本发明属于病毒分子检测技术领域，具体涉及一种罗非鱼细小病毒tipv及pcr检测引物及应用。
技术背景
细小病毒(rhabdovirus)是目前为止发现的最小的单股dna病毒，病毒粒子直径为18～30nm的二十面体，无囊膜，等轴对称。细小病毒在自然界分布极广，可以感染人、脊椎动物及无脊椎动物，并与多种疾病相关。其中人类细小病毒b19(humanparvovirusb19,b19)为人所熟知，能引起幼儿一系列严重的自身免疫性疾病，孕期感染会导致胎儿水肿、流产或先天性感染，对新生儿及幼儿危害较大，引起了世界范围的广泛关注。因此，对细小病毒进行深入研究具有重要意义。此外，细小病毒还能引起家畜多种急性传染病，如犬细小病毒，猪博卡病毒，鹅细小病毒病等。国际病毒分类委员会(internationalcommitteeontaxonomyofviruses,ictv)于2014年发表了最新的病毒分类报告，将细小病毒科(pavoviradae)划分为8个属:amdoparvovirus、aveparvovirus、bocaparvovirus、copiparvovirus、dependoparvovirus、erythroparvovirus、protoparvovirus、tetraparvovirus。目前划分的细小病毒属中未出现鱼类感染细小病毒的相关报道，本申请专利中新鉴定的罗非鱼细小病毒属于新病毒，造成我国罗非鱼在短时间内大量死亡，对我国罗非鱼的养殖和出口带来巨大的经济损失。
本申请人曾在罗非鱼中分离过细小病毒，但该病毒未使得罗非鱼有明显发病症状；而本发明公开的细小病毒可致罗非鱼眼珠、鳃盖、下颌和腹部有明显的出血症状。因此基于本发明提供的病毒及其设计的检测引物更具备实际意义，对监测养殖罗非鱼的健康状况显得尤为重要。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供了一种罗非鱼细小病毒tipv，所述的病毒来自患病罗非鱼肾脏组织，该病毒已于2018年9月20日送至中国典型培养物保藏中心进行保藏，分类命名：罗非鱼细小病毒(tilapiaparvovirus)tipv，保藏编号：cctccno：v201856，地址：中国武汉武汉大学。
本发明的另一个目的在于提供了罗非鱼细小病毒tipv的特异性基因序列(seqidno.1所示)，利用该序列与其他病毒的序列的差异设计引物，可用于检测罗非鱼细小病毒tipv。
本发明还有一个目的在于提供一种罗非鱼细小病毒tipvpcr检测引物，所述的引物为f1：5'-tatccagtcccgacctactcaaa-3'，r1：5'-agttaaaactaatcgcgttcttccc-3'；f2：5'–cacgttaagggcgtatcgtgtaa-3'，r2：5'-tatctgctgctgttggtgttggt-3'。
本发明还有一个目的在于提供了罗非鱼细小病毒tipv的应用，所述的应用包括利用该病毒制备成罗非鱼细小病毒病疫苗，或是制备成罗非鱼细小病毒的实验室对照品。
本发明的最后一个目的在于提供一种罗非鱼细小病毒tipvpcr检测引物的应用，包括利用所述的应用制备成罗非鱼细小病毒检测试剂盒。
为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：
一种罗非鱼细小病毒tipv，所述的病毒分离自罗非鱼肾脏病变细胞，该病毒已于2018年9月20日送至中国典型培养物保藏中心进行保藏，分类命名：罗非鱼细小病毒(tilapiaparvovirus)tipv，保藏编号：cctccno：v201856，地址：中国武汉武汉大学
将罗非鱼细小病毒tipv接种到罗非鱼肾细胞系(tilapiakidney,tik)单层，25℃培养7天，产生细胞病变效应(cpe)，可见tik细胞收缩变圆、折光度增加，部分细胞开始脱落，细胞单层开始破裂。
培养基：m199，10％胎牛血清，ph7.0～7.2。
罗非鱼细小病毒tipv的形态特征：病毒呈球形，病毒无囊膜，与典型的细小病毒形态相符。
罗非鱼细小病毒tipv的应用，所述的应用包括利用该病毒制备成罗非鱼细小病毒病疫苗，或是制备成罗非鱼细小病毒的实验室对照品。
本发明的保护内容还包括罗非鱼细小病毒tipv的特异性基因序列，所述的全序列为seqidno.1所示；还包括基于罗非鱼细小病毒tipv的特异性基因序列其他病毒的基因序列的差异设计的引物。
一种罗非鱼细小病毒tipvpcr检测引物，包括f1：5'-tatccagtcccgacctactcaaa-3'，r1：5'-agttaaaactaatcgcgttcttccc-3'；f2：5'–cacgttaagggcgtatcgtgtaa-3'，r2：5'-tatctgctgctgttggtgttggt-3'。
一种罗非鱼细小病毒tipvpcr检测引物或seqidno.1所示序列的应用，包括利用上述引物或序列制备成用于检测罗非鱼细小病毒检测试剂盒，或直接用于罗非鱼细小病毒的检测。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
1.本发明自患病罗非鱼中分离了具有致病力的细小病毒，对于罗非鱼细小病毒的研究具备开拓性的意义。
2.本发明的方法快速简便：本发明所建的pcr方法只需数小时，相比较传统病毒分离方法数天时间，极大的提高了检测效率。
3.本发明的方法特异性强：两对引物对靶序列的特异序列区的识别，保证了pcr方法扩增的高度特异性。
具体实施方式
本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案，所用试剂或原料，如未特别说明，均购自商业渠道或是已公开。
实施例1：
一种罗非鱼细小病毒tipv，其分离过程如下：
1)将携带病毒的罗非鱼脾、肾等组织取出并碾磨后，培养基稀释100倍，2000rpm离心后取上清过滤，接种到罗非鱼肾脏细胞系(tilapiakidney,tik)单层，25℃培养7天，产生细胞病变效应(cpe)，可见tik细胞收缩变圆、折光度增加，部分细胞开始脱落，细胞单层开始破裂。
培养基：m199，10％胎牛血清，ph7.0～7.2
2)收集病变细胞，利用透射电镜进行形态学鉴定。
3)收集病毒，测序，获得罗非鱼细小病毒tipv的特异性基因，所述基因为seqidno.1所示。
罗非鱼细小病毒的形态特征：病毒呈球形，病毒无囊膜，与典型的细小病毒形态相符，该病毒已于2018年9月20日送至中国典型培养物保藏中心进行保藏，分类命名：罗非鱼细小病毒(tilapiaparvovirus，tipv)tipv，保藏编号：cctccno：v201856，地址：中国武汉武汉大学。
实施例2：
基于罗非鱼细小病毒tipv的特异性基因(seqidno.1所示)与其他病毒基因的差异设计的引物：
包括f1：5'-tatccagtcccgacctactcaaa-3'，r1：5'-agttaaaactaatcgcgttcttccc-3'；f2：5'–cacgttaagggcgtatcgtgtaa-3'，r2：5'-tatctgctgctgttggtgttggt-3'。
实施例3：
利用罗非鱼细小病毒tipvpcr检测引物对罗非鱼细小病毒的检测，方法包括：
1.罗非鱼组织或感染细胞总dna的提取：采用omega(usa)dna提取试剂盒提取组织dna。
2.聚合酶链式反应扩增：
采用25μl反应体系：pcr反应管中，加入10μm的引物f1、r1各加1μl，再加入2.5mmdntps2μl，25mmmgcl21.5μl，5utaq聚合酶0.5μl，模板dna1μl，10×thermopolreactionbuffer2.5μl，用灭菌双蒸水将体系均补齐至25μl，进行pcr反应。
以该反应产物为模板，取1μl，10μm的引物f2、r2各加1μl，再加入2.5mmdntps2μl，25mmmgcl21.5μl，5utaq聚合酶0.5μl，10×thermopolreactionbuffer2.5μl，用灭菌双蒸水将体系均补齐至25μl，进行pcr反应。
反应条件，95℃预变性5min；95℃30s、55℃30s、72℃30s，30个循环；72℃延伸10min，4℃保存。
f1：5'-tatccagtcccgacctactcaaa-3'；
r1：5'-agttaaaactaatcgcgttcttccc-3'；
f2：5'–cacgttaagggcgtatcgtgtaa-3'；
r2：5'-tatctgctgctgttggtgttggt-3'。
3.聚合酶链式反应扩增产物分析：
聚合酶链式反应扩增的最终反应产物取4μl，加入至含有0.5μg/ml溴化乙锭(eb)染料的2％的琼脂糖凝胶中，于100v电压下电泳30min，在凝胶成相系统上成像观察扩增产物的图谱。电泳图片显示325bp(多核苷酸为seqidno.1所示)特征性条带，则结果为阳性；如无任何条带，则结果为阴性。
实施例4：
罗非鱼细小病毒pcr检测引物特异性试验
利用实施例3所述的方法，对表1中的待检病毒样品进行检测，同时设置阴性对照组(双蒸水)和阳性对照组(tipv)，待检病毒样品具体为：大鲵虹彩病毒病毒(gsiv)，鲤疱疹病毒ii型(cyhv-2)，锦鲤疱疹病毒(khv)，鲤鱼浮肿病毒(cev)及罗非鱼罗湖病毒(tilv)。
表1罗非鱼细小病毒pcr检测试剂盒特异性试验
结果如表1所示，仅阳性对照组(tipv)可检测到325bp特征性条带，其余组均无特征条带，说明罗非鱼细小病毒tipvpcr检测引物具备很强的特异性。
实施例5：
罗非鱼细小病毒pcr检测引物的灵敏度
将浓度为1800ng/μl的tipvdna模板10倍梯度稀释，利用实施例3的方法，检测利用本发明提供的引物pcr的检测限，结果显示，105倍稀释还可检测到目的条带，也就是最低可检测18.00pg/μl的dna模板。
实施例6：
罗非鱼细小病毒tipvpcr检测引物在制备罗非鱼细小病毒检测试剂盒中的应用：
1.罗非鱼组织总dna的提取：采用omega(usa)试剂盒提取感染罗非鱼细小病毒tipv的罗非鱼的脾肾等内脏组织的总dna，将获得dna模板-20℃保存备用。
2.聚合酶链式反应扩增：
采用25μl反应体系：pcr反应管中，加入10μm的引物f1、r1各加1μl，再加入2.5mmdntps2μl，25mmmgcl21.5μl，5utaq聚合酶0.5μl，模板dna1μl，10×thermopolreactionbuffer2.5μl，用灭菌双蒸水将体系均补齐至25μl，进行pcr反应。
以该反应产物为模板，取1μl，10μm的引物f2、r2各加1μl，再加入2.5mmdntps2μl，25mmmgcl21.5μl，5utaq聚合酶0.5μl，10×thermopolreactionbuffer2.5μl，用灭菌双蒸水将体系均补齐至25μl，进行pcr反应。
反应条件，95℃预变性5min；95℃30s、55℃30s、72℃30s，30个循环；72℃延伸10min，4℃保存。
f1：5'-tatccagtcccgacctactcaaa-3'，r1：5'-agttaaaactaatcgcgttcttccc-3'；f2：5'–cacgttaagggcgtatcgtgtaa-3'，r2：5'-tatctgctgctgttggtgttggt-3'。
3.聚合酶链式反应扩增产物分析：
取聚合酶链式反应扩增的最终反应产物4μl，加入至含有0.5μg/ml溴化乙锭(eb)染料的2％的琼脂糖凝胶中，于100v电压下电泳30min，在凝胶成相系统上成像观察扩增产物的图谱。电泳图片显示325bp特征性条带，则结果为阳性；如无任何条带，则结果为阴性。
结果显示，阳性对照(6号)(罗非鱼细小病毒tipv)显示325bp特征性条带，阴性(水)对照(7号)无明显条带，1-5号感染了罗非鱼细小病毒tipv的罗非鱼组织样品显示325bp特征性条带，说明样品1-5为罗非鱼细小病毒阳性，与实际情况相符。
实施例7：
罗非鱼细小病毒tipv在制备罗非鱼细小病毒的实验室对照品中的应用：
即将本发明提供的罗非鱼细小病毒tipv作为对照品，将待确认的其他罗非鱼细小病毒与本发明的病毒进行生理生化上的比较，并且将待测样品跟seqidno.1所示序列进行比较。
序列表
<110>中国水产科学研究院长江水产研究所
<120>一种罗非鱼细小病毒tipv及pcr检测引物及应用
<160>5
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>325
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>1
cacgttaagggcgtatcgtgtaagctatttaatatgattccattacagactcaattagct60
attcaggggacaactacatttacaacttttaataatactatttatatgatgggatatagg120
gatagtatttatgaaacacccatatttgattggaattctaccagattgaaaggggcacga180
aatttacagggtttatattggaacccggtatttaaagagggggttacatttaatagggca240
ttgaatgtgccggtagtaagtacagggactaattggtggacatatccaataccatgcgta300
ccaccaacaccaacagcagcagata325
<210>2
<211>23
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>2
tatccagtcccgacctactcaaa23
<210>3
<211>25
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>3
agttaaaactaatcgcgttcttccc25
<210>4
<211>23
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>4
cacgttaagggcgtatcgtgtaa23
<210>5
<211>23
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>5
tatctgctgctgttggtgttggt23