一种制备3-(2-噻吩基)-L-丙氨酸的方法与流程

本发明属于多肽合成领域，具体涉及一种制备3-(2-噻吩基)-l-丙氨酸的方法。

背景技术

3-(2-噻吩基)-l-丙氨酸是一种重要的氮、硫杂环化合物，其衍生物具有良好的抗癌、抗疟疾、抗菌、抗氧化及抗病毒等多种生物活性，被广泛用于药物分子的研发和筛选，属于杂环非天然氨基酸，主要用于多肽合成、医药化工等领域，可以作为细菌培养的常用抑制剂，在肿瘤化学治疗的研究方面，研究带有噻吩基氨基酸的抗代谢物是一个新的研究方向。

目前现有技术中，非天然氨基酸3-(2-噻吩基)-l-丙氨酸的制备方法路线为2类：1、化学合成3-(2-噻吩基)-l-丙氨酸，2-噻吩甲醛转化为氯甲基衍生物，然后与n-保护的氨基丙二酸二乙酯偶联，形成的二乙基酯碱性水解产生n-保护的氨基丙二酸，其在沸腾的甲苯中脱羧。在最后步骤中，除去保护基团，得到3-(2-噻吩基)-dl-丙氨酸，然后在解氨酶(pal)的作用下，分离得到相应的l型丙烯酸酯，l型丙烯酸酯在氨水和pal的作用下，离子交换树脂分离提取，得到3-(2-噻吩基)-dl-丙氨酸(paizs，csaba；katona，adrian；retey，janoschemistry-aeuropeanjournal，2006，vol.12，#10p.2739-2744)。2、将2-噻吩甲醇通过羟基酰氯化做成氯甲基噻吩，再经过和金属钠和乙醇和乙酰氨基丙二酸二乙酯混合合成，再加入酰化酶拆分得到3-(2-噻吩基)-l-丙氨酸。这些方法工艺繁琐，使用溶剂量大，且成本高，不适宜商业化生产。

技术实现要素：

本发明目的在于克服现有工艺中存在的繁琐性、成本高、收率低等技术问题，提供一种非天然氨基酸3-(2-噻吩基)-l-丙氨酸的制备方法，该方法简单易控制、成本低、使用溶剂少，污染小，适宜于规模化生产。

为了达到上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

一种制备杂环非天然氨基酸3-(2-噻吩基)-l-丙氨酸的方法，包括以下步骤：

(1)将海因、2-噻吩甲醛在惰性气体保护下在催化剂和水的存在下发生缩合反应，得到2-噻吩亚海因；

(2)将所述2-噻吩亚海因在惰性气体保护下在碱和水的存在下发生水解反应，得到2-噻吩丙酮酸反应液；

(3)向步骤(2)得到的2-噻吩丙酮酸反应液中加入水、l-天冬氨酸，在l-天冬氨酸转氨酶(ast)的作用下发生酶转化反应，得到3-(2-噻吩基)-l-丙氨酸。

本发明反应式如下：

步骤(1)中，所述催化剂为乙醇胺、正丙醇胺、异丙醇胺或正丁醇胺，优选为乙醇胺。2-噻吩甲醛、海因和催化剂的摩尔比为1∶(1.00～1.50)∶(0.02～0.50)，优选1∶(1.05～1.10)∶(0.05～0.20)，更优选1∶1.05∶0.08。

步骤(1)包括以下步骤：将海因、催化剂和水混合，得到混合溶液，在惰性气体保护下于10～20℃向所述混合溶液中滴加2-噻吩甲醛，加毕在80～90℃反应直至溶液中不存在2-噻吩甲醛，然后再在95～105℃反应，得到2-噻吩亚海因。

优选地，在惰性气体保护下于10～15℃向所述混合溶液中滴加2-噻吩甲醛。

步骤(1)中，在80～90℃反应2～4h，在95～105℃反应0.5～2h。优选地，在85℃反应3h，在95～100℃反应1h。

步骤(2)中，所述碱为氢氧化钠或氢氧化钾，优选为氢氧化钠。2-噻吩亚海因和碱的摩尔比为1∶(1.0～10.0)，优选1∶(2.0～4.0)，更优选1∶(2.0～3.0)。

步骤(2)包括以下步骤：将所述2-噻吩亚海因在惰性气体保护下在碱和水的存在下在85～95℃反应直至溶液中不存在2-噻吩亚海因，然后再在100～105℃反应，得到反应液。

步骤(2)中，在85～95℃反应3-6h，在100～105℃反应0.5～2h。优选地，在85～90℃反应4～5h，在100℃反应1h。

步骤(3)中，2-噻吩亚海因和l-天冬氨酸的摩尔比为1∶(1.00～1.50)，优选1∶(1.05～1.20)，更优选为1∶1.1。酶转化反应的反应温度为30～40℃，优选30～32℃。

步骤(3)包括以下步骤：向步骤(2)得到的反应液中加入水、l-天冬氨酸，调节ph值，再加入含有l-天冬氨酸转氨酶的发酵菌体，进行酶转化反应，反应结束后用离子交换树脂提取，浓缩、结晶得到3-(2-噻吩基)-l-丙氨酸。

步骤(3)中，所述的发酵菌体为发酵液或冷冻菌泥，产酶的菌为大肠杆菌(escherichiacolt)。发酵培养温度为35～37℃，时间20～24h，种子液接种量为5～10％，镜检饱满，od值为0.4～0.6，酶活：0.5-0.6umol/(ml.min)。冷冻菌泥要高速离心或者絮凝，才能保存。

所述的l-天冬氨酸转氨酶的酶活定义为：每ml发酵液每分钟催化底物生成1μmol产物计所需酶量称为一个酶活单位(u)，1u＝1umol/(ml.min)。

当所述的发酵菌体为发酵液时，反应液(即2-噻吩海因、l-天冬氨酸和水调节ph值之后的溶液)体积与发酵液体积比为1∶(0.5～5)，优选1∶1。

步骤(3)中，所述调节ph值为：使用氢氧化钠水溶液调节ph值至7～10，优选8.0～9.0。所述氢氧化钠水溶液优选为10wt％的氢氧化钠水溶液。

步骤(3)中，所述离子交换树脂为强酸或强碱型离子交换树脂，优选jk008强酸型离子交换树脂。

步骤(1)和步骤(2)所述惰性气体优选为氮气。

有益效果：本发明制备方法简单易控制，降低了了工艺繁琐性，降低了成本，缩短了周期，适用于大规模生产，本发明制得3-(2-噻吩基)-l-丙氨酸收率高，降低副产物的含量，生产成本低，使用溶剂少，污染小，大幅度提高生产过程的安全性，提高产品的品质。

附图说明

图1为本发明产物的hplc图谱；

图2为本发明产物的核磁图谱。

具体实施方式

下面结合具体实例对本发明进行详细的描述，但他们不是对本发明的进一步限制。以下实施例所用jk008强酸型离子交换树脂购自上海华震科技有限公司。

实验所用主要检测仪器：

1、agilent1260infinity

2、检验条件：色谱柱：4.6*250mmods柱

3、检测波长：210nm

4、流动相：

a：0.20％(质量百分浓度)磷酸二氢钾溶液

b：0.05％(质量百分浓度)三氟乙酸乙腈混合溶液

5、流速：1.0ml/min

6、柱温：室温。

实施例1

含有l-天冬氨酸转氨酶的发酵液的制备：

具体发酵条件为：产酶的菌为大肠杆菌(escherichiacolt，atcc11303)，1.5％葡萄糖，0.6％蛋白胨，0.1％牛肉膏，2％玉米浆，0.05％氯化钠，0.05％硫酸镁，0.05％硫酸铵。用氢氧化钠溶液调节ph为7.5～7.7，种子液接种量为5～10％(v/v)，于160转/min条件下，35～37℃培养20～24h，镜检饱满，od值为0.4～0.6，酶活：0.5-0.6umol/(ml.min)。该酶为胞内酶，不需破壁，发酵完毕直接使用含有菌体的发酵液，也可以离心保存后使用。

实施例2

(1)在带有搅拌、通气和回流装置的1000ml四口烧瓶中加入500ml水，之后加入100g(1mol)海因和5g(0.08mol)乙醇胺，充分搅拌，通氮气保护，水浴保温10～15℃，滴加入106g(0.95mol)2-噻吩甲醛，2小时滴加完毕，滴完结束后升温至85℃，保温3小时，检测溶液中无2-噻吩甲醛，继续升温至95℃，保温1小时，降温到室温，抽滤，少量水洗涤，干燥得到175.2g2-噻吩亚海因(产率95.5％，纯度99.4％)；

(2)在带有搅拌、通气和回流装置的1000ml四口烧瓶中加入500ml水，之后加入50g(0.26mol)2-噻吩亚海因和24g(0.6mol)氢氧化钠，充分搅拌，在氮气保护下升温至90℃保温水解反应4-5h，反应过程中检测2-噻吩亚海因基本消失，继续升温到至100℃，保温1小时，迅速降温到室温待用；

(3)将上步骤反应溶液迅速加入500ml水和39.3g(0.29mol)l-天冬氨酸，使用10wt％氢氧化钠水溶液调节ph值到8.0～9.0，再加入含有500ml实施例1制备得到的含有l-天冬氨酸转氨酶的发酵液，在30～32℃进行酶转化反应，反应结束后用jk008型离子交换树脂提取，浓缩、结晶得到29.8g3-(2-噻吩基)-l-丙氨酸(产率67.7％，以2-噻吩亚海因计)。

(4)通过hplc、旋光、nmr对样品进行分析，hplc：99.73％(hplc图谱见图1)，旋光：-31.5°(c＝1％inh2o)，nmr(核磁图谱见图2)符合要求，即为3-(2-噻吩基)-l-丙氨酸。

实施例3

(1)在带有搅拌、通气和回流装置的1000ml四口烧瓶中加入500ml水，之后加入100g(1mol)海因和5.5g(0.073mol)正丙醇胺，充分搅拌，通氮气保护，水浴保温10～15℃，滴加入106g(0.95mol)2-噻吩甲醛，2小时滴加完毕，滴完结束后升温至85℃，保温3小时，检测溶液中无2-噻吩甲醛，继续升温至95℃，保温1小时，降温到室温，抽滤，少量水洗涤，干燥得到171.2g2-噻吩亚海因(产率92.7％，纯度99.2％)；

(2)在带有搅拌、通气和回流装置的1000ml四口烧瓶中加入500ml水，之后加入50g(0.26mol)2-噻吩亚海因和30g(0.75mol)氢氧化钠，充分搅拌，在氮气保护下升温至90℃保温水解反应，反应过程中检测2-噻吩亚海因基本消失，继续升温到至100℃，保温1小时，迅速降温到室温待用；

(3)将上步骤反应溶液迅速加入500ml水和39.3g(0.29mol)l-天冬氨酸，使用10wt％氢氧化钠水溶液调节ph值到8.0～9.0，再加入含有1000ml实施例1制备得到的含有l-天冬氨酸转氨酶的发酵液，在30～32℃进行酶转化反应，反应结束后用001*7型离子交换树脂提取，浓缩、结晶得到29.5g3-(2-噻吩基)-l-丙氨酸(产率67.0％，以2-噻吩亚海因计)。

(4)通过hplc、旋光、nmr对样品进行分析，hplc：99.50％，旋光：-31.3°(c＝1％inh2o)，nmr符合要求，即为3-(2-噻吩基)-l-丙氨酸。

实施例4

(1)在带有搅拌、通气和回流装置的1000ml四口烧瓶中加入500ml水，之后加入100g(1mol)海因和5.9g(0.08mol)正丁醇胺，充分搅拌，通氮气保护，水浴保温10～15℃，滴加入106g(0.95mol)2-噻吩甲醛，2小时滴加完毕，滴完结束后升温至85℃，保温3小时，检测溶液中无2-噻吩甲醛，继续升温至95℃，保温1小时，降温到室温，抽滤，少量水洗涤，干燥得到170.8g2-噻吩亚海因(纯度99.3％)；

(2)在带有搅拌、通气和回流装置的1000ml四口烧瓶中加入500ml水，之后加入50g2-噻吩亚海因(0.26mol)和24g(0.6mol)氢氧化钠，充分搅拌，在氮气保护下升温至85℃保温水解反应，反应过程中检测2-噻吩亚海因基本消失，继续升温到至100℃，保温1小时，迅速降温到室温待用；

(3)将上步骤反应溶液迅速加入500ml水和39.3g(0.29mol)l-天冬氨酸，使用10wt％氢氧化钠水溶液调节ph值到8.0～9.0，再加入含有500ml实施例1制备得到的含有l-天冬氨酸转氨酶的发酵液，在30～32℃进行酶转化反应，反应结束后用jk008型离子交换树脂提取，浓缩、结晶得到29.2g3-(2-噻吩基)-l-丙氨酸(产率66.3％，以2-噻吩亚海因计)。

(4)通过hplc、旋光、nmr对样品进行分析，hplc：99.61％，旋光：-31.6°(c＝1％inh2o)，nmr符合要求，即为3-(2-噻吩基)-l-丙氨酸。

实施例5

(1)在带有搅拌、通气和回流装置的1000ml四口烧瓶中加入500ml水，之后加入100g(1mol)海因和5.5g异丙醇胺，充分搅拌，通氮气保护，水浴保温10～15℃，滴加入106g(0.95mol)2-噻吩甲醛，2小时滴加完毕，滴完结束后升温至85℃，保温3小时，检测溶液中无2-噻吩甲醛，继续升温至95℃，保温1小时，降温到室温，抽滤，少量水洗涤，干燥得到170.8g2-噻吩亚海因(纯度99.2％)；

(2)在带有搅拌、通气和回流装置的1000ml四口烧瓶中加入500ml水，之后加入50g2-噻吩亚海因(0.26mol)和24g(0.6mol)氢氧化钠，充分搅拌，在氮气保护下升温至85℃保温水解反应，反应过程中检测2-噻吩亚海因基本消失，继续升温到至100℃，保温1小时，迅速降温到室温待用；

(3)将上步骤反应溶液迅速加入1000ml水和39.3g(0.29mol)l-天冬氨酸，使用10wt％氢氧化钠水溶液调节ph值到8.0～9.0，再加入含有500ml实施例1制备得到的含有l-天冬氨酸转氨酶的发酵液，在30～32℃进行酶转化反应，反应结束后用jk008型离子交换树脂提取，浓缩、结晶得到29.5g3-(2-噻吩基)-l-丙氨酸(产率67.0％，以2-噻吩亚海因计)。

(4)通过hplc、旋光、nmr对样品进行分析，hplc：99.65％，旋光：-31.2°(c＝1％inh2o)，nmr符合要求，即为3-(2-噻吩基)-l-丙氨酸。

实施例6

与实施例1相同，区别仅在于：

步骤(1)中，2-噻吩甲醛、海因和乙醇胺的摩尔比为1∶1.00∶0.02。在氮气保护下于15～20℃向所述混合溶液中滴加2-噻吩甲醛。加毕在80℃反应直至溶液中不存在2-噻吩甲醛，然后再在100℃反应2小时。

步骤(2)中，碱为氢氧化钾，2-噻吩亚海因和碱的摩尔比为1∶1.0。在95℃反应直至溶液中不存在2-噻吩亚海因，然后再在105℃反应2小时。

步骤(3)中，2-噻吩亚海因和l-天冬氨酸的摩尔比为1∶1.00，酶转化反应的反应温度为38～40℃。

得到3-(2-噻吩基)-l-丙氨酸，其nmr与实施例1终产物一致。

实施例7

与实施例1相同，区别仅在于：

步骤(1)中，2-噻吩甲醛、海因和乙醇胺的摩尔比为1∶1.50∶0.50。加毕在90℃反应直至溶液中不存在2-噻吩甲醛，然后再在105℃反应0.5小时。

步骤(2)中，2-噻吩亚海因和氢氧化钠的摩尔比为1∶10.0。

步骤(3)中，2-噻吩亚海因和l-天冬氨酸的摩尔比为1∶1.50，酶转化反应的反应温度为33～35℃。

得到3-(2-噻吩基)-l-丙氨酸，其nmr与实施例1终产物一致。

对比例1

(1)在带有搅拌和回流装置的1000ml四口烧瓶中加入500ml水，之后加入100g海因和5g乙醇胺，充分搅拌，水浴保温80～85℃，滴加入106g2-噻吩甲醛，2小时滴加完毕，滴完结束后85℃保温3小时，检测溶液中无2-噻吩甲醛，继续升温至95℃，保温1小时，降温到室温，抽滤，少量水洗涤，干燥，得到101.8g2-噻吩亚海因(纯度40.2％)。

对比例2

与实施例1相同，区别仅在于：

步骤(2)没有使用氮气保护。

得到3-(2-噻吩基)-l-丙氨酸10.8g(产率12.3％，以2-噻吩亚海因计)，hplc：50.20％。