催芽处理，待种子发芽后点种到装有40g土的50ml离心管中培养，培养时间为20d。所选土壤为多重重金属复合，其中镉不同程度污染的两种土壤，分别为a土、b土，具体土壤性质如下表1：

表1两种土壤的基本性质及重金属元素含量

设置4个处理，三个重复，分别为：不接菌处理a土(ml)、接菌处理a土(ml+b)、不接菌处理b土(jn)、接菌处理b土(jn+b)。点种后接菌5ml(1.38×10¹¹cfu)，第10d时接菌2ml(5.51×10¹⁰cfu)，大约为4.83×10⁹cfu/克土。

菌株cdl29对两种土壤中小麦苗生长的促生效果如图4所示。用根系扫描(根系扫描仪型号为la1600+，canada；分析软件为winrhizo2003b)测定小麦苗根系的株高、鲜重、根长、根表面积、根体积和根尖数(表2)。

结果表明，重金属镉污染的两种土壤，相比于未接菌的ml土和jn土，菌株cdl29的添加，均能明显促进小麦苗株高和生物量的增加，并能促进根系的生长，增加根尖数，促进小麦苗生根，缓解重金属镉对小麦生长的毒害及胁迫。

对比酸性土和碱性土，发现菌株cdl29的添加对偏酸性的jn土的镉毒害缓解作用更大，说明偏酸性条件，菌株cdl29的添加更能显著促进小麦苗的生长，降低重金属镉的毒害。

表2菌株cdl29对小麦苗生长及根系形态的影响(平均值±标准误，n＝3)