一种调控杨树叶型发育基因及其应用的制作方法

本发明涉及一种调控杨树叶片发育的转录因子及其应用，尤其涉及一种调控杨树叶型发育基因及其应用，属于植物基因工程和生物技术领域。

背景技术：

杨树作为一种在世界范围广泛分布的经济树种，凭借其生长迅速、繁殖容易、木材用途广、适应性强的特点，成为我国最为著名的速生用材林和绿化树种，其栽培繁育工作历来受到重视。

近年来随着杨树基因组测序工作的完成，分子生物学技术也逐渐应用于杨树的遗传改良工作中。杨树品种繁多、枝繁叶茂、秋天落叶晚，使得其成为重要的行道树之一。树木冠型、花色、叶型、叶色及叶色的季节性变化等观赏特性成为城市绿化树种选择的重要指标。

中华红叶杨凭借其叶片颜色紫红鲜艳，成为一种绿化观赏与用材共用的新品种，随着城市、园林、道路绿化建设力度的加大，优良叶型速生杨的新品种选育工作成为城市园林绿化、城乡四旁绿化、通道绿化树种培育的重中之重。

植物叶片发育是植物枝条系统发育的关键，林木叶型、叶色及叶色的季节性变化等具有不同的视觉效果，可形成不同的视觉景观，在庭院观赏、园艺配置、巷道绿化中具有不同的审美价值。

近十几年来，以模式植物拟南芥为材料，植物叶片发育的机理研究取得了较大的进展，从而对林木的育种改良提供了许多有益的启发。叶片发育起始于顶端分生组织(sam)，而拟南芥i类knox基因通过调控茎尖分生组织的活性，进而影响侧生器官特别是叶片原基的形成和发育，其过量表达会使转基因植株叶片的形态发生明显变化。从而，研究i类knox基因与叶片发育的关系，对于具有观赏价值和景观生态价值的杨树新品种的培育及生产均具有重要的价值和意义。

已有研究证明，拟南芥、玉米和烟草叶片形成过程中，knox基因异常表达，可调控叶原基母细胞的分裂、分化能力，导致叶片表型变异，说明knox基因与复杂叶形的产生有关。植物knox基因家族被分为两个亚类：i类knox基因和ii类knox基因，拟南芥中i类knox基因包含4个成员，分别是：shootmeristemless(stm)、brevipedicellus(bp)、knotted-likefromarabidopsisthaliana2(knat2)以及knat6。i类knox基因在植物分生组织建成及功能维持中起关键作用，是植物分生组织启动和器官发生的重要调控因子。但目前杨树中仅完成了对拟南stm、bp同源基因arborknox1(ark1)、arborknox2(ark2)功能的初步研究，认为它们参与调控木本植物形成层的分化，而杨树中i类knox基因其他成员的功能尚不清楚。杨树i类knox基因(knox1在杨树中的同源基因)遗传转化烟草、矮牵牛、香石竹、鸡冠花等花卉植物，均在叶型等形态上表现出一系列新颖奇特的观赏叶型。

目前在木本植物中，叶型发育的新品种培育鲜有报道。因此，利用木本植物为研究对象，结合分子生物学和基因工程技术，解析杨树pagknat2/6b调控叶型发育，以及通过分子育种增加杨树叶型多样性，培育杨树绿化新品种具有重要意义。

技术实现要素：

针对现有技术中存在的不足，本发明的主要目的是提供一种调控杨树叶型发育的基因pagknat2/6b。

一种调控杨树叶型发育基因，命名为pagknat2/6b基因，其核苷酸序列如序列表中的序列1所示。

本发明的另一目的是提供一种调控杨树叶型发育基因的表达蛋白。

一种调控杨树叶型发育基因的表达蛋白，其氨基酸序列如序列表中序列2所示。

本发明的另一目的是提供一种调控杨树叶型发育基因的克隆方法。

一种调控杨树叶型发育基因的克隆方法，其步骤如下：

(1)以84k(p.albaxp.glandulosa)银腺杨为材料，使用rneasyplantmini试剂盒和rnase-freednasei试剂盒(qiagen，hilden，germany)提取rna；

(2)通过使用superscriptiiifirst-strandsynthesissystem(lifetechnologies，carlsbad，ca，usa)合成cdna第一链，使用primer5软件设计引物(扩增子包含起始密码子及终止密码子)，进行基因全长扩增(引物中引入gateway接头)；

其中，pagknat2/6borf正向引物见序列表中序列3；

pagknat2/6borf反向引物见序列表中序列4；

(3)高保真pcr反应体系如下：takara高保真扩增酶primestar，正向引物，反向引物，模板为84k杨cdna，无菌ddh2o补足；反应程序：预变性95℃，5min；95℃，20s；56℃，20s；68℃，60s，28个循环；68℃10min；

最终获得基因全长cdna序列为942bp，命名为pagknat2/6b基因。

本发明的另一目的是提供一种调控杨树叶型发育的基因pagknat2/6b的构建方法。

一种调控杨树叶型发育基因的植物表达载体的构建方法，其步骤如下：

(1)利用克隆技术构建pagknat2/6b基因的过量表达载体，使用特异pcr引物(pagknat2/6borf引物)，以84kcdna为模板，进行pcr扩增，将pagknat2/6b基因orf构建到入门载体，入门载体为pdnor207，序列如序列表中序列5所示；

反应体系为新鲜pcr产物；pdnor207载体；bpclonaseⅱ混合酶；无菌ddh2o补足；反应程序为：25℃反应大于5h；

(2)从筛选培养板上挑取阳性克隆进行pcr检测及测序验证，将带有pagknat2/6b基因的入门载体通过mlui限制性内切酶线性化后，gateway体系构建至植物表达载体pmdc32，序列如序列表中序列6所示；

进行lr反应，反应体系为：线性化条目克隆；纯化目的载体；lrclonaseⅱ混合酶；无菌ddh2o补足；反应条件：25℃反应大于5h；lr反应后，pagknat2/6b基因导入植物表达载体pmdc32中，在pagknat2/6b基因的5’端组装成强表达启动子35s，能使pagknat2/6b基因在杨树体内高效表达；在pagknat2/6b基因的3’端组装成强终止子nos，有效终止pagknat2/6b基因的转录；

(3)在载体上组装潮霉素磷酸转移酶hpt，作为转基因杨树的筛选标记，可以用潮霉素进行转基因杨树的筛选；在载体上组装lb和rb序列，促使组装于其间的pagknat2/6b基因表达框架和筛选标记基因hpt整合至杨树受体染色体中，通过pcr检测及测序验证，确认过量表达载体构建成功，命名为pmdc32-pagknat2/6b。

本发明的另一目的是提供一种调控杨树叶型发育基因的遗传转化。

一种调控杨树叶型发育基因的遗传转化，其步骤如下：

通过电击法，将所构建的pmdc32-pagknat2/6b过量表达载体转入农杆菌gv3101中，通过农杆菌介导，将pagknat2/6b基因转入杨树。

本发明的另一目的是提供一种调控杨树叶型发育的基因pagknat2/6b的应用。

所述的调控杨树叶型发育基因pagknat2/6b在调控杨树叶片发育过程中的应用。

有益效果：

本发明以84k银腺杨为材料，克隆了pagknat2/6b基因；同时，构建至过量表达载体pmdc32，该基因位于启动子p35s之后，在启动子p35s的驱动下，pagknat2/6b可在杨树体内过量表达，从而调控杨树叶型的发育，其中，pagknat2/6b基因是调控杨树叶型发育的关键基因。

下面结合附图和具体实施方式对本发明做进一步说明，但并不意味着对本发明保护的范围的限制。

附图说明

图1是本发明植物表达载体pmdc32-pagknat2/6b的结构示意图。

图2-1是本发明过量表达pagknat2/6b的转基因杨树的转录水平半定量检测图。

图2-2是本发明过量表达pagknat2/6b的转基因杨树的转录水平实时定量检测图。

图3-1是未转基因杨树(84k)与本发明转基因杨树(oe5、oe7)土培苗生长第一个月的表型比较图。

图3-2是未转基因杨树(84k)与本发明转基因杨树(oe5、oe7)土培苗生长第三个月的表型比较图。

图4-1是一个月土培苗的未转基因杨树(84k)与本发明转基因杨树(oe5、oe7)叶片图。

图4-2是一个月土培苗的未转基因杨树(84k)与本发明转基因杨树(oe5、oe7)叶片大小统计图。

图5-1是本发明过量表达pagknat2/6b的转基因杨树与未转基因杨树，一个月土培苗第4片展开叶叶片透明图。

图5-2是本发明过量表达pagknat2/6b的转基因杨树与未转基因杨树，一个月土培苗第4叶片背-腹面细胞大小比较图。

图6是未转基因杨树(84k)与本发明转基因杨树(oe5、oe7)土培苗第一个月与第4片叶子组织切片比较图。

图7是未转基因杨树(84k)与本发明转基因杨树(oe5、oe7)一年生土培苗平茬后表型比较图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明，以下实施例中未进行详细说明的操作可参照分子克隆，相关试剂盒使用说明的操作实现。

实施例1克隆pagknat2/6b基因

以84k(p.albaxp.glandulosa)银腺杨为材料，使用rneasyplantmini试剂盒和rnase-freednasei试剂盒(qiagen，hilden，germany)提取一个月土培苗总rna，每个样品取约1.0μgrna，通过使用superscriptiiifirst-strandsynthesissystem(lifetechnologies，carlsbad，ca，usa)合成cdna第一链，参考已发表的毛果杨基因组序列，使用primer5软件设计引物(扩增子包含起始密码子及终止密码子)，进行基因全长扩增(引物中引入gateway接头)；

其中，pagknat2/6borf正向引物如序列表中序列3所示，见下表1；

表1

pagknat2/6borf反向引物序列如序列表中序列4所示，见下表2；

表2

高保真pcr反应体系如下：takara高保真扩增酶primestar12.5μl，正向引物(10μm)1μl，反向引物(10μm)1μl，模板(84k杨cdna)100ng，无菌ddh2o补足至25μl；反应程序：预变性95℃，5min；95℃，20s；56℃，20s；68℃，60s，28个循环；68℃10min；

最终获得基因全长cdna序列为942bp，命名为pagknat2/6b基因，序列如序列表中序列1所示，见下表3；

表3

其所编译表达蛋白序列如序列表中序列2所示，见下表4；

表4

实施例2pagknat2/6b基因植物表达载体构建

利用克隆技术构建pagknat2/6b基因的过量表达载体，使用特异pcr引物(实施例1的pagknat2/6borf引物)，以84kcdna为模板，进行pcr扩增，将pagknat2/6b基因orf构建到入门载体，入门载体为pdnor207，序列如序列表中序列5所示，见下表5；

表5

反应体系为freshpcrproduct(新鲜pcr产物)150ng；pdnor207vector(载体)75ng；bpclonase(克隆酶)ⅱenzymemix(混合酶)0.8μl；无菌ddh2o补足至4μl；反应程序为：25℃反应大于5h。

从筛选培养板上挑取阳性克隆进行pcr检测及测序验证，将带有pagknat2/6b基因的入门载体通过mlui限制性内切酶线性化后，gateway体系构建至植物表达载体pmdc32，序列如序列表中序列6所示，见下表6；

表6

进行lr反应，反应体系为：linearizedentryclone(线性化条目克隆)75ng；purifieddestinationvector(纯化目的载体)150ng；lrclonase(克隆酶)ⅱenzymemix(混合酶)0.8μl；无菌ddh2o补足4μl；反应条件：25℃反应大于5h；lr反应后，pagknat2/6b基因导入植物表达载体pmdc32中，在pagknat2/6b基因的5’端组装成强表达启动子35s，能使pagknat2/6b基因在杨树体内高效表达；在pagknat2/6b基因的3’端组装成强终止子nos，可有效终止pagknat2/6b基因的转录，如图1所示，为本发明的植物表达载体pmdc32-pagknat2/6b的结构，其中，自顶端左旋起，分别是强终止子nos，对潮霉素的耐药性，对卡那霉素的耐药性，pbr332端子，2*35s强表达启动子。

在载体上组装潮霉素磷酸转移酶hpt，作为转基因杨树的筛选标记，可以用潮霉素进行转基因杨树的筛选；在载体上组装lb和rb序列，促使组装于其间的pagknat2/6b基因表达框架和筛选标记基因hpt整合至杨树受体染色体中，通过pcr检测及测序验证，确认过量表达载体构建成功，命名为pmdc32-pagknat2/6b。该基因位于启动子35s之后，在启动子35s的驱动下，pagknat2/6b基因可在杨树体内高效表达。

实施例3pagknat2/6b基因的遗传转化

通过电击法，将所构建的pmdc32-pagknat2/6b过量表达载体转入农杆菌gv3101中，通过农杆菌介导，将pagknat2/6b基因转入杨树(银腺杨，84k杨，下同)，转化步骤如下：用于遗传转化的杂交杨克隆84k组培苗在培养温度为23-25℃、光照为16/8h(白天/黑夜)、光照强度为50μmm^-2s^-1的条件下培养，含有pmdc32-pagknat2/6b表达载体的农杆菌在od600＝0.6～0.8时侵染84k叶盘，侵染后的叶盘在不定芽诱导培养基(sim，murashige-skoog(ms)基本培养基中添加0.5mg/l6-benzylaminopurine(6-ba，6-苄基氨基嘌呤)和0.05mg/lnaphthaleneaceticacid(naa，萘乙酸))，在温度为23±2℃的黑暗条件下共培养3-4天；共培养后的叶盘转移至含有3mg/lhygromycinb(潮霉素b)和200mg/ltimentin(特美汀)的sim上，在培养温度为23-25℃、光照为16/8h(白天/黑夜)、光照强度为50μmm^-2s^-1的条件下诱导和筛选抗性不定芽；经过约20天的诱导培养，将抗性不定芽转移至含有3mg/lhygromycinb和200mg/ltimentin的生根培养基中(rim，1/2ms基本培养基添加0.05mg/liba(吲哚丁酸)和0.02mg/lnaa)，直至诱导出不定根；提取已生根植株叶片dna，pcr验证。

实施例4pagknat2/6b基因的应用

利用农杆菌介导的叶盘法(liuetal.,2014a)对84k杨进行遗传转化，用于遗传转化的84k组培苗在温度为23-26℃、光照条件为16h光照/8h黑暗、光照强度为50μm·m^-2·s^-1的培养室培养，用含有35s:ptgrf1/2d且od600＝0.6-0.8的农杆菌侵染84k杨叶盘法，侵染后的叶盘在不定芽诱导培养基sim，即murashige-skoog(ms)基本培养基添加0.5mg/l6-ba(6-benzylaminopurine)和0.05mg/lnaa(naphthaleneaceticacid)的培养基上，于24±2℃的温度条件下黑暗培养3天，暗培养后的叶盘转移至含有200mg/l特美汀(timentin)和3mg/l潮霉素b(hygromycinb)的sim培养基上，在培养温度为23-26℃、光照条件为16h光照/8h黑暗以及光照强度为50μm·m^-2·s^-1的条件下诱导并筛选抗性不定芽，经过一个月的诱导筛选培养后，即可将抗性不定芽转移至含有200mg/l特美汀(timentin)和3mg/l潮霉素b(hygromycinb)的rim生根培养基(1/2ms基本培养基添加0.05mg/liba和0.02mg/lnaa)中，直至诱导出不定根，得到过量表达pagknat2/6b的转基因杨树，分别选择转基因杨树(oe5、oe7)植株。

利用转基因技术获得的转基因杨树(oe5、oe7)植株，相比于未转基因的杨树(ck)表现出叶片小、叶片皱缩、叶脉紊乱、叶片卷曲、褶皱的叶型表型，并随着种植时间的增长，oe5、oe7的叶片表现出不易衰老与脱落的表型(图3-2)。图7，从两年生转基因杨树(oe5、oe7)植株与未转基因的杨树(ck)平茬后表型的比较图可以看出，转基因杨树(oe5、oe7)植株叶型相对稳定。

实验结果如图2-1和图2-2所示，图2-1是本发明过量表达pagknat2/6b的转基因杨树的转录水平半定量检测图(图中actin是肌动蛋白)，图2-2是本发明过量表达pagknat2/6b的转基因杨树的转录水平实时定量检测图，用1个月左右的组培苗作材料，提取rna并进行反转录，用sybrpremixextaqtmkit(takara)试剂盒，以actin基因为内参，用lightcycler480(roche)实时定量仪器完成)，图中柱形图显示pagknat2/6b基因分别在未转基因杨树(84k)和转基因杨树(oe5、oe7)(为过量表达pagknat2/6b的转基因杨树的2个株系)中的表达量。从图2-2可以看出，与未转基因杨树(84k)相比，转基因杨树(oe5、oe7)的mrna的水平明显更高；如图3-1所示，是未转基因杨树(84k)与本发明转基因杨树(oe5、oe7)土培苗生长第一个月的表型比较图；图3-2是未转基因杨树(84k)与本发明转基因杨树(oe5、oe7)土培苗生长第三个月的表型比较图；采用普通的相机拍照。从图3-1和图3-2可以看出，与未转基因银腺杨(84k)相比，转基因杨树(oe5、oe7)的叶片小、叶片皱缩、叶脉紊乱，说明pagknat2/6b基因是调控杨树叶片发育的关键调节基因；如图4-1所示，是一个月土培苗的未转基因杨树(84k)与本发明转基因杨树(oe5、oe7)叶片图(从左至右为顶部至底部)，如图4-2所示，是一个月土培苗的未转基因杨树(84k)与本发明转基因杨树(oe5、oe7)叶片大小统计图，从图4-1和图4-2可以看出，转基因杨树(oe5、oe7)叶片变小，皱折增多；如图5-1所示，是本发明过量表达pagknat2/6b的转基因杨树与未转基因杨树，一个月土培苗第4片展开叶叶片透明图(图中的白棒为3厘米)，如图5-2所示，是本发明过量表达pagknat2/6b的转基因杨树与未转基因杨树，一个月土培苗第4叶片背-腹面细胞大小比较图，从图5-1和图5-2可以看出，转基因杨树(oe5、oe7)叶片细胞变小增多；如图6所示，是未转基因杨树(84k)与本发明转基因杨树(oe5、oe7)土培苗第一个月与第4片叶子组织切片比较图；注：xy，xylem(木质部)；ph，phloem(韧皮部)，从图6可以看出，转基因杨树(oe5、oe7)叶片变小；如图7所示，是未转基因杨树(84k)与本发明转基因杨树(oe5、oe7)两年生土培苗平茬后表型比较图，从图7可以看出，转基因杨树(oe5、oe7)植株叶型相对稳定。

本发明通过将pagknat2/6b基因转入84k杨树，过量表达pagknat2/6b的转基因杨树与野生型比较，出现明显的叶片小、叶片皱缩、叶脉紊乱、叶片卷曲、褶皱的叶型，说明pagknat2/6b基因是调控杨树叶片发育的关键调节基因，在林木基因工程领域和无性系林业领域有重要应用价值。

序列表

<110>中国林业科学研究院林业研究所

<120>一种调控杨树叶型发育基因及其应用

<160>6

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>930

<212>dna

<213>pagknat2/6b

<400>1

atggacggaacgtacggtctgcactcaacggtggcggactactcagacaaggcgttgatg60

tcgccggaggattttattttacaatcggagtaccagagcttgctgtcttcagaaactctt120

cggctgcggattccgattcttggatccgaagagttgctttcagaggcggcttcgatcaga180

acagaagaagatatgtccgctttgatcaaagccaaaattgcctcgcatccttgctatcct240

cgtttactcgaggcttatatcgattgccagaaggtaggggcgcctccggggatagcgtgt300

ttcttggatgaaatccggcgagaaaacgaccttttcaagcaaggcgctgtctccacgtac360

tggggagctgatcccgagctagacgagttcatggaaacctactgtgatttgttggtgaag420

tataaatctgatcttgaaaggcctttagatgaagcaacaaccttcttgaacaagattgaa480

atgcagcttcgaaatctctgcaccggtgcctccatcagaagcctctctgatgaaggtgcg540

gcatcttcagatgaggagttaagtgtaggggagttggatatgcatgaagctcaaccaagc600

ggtgaagaccgagagcttaaagataaacttctccgcaggtttggaggtcatattggtacg660

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caacgtaagcgccactggaaaccatctgagaacctgcaatttgctgttatggataatctt900

tctgggcagttctttacagaagacgactga930

<210>2

<211>238

<212>prt

<213>pagknat2/6b的表达蛋白(未知)

<400>2

metaspglythrtyrglyleuhisserthrvalalaasptyrserasp

151015

lysalaleumetserprogluasppheileleuglnserglutyrgln

202530

serleuleusersergluthrleuargleuargileproileleugly

354045

serglugluleuleuserglualaalaserileargthrglugluasp

505560

metseralaleuilelysalalysilealaserhisprocystyrpro

65707580

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115120125

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130135140

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180185190

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210215220

pheserlyslyslyslyslysglylysleuprolysglyser

225230235

<210>3

<211>56

<212>dna

<213>pagknat2/6borf正向引物(人工序列)

<400>3

ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggctgcatggacggaacgtacggtctgcact56

<210>4

<211>57

<212>dna

<213>pagknat2/6borf反向引物(人工序列)

<400>4

ggggaccactttgtacaagaaagctgggtatcagtcgtcttctgtaaagaactgccc57

<210>5

<211>5585

<212>dna

<213>入门载体pdnor207(人工序列)

<400>5

ctttcctgcgttatcccctgattctgtggataaccgtattaccgctagccaggaagagtt60

tgtagaaacgcaaaaaggccatccgtcaggatggccttctgcttagtttgatgcctggca120

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